一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
【专利摘要】本发明公开了一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步骤：步骤1）制备反应液；步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;步骤3）提取临床分离单核细胞增生李斯特氏菌，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测单核细胞增生李斯特氏菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。
【专利说明】一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及疾病检测【技术领域】，具体的说，是一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。
【背景技术】
[0002]单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种常见的土壤细菌,它也是某些食物(主要是鲜奶产品)中的一种污染物，能引起严重食物中毒。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起败血症、脑膜炎和单核细胞增多。食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4°C的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。急需特异性和敏感度高的快速诊断试剂。
[0003]环介导等温扩增技术是由日本荣研(EIKEN)株式会社开发的高特异性敏感度的核酸检测系统，无须昂贵的设备，已经成为核酸快速检测法的良好手段，本发明结合环介导等温扩增技术，设计针对单核增生李斯特菌特异性基因序列的一对外引物(L-F3和L-B3)和一对内引物(L-FIP和L-BIP)进行环介导等温扩增。
【发明内容】
[0004]本发明公开了 一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，提高了它的检测和诊断效率。
[0005]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步骤:
步骤I)制备反应液
反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM
4M甜菜碱IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
内引物
L-FIP40umol
L-BIP40umol
外引物
L-F35umol
L-B35umol
标本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;
步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性；
步骤3)提取临床分离单 核细胞增生李斯特氏菌，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。
[0006]进一步的，所述外引物L-F3 的序列为 GCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT。
[0007]进一步的，所述外弓丨物L-B3的序列为GGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT。
进一步的，所述内引物L-FIP的序列为 GGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCT-ATTTCAAATAAACTTGACGGCCo
[0008]进一步的，所述内引物L-BIP 的序列为 TGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC-CTATAACGTGAATGTTAATGAACC。
[0009]进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
[0010]本发明的有益效果是:
本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测单核细胞增生李斯特氏菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。
【具体实施方式】
[0011]下面将结合实施例，来详细说明本发明。 [0012]一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步骤:
步骤I)制备反应液
反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM
4M甜菜碱IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
内引物
L-FIP40umol
L-BIP40umol
外引物
L-F35umol
L-B35umol
标本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul。
[0013]选取单核细胞增生李斯特氏菌特异性基因从F基因(基因序列来源美国国立生物技术信息中心-NCBI)，设计引物序列。所述外引物L-F3的序列为GCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT，所述外引物 L-B3 的序列为 GGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT，所述内引物L-FIP的序列为
GGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCT-AITTCAAATAAACTTGACGGCC，所述内引物 L-BIP 的序列为 TGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC-CTATAACGTGAATGTTAATGAACC。
[0014]进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
[0015]步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性；
步骤3)提取临床分离单核细胞增生李斯特氏菌2株，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。结果显示:2株单核细胞增生李斯特氏菌每次均为阳性，其余菌种为阴性。
[0016]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的`保护范围之内。
【权利要求】
1.一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤I)制备反应液 反应液组成及含量为 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM4M甜菜碱IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 内引物 L-FIP40umol L-BIP40umol 外引物 L-F35umol L-B35umol标本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul; 步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性； 步骤3)提取临床分离单核细胞增生李斯特氏菌，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。
2.根据权利要求1所述的高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于:所述外引物L-F3的序列为GCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT。
3.根据权利要求2所述的高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于:所述外引物L-B3的序列为GGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT。
4.根据权利要求3所述的高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于:所述内引物L-FIP的序列为
GGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCT-ATTTCAAATAAACTTGACGGCCo
5.根据权利要求4所述的高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于:所述内引物 L-BIP 的序列为 TGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC-CTATAACGTGAATGTTAATGAACC0
6.根据权利要求5所述的高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于:所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
【文档编号】C12Q1/04GK103725763SQ201210385668
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月12日 优先权日:2012年10月12日
【发明者】金京勋 申请人:苏州四同医药科技有限公司