用于检测冬生疫霉的引物对和探针及其检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测冬生疫霉的引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示。本发明进一步提供了检测冬生疫霉的荧光RT-PCR法，其是以样品总DNA为模板，利用上述引物对和探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。该方法可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境快速、准确地检测出冬生疫霉。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对冬生疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测以及进出口安全等方面具有重要意义。
【专利说明】用于检测冬生疫霉的引物对和探针及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种用于检测冬生疫霉的引物对和探针及其检测方法。
【背景技术】
[0002]冬生疫霉(Phytophthora hibernalis Carne)是导致柑橘褐腐疫病的主要病原菌之一，柑橘褐腐疫病在果实采收前、采收后发生均可造成重大的经济损失，尤其是在雨季。该病菌在澳大利亚西部的柑橘果实上首次被发现，随后在欧洲、美洲及非洲等许多国家均有报道。该病菌主要侵染柑橘属植物的果实和枝叶，还可侵染杜鹃、玫瑰、红花、芝麻、番茄、苹果等多种植物，导致植物出现枯萎、根腐或溃疡症状。
[0003]因此开发冬生疫霉的早期快速检测技术，对相关植物生产中的病害防控和无公害化具有重要的意义。
[0004]近年来，实时荧光定量PCR (荧光RT-PCR)技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与预警，然而国内外鲜有利用荧光RT-PCR技术检测冬生疫霉方面的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于检测冬生疫霉的引物对和探针。
[0006]本发明的另一目的是提供用于检测冬生疫霉的荧光RT-PCR法。
[0007]为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测冬生疫霉的引物对，其包括上游引物 PH-F:5，-CGACTTGCCACCGGGA-3，(SEQ IDN0.1)和下游引物 PH-R:5’ -AACGGTACTTCTCTTTGCTCGAA-3’ (SEQ ID N0.2)。
[0008]本发明还提供含有上述引物对PH-F和PH-R的用于检测冬生疫霉的试剂盒。
[0009]本发明还提供一种用于检测冬生疫霉的探针，所述探针为:5’-Fl-TTCCACAACCAATTCCAT-Ql-3’ (SEQ ID N0.3)，其中 Fl 为报告荧光基团，Ql 为非荧光性的淬灭基团。优选Fl为FAM荧光染料，Ql为MGB。
[0010]本发明还提供一种检测冬生疫霉的荧光RT-PCR法:以样品DNA为模板，采用引物对PH-F和PH-R以及上述探针进行荧光RT-PCR反应，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
[0011]上述荧光RT-PCR扩增反应中，25yL的反应体系含有成分如下:样品DNAI μ L (0.0005-50ng)，10 X PCR 反应缓冲液(不含 Mg2+) 2.5 μ L, 25mM MgCL2 2.0 μ L, 2.5mMdNTP 2.0yL, 10 μ M引物PH-F I μ L, 10 μ M引物PH-R I μ L, 10 μ M探针 1.5 μ L, 5U/μ L TaqDNA 聚合酶 0.3 μ L，ddH20 13.7 μ L。
[0012]荧光RT-PCR扩增反应过程中使用的退火温度为60°C。优选地，反应程序为:950C 3min ；95°C 10s，60。。30s,40 个循环。
[0013]本发明还提供用于检测冬生疫霉的试剂盒，其包括引物对PH-F和PH-R以及上述探针。
[0014]优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
[0015]更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0016]本发明在测序分析冬生疫霉及其近似种和近缘种的ITS序列的基础上，分别设计用于检测冬生疫霉的引物对和荧光探针。该探针与普通的Taqman探针不同之处在于3’端采用了非荧光性的淬灭基因，即淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。
[0017]Taqman MGB探针技术，即将报告荧光染料标记在探针的5’端，而3’端采用了非荧光性的淬灭基因，二者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭基团的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对冬生疫霉的检测。
[0018]本发明根据冬生疫霉ITS序列，设计出可快速检测冬生疫霉病菌的特异性引物对和探针，并在此基础上建立了荧光RT-PCR检测法，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境快速、准确地检测出冬生疫霉。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对冬生疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测以及进出口安全等方面具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明实施例4中采用荧光RT-PCR技术检测冬生疫霉的结果示意图，其中，1:冬生疫霉(Phytophthora hibernalis,来源于澳大利亚)；2:冬生疫霉(P.hibernalis,来源于英国);3_4:丁香疫霉(P.syringae) ;5_7:雪松疫霉(P.lateralis)；8-9:栎树粹死病菌(P.ramorum) ；10-11:苜猜疫霉根腐病菌(P.medicaginis) ；12-13:马铃薯绯腐疫霉(P.erythroseptica) ;14_16:栗黑水疫霉(P.cambivora) ;17_18:草莓疫霉(P.fragariae) ; 19-20:树霉疫霉(P.fragariae var.rubi) ；21:大豆疫霉(P.sojae) ；22:棕榈疫霉(P.palmivora) ；23:辣椒霜霉(P.capsici) ；24:康沃尔疫霉(P.kernoviae) ；25:空白对照。
[0020]图2是本发明实施例5中荧光RT-PCR检测方法的灵敏度实验结果示意图，其中，1_8 的 DNA 浓度分别为 50ng/ μ L、5ng/ μ L、0.5ng/ μ L、0.05ng/ μ L、0.005ng/ μ L、
0.0005ng/y L、0.00005ng/y L 和 0.000005ng/μ L, 9 为空白对照。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0022]以下实施例均按照常规实验条件，如SambiOOk等分子克隆实验手册(NewYork:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),或 Draper 等(Blackwell 科学出版社，1988)，郑小波(疫霉菌及其研究技术，中国农业出版社，1997)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。[0023]实施例1引物对及探针的设计与合成
[0024]根据冬生疫霉ITS序列，采用探针设计软件Express 3.0设计引物对及探针，引物对序列为:
[0025]PH-F (正向引物):5’ -CGACTTGCCACCGGGA-3’
[0026]PH-R (反向引物):5’ -AACGGTACTTCTCTTTGCTCGAA-3’
[0027]探针的序列为:5’-F1-TTCCACAACCAATTCCAT-Q1-3';其中，Fl 为 FAM 荧光染料，Ql为非荧光性的淬灭基团MGB。
[0028]上述引物对及探针序列合成由上海基康生物技术有限公司完成。
[0029]实施例2样品总DNA的提取
[0030]包括以下步骤:
[0031]I)采集适量冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)真菌菌丝体或染病果实、叶片，用液氮研成粉末，取0.4g装入1.5mL离心管中。
[0032]2)预热CTAB提取液至65°C，向装有粉末的1.5mL离心管中加入600 μ L预热的CTAB提取液，混匀。
[0033]3)立即置于65°C水浴30min，然后加入5001^氯仿/异戊醇(24:1，体积比)，上下颠倒数次，13000g离心I分钟。
[0034]4)吸取上清液约400 μ L至一个新的2.0ml离心管中，加入500 μ I氯仿/异戊醇(24:1) ,500 μ L CTAB提取液，轻轻混匀，13000g离心I分钟。
[0035]5)取800μ I上清液至一个新的1.5mL离心管中，加入500μ L异丙醇，轻轻混匀，室温放置20min。
[0036]6) 13000g离心2min，去上清，用70%乙醇洗沉淀，室温干燥。
[0037]7)力卩入 50 μ L IXTE 缓冲液(IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，含 20 μ gRNase，pH 值
8.0 )，置于4°C过夜，待DNA溶解后，检测DNA浓度及质量。
[0038]实施例3实时荧光定量PCR (突光RT-PCR)法的建立
[0039]1、荧光RT-PCR反应体系
[0040]以总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，反应体系(总体积25 μ L)为:样品DNAI μ L (0.0005-50ng)，10 X PCR 反应缓冲液(不含 Mg2+) 2.5 μ L, 25mM MgCL2 2.0 μ L, 2.5mMdNTP 2.0yL, 10 μ M引物PH-F I μ L, 10 μ M引物PH-R I μ L, 10 μ M探针 1.5 μ L, 5U/μ L TaqDNA 聚合酶 0.3 μ L，ddH20 13.7 μ L。
[0041]2、实时荧光PCR反应条件
[0042]将样品管放入BIO-RAD公司IQ?5荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应:第I个循环为95°C 3min;然后是95°C 10s,60°C 30s，40个循环。每个循环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线判定结果。
[0043]实施例4冬生疫霉荧光RT-PCR检测法的特异性分析
[0044]以冬生疫霉的总DNA为模板，以冬生疫霉的近似种及近缘种的总DNA为对照，通过荧光RT-PCR检测荧光强度变化。
[0045]试验结果:
[0046]以冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的总DNA为模板，通过实时突光PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，而冬生疫霉的近似种及近缘种，如丁香疫霉(P.syringae)、雪松疫霉(P.lateralis)、栎树粹死病菌(P.ramorum)、苜猜疫霉根腐病菌(P.medicaginis)、马铃薯绯腐疫霉(P.erythroseptica)、栗黑水疫霉(P.cambivora)、草莓疫霉(P.fragariae)、树霉疫霉(P.fragariae var.rubi )、大豆疫霉(P.spjae)、棕榈疫霉(P.palmivora)、辣椒霜霉(P.capsici )、康沃尔疫霉(P.kernoviae)的突光强度没有变化，检测结果如图1所示。
[0047]实施例5冬生疫霉荧光RT-PCR检测法的灵敏度分析
[0048]用超纯水分别稀释冬生疫霉的DNA，进彳了相对灵敏度检测，在25 μ L反应体系中，DNA 分别为 50ng/μ L、5.0ng/μ L、0.5ng/μ L、0.05ng/μ L、0.005ng/μ L、0.0005ng/μ L、0.00005ng/ μ L和0.000005ng/ μ L。检测结果如图2所示，最低检测限为0.0005ng/ μ L。
[0049]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的 基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.用于检测冬生疫霉的引物对，其特征在于，
上游引物 PH-F:5’ -CGACTTGCCACCGGGA-3’，
下游引物 PH-R:5’ -AACGGTACTTCTCTTTGCTCGAA-3’。
2.用于检测冬生疫霉的探针，其特征在于，所述探针为:5’ -F1-TTCCACAACCAATTCCAT-Q1-3'，其中Fl为报告荧光基团，Ql为非荧光性的淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，Fl为FAM，Ql为MGB0
4.检测冬生疫霉的荧光RT-PCR法，其特征在于，以样品DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对以及权利要求2或3所述的探针进行荧光RT-PCR反应，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，25μ L的反应体系含有成分如下:样品DNA I μ L (0.0005-50ng)，10 X PCR 反应缓冲液(不含 Mg2+)2.5 μ L, 25mM MgCL22.0 μ L，2.5mMdNTP 2.0yL, 10 μ M引物PH-F I μ L, 10 μ M引物PH-R I μ L, 10 μ M探针 1.5 μ L, 5U/μ L TaqDNA 聚合酶 0.3 μ L，ddH20 13.7 μ L。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，反应程序为:95°C3min ；95 °C 10s,60°C 30s, 40 个循环。
7.用于检测冬生疫霉的试剂盒，其包括权利要求1所述的引物对以及权利要求2或3所述的探针。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征`在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
10.含有权利要求1所述引物对的用于检测冬生疫霉的试剂盒。
【文档编号】C12N15/11GK103725762SQ201210385102
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月11日 优先权日:2012年10月11日
【发明者】杜洪忠, 吴品珊 申请人:中国检验检疫科学研究院