专利名称：可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种平板流动腔，特别是可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔。
背景技术：
组织工程是根据细胞生物学和工程学的原理，结合种子细胞、生物支架材料和生长因子在体外/体内构建组织和器官，以维持、修复、再生或改善损伤组织和器官功能。复合种子细胞的生物支架材料是组织工程的核心，众多研究已表明基质微拓扑结构、电刺激和剪切力等均可调控细胞的粘附、增殖和分化等生物学功能，可促进种子细胞与支架材料的相互作用，调控细胞中细胞外基质的分泌。目前在组织工程中通常利用一种装置只能实现一种刺激方式。平板流动腔是体外对细胞施加流体剪切力刺激的主要装置。为了对细胞施加电刺激，可在流动腔中插入电极、安装导电玻璃等导电材料等来实现。但是细胞在组织体内很多情况下是同时受到基质微拓扑结构、电刺激和剪切力作用。以骨组织修复为例，骨骼基质形变引起的细胞间隙液流动所形成的流体剪切力是细胞所能感受到的主要应力，可影响多种种子细胞的增殖、分化、矿化等。活体组织器官内普遍存在内源性生理性电场，外源性的电场刺激也用于促进种子细胞增殖、分化以及与支架材料的粘附等。支架材料表面的拓扑结构会改变细胞表面的应力分布，从而改变细胞的形态，影响细胞的增殖、分化、定向、迁移及细胞骨架的排列能力。与此同时，细胞对不同因素刺激的响应并不单纯是单一因素影响的线性叠加，研究中不能仅用单一装置进行单一因素的刺激，需要同时研究多种因素的协同作用。因此，急迫希望有一种装置能同时实现多种因素刺激，以方便观察和研究细胞对多种因素同时刺激的响应。然而目前还未见有流动腔在对细胞施加电和剪切力刺激的同时实现微拓扑结构调控。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种同时对细胞施加电和流体剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔，不仅可以施加多个方向电和流体剪切力刺激，而且可对细胞施加微拓扑结构刺激。为解决上述技术问题，本发明的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔包括三层平板和两层垫片，上平板设置有流体进出口，上垫片设置有导流槽，中平板设置矩形狭缝，下垫片设置有流动小室。培养液由上平板流体进口进入上垫片中三角形导流槽，使得流体充分发散并受到缓冲的作用有效的降低入口的扰流现象。充分发散的培养液由中平板上矩形狭缝进入流体小室。为保证流体流过流动小室时满足层流、二维流动、充分发散的流动，流动小室宽度和长度均应大大于流动小室厚度与放在其中的电极板的厚度之差。为进一步实现多方向的电刺激，所述中平板在位于流动小室上方设有电极板，下平板在位于流动小室下方放置具有微拓扑结构的电极板，流动小室四边分别放置一个电极。下平板上放置的电极板通过在固定于薄片上具有微拓扑结构的二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)膜上表衬石墨烯薄膜获得,石墨烯薄膜两端分别设置连接导线，可以加载电刺激同时施加微拓扑结构刺激，其中薄片由硅片或者玻片制得。此电极可以制备成厚度一致的平板，实现均一的流体剪切力作用；也可以制备成厚度均匀变化的楔形板，实现连续剪切力作用。根据需要微拓扑结构可为微沟槽阵列，也可为三角形、四边形、五边形、六边形或圆柱形等各类形状的微凸台阵列。在进行流动腔实验时在石墨烯薄膜表面接种细胞，或者根据需要对石墨烯薄膜表面进行表衬再接种细胞。中平板上电极板通过胶粘在中平板上，其连接导线通过刻在中平板上的小槽引出，利用密封胶密封。中平板上电极板和流动小室四周电极板均可由石墨烯薄膜或铟锡氧化物导电玻璃或者铟锡氧化物导电膜或者银、金或钼等贵金属板制得。连接流动小室四周电极板的导线铺设在下垫片上刻的小槽，放置好导线后用密封胶密封。平板流动腔通过螺栓或者夹具装配好后，通过聚四氟乙烯导管与储液槽和蠕动泵构成一个的循环流动的体系。储液槽中的液体由蠕动泵泵出后，沿着导管流入平板流动腔，对电极板上的细胞施加剪切力作用，然后流出，沿着流出导管回到储液槽中。剪切力加载模式(连续、振荡或脉冲等)和强度均由蠕动泵控制。工作时，除蠕动泵以外，其他装置都放在培养箱内。通过信号发生器和稳压电源给各对电极或单一电极施加连续、振荡或脉冲等多种作用模式和强度的电刺激。电刺激时可以仅使用一个电极，也可使用一对电极，还可以同时使用多个电极。综上所述，本发明的平板流动腔通过在流动小室六个面安装电极板，且下平板上放置的电极板具有微拓扑结构，对细胞同时实现电和剪切力作用以及微拓扑结构刺激，还可以通过改变下平板上放置的电极板厚度实现均一流体剪切力或连续剪切力作用，这也是本发明提出的关键之一。本发明提供的平板流动腔可根据需求选择不同微拓扑结构，同时施加不同模式和强度电和流体剪切力刺激，所实现的平板流动腔结构简单紧凑，有望在更多组织工程研究中发挥重要作用。用于制备放置在流动小室底部的电极的材料不仅局限于石墨烯薄膜，只要选择的材料可形成微拓扑结构且导电，对细胞无明显毒性即可。为简洁起见，本发明主要以石墨烯薄膜为例加以阐述，其他导电材料也可以采用相同的原理。
图I是本发明提供的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的结构示意图；图2是本发明提供的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的首丨J视图;图3是本发明提供的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的俯视图；图4是本发明提供的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的仰视图；图5是图2所示可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔沿图2中的A-A线的剖视图；图6是图2所示可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔沿图2中的B-B线的剖视4
图7是图2所示可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔沿图2中的C-C线的剖视图；图8是本发明提供的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的流动小室底面电极板的俯视图； 图9是图8所示可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的流动小室底面电极板沿图8中的D-D线的剖视图；图10是本发明第二种实施方式提供的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的流动小室底面电极板的俯视图；图11是图10所示可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的流动小室底面电极板沿图10中的E-E线的剖视图；图12是本发明第三种实施方式提供的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的流动小室底面电极板的剖视图；图13是图12所示可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的流动小室底面电极板的侧视图。其中1_导管；2_上平板；3_上垫片；4_导流槽；5_中平板；6_矩形狭缝；7_电极板；8_导线；9_导线；10_下垫片；11_下平板；12_导线；13_导线；14_电极；15_导线；16-电极板；17_电极；18_流动小室；19_细胞；20_螺栓；21_螺帽；22_薄片；23_PDMS膜；24-石墨烯薄膜；25_导线。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。图I是本发明提供的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的结构示意图，其结构剖视图、俯视图和仰视图分别如图2、图3和图4所示，图5、图6和图7分别是图2中A-A线、B-B线和C-C线的剖视图。实施例I :由图I、图2、图3和图4可知，本发明的可实施多方向电刺激的平板流动腔由三层平板和两层垫片叠加组成，上平板2设置有流体进出口，上垫片3设置有导流槽4，中平板5设置矩形狭缝6，下垫片10设置有流动小室18。流动小室18宽度和长度均应大大于流动小室18厚度与放在其中的电极板16的厚度之差。上平板2、中平板5和下平板11可由聚碳酸酯、树脂玻璃或金属等材料制备，上垫片3和下垫片10可由硅树脂等制备。如图5、图6和图7可知，培养液由上平板2上导管I进入上垫片3中三角形导流槽4，使得流体充分发散并受到缓冲的作用有效的降低入口的扰流现象。充分发散的培养液由中平板5上矩形狭缝6进入流动小室18。所述中平板5在位于流动小室18上方设有电极板7。电极板16放置在下平板11上，位于流动小室18下方。流动小室18四边分别放置一对电极14和电极17。在进行流动腔实验时在电极板16表面种细胞19,或者根据实验的需要对电极板16表面进行表衬再种细胞19。电极板7、电极14和电极17由石墨烯薄膜或者铟锡氧化物导电玻璃或者铟锡氧化物导电膜或者银、金或钼等贵金属板制得。中平板5上电极板7通过胶粘连接，电极板7的连接导线通过刻在中平板5上的小槽引出，并通过密封胶密封。下垫片10上刻有小槽，用于铺设连接电极板16、电极14和电极17的导线8和导线25、导线13和导线15、导线9和导线12，导线放入小槽后再用密封胶密封。上平板2、中平板5、下平板11、上垫片3和下垫片10同一位置处加工有通孔，用于装配螺栓20，通过螺帽21压紧装配。螺栓20的个数可以根据平板流动腔的大小对称设置4-40个。在平板流动腔尺寸较小时也可以直接用夹具压紧装配，不设置螺栓20连接。图8是本发明提供的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的流动小室底面电极板16的俯视图，图9是图8所示流动小室底面电极板16沿图8中的D-D线的剖视图。图中电极板16包括薄片22、PDMS膜23和石墨烯薄膜24，下面将具体介绍其制作过程。首先按常规方法在厚为O. 4 O. 7mm直径为25 200mm的硅晶片上形成微沟槽阵列，该微沟槽宽和深分别为IOOnm 20μηι和IOOnm 100 μ m,微沟槽间间距为IOOnm 20 μ m。通过如下步骤制备PDMS膜23 (I)将Sylgardl84中PDMS预聚体与固化剂按10 I的质量比称取，充分混合后放于真空干燥箱中抽真空20 30min,直至气泡消失。(2)将混合好的PDMS混合液倾倒于放置在塑料培养皿中的娃晶片表面，形成厚100 1000 μ m PDMS膜，水平放置于真空干燥箱内保持负压抽吸lOmin，使胶体与硅晶片模板表面结构充分接触，并除去残留气泡。(3)根据膜厚度将培养皿水平放置于鼓风干燥箱中80°C烘烤I 2h。固化后冷却至室温，剥离得到表面微沟化的PDMS膜，并用手术刀切割至所需形状。(4)将PDMS膜依次置于75%酒精和去离子水中分别超声清洗20min，90°C鼓风干燥箱干燥Ih。(5)将PDMS膜用lmol/L的稀盐酸浸泡2h，提高表面亲水性。去离子水清洗，干燥后备用。接着采用液相超声剥离石墨方法制备浓度约为O. 02 I. Omg/ml的石墨烯分散液(I)将石墨粉加入到N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)溶剂中，用超声细胞粉碎机处理I 2h (550 650W，5s开，5s关)，静置一晚。(2)吸取上层液体滴入离心管中，5000rpm离心30min，收集上层4/5液体。(3)所得液体7000rpm再次离心30min，收集上层澄清液体，得到清亮透明的深黑色石墨烯分散液。然后采用旋涂法(spin coating)在PDMS膜23上形成石墨烯薄膜24 (I)用硅片或者玻片制备薄片22，将PDMS膜23固定在薄片22上，在膜中心位置滴加O. I I. Oml石墨烯分散液。(2)静置5s，打开旋涂仪，转速IOOOrmp下旋涂10s，然后调节转速为3000rmp旋涂30so(3)放置于真空干燥箱中干燥，在PDMS膜23上形成厚I 50nm的石墨烯薄膜24。最后在制备好的电极板16两端分别安装导线8和导线25，在研究中可将电极板16与电极板7作为一对电极使用，也可以作为单一电极使用。与电极板7联合使用时,将导线8或导线25中一个或者同时连接电源一极；作为单一电极使用时，导线8和导线25分别连接电源的两极，让电流通过电极板16对细胞19产生电刺激。实施例2 本发明电极板16上的微拓扑结构不限于实施例I提供的微沟槽，还可以在硅晶片 上形成三角形、四边形、五边形、六边形或圆柱形等各类形状的微凸台阵列。以正方形凸台为例，图10是可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的流动小室底面电极板的俯视图，图11是图10所示可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔的流动小室底面电极板沿图10中的E-E线的剖视图。为获得如图的电极板，可先在硅晶片上形成正方形微凸台阵列，该正方形微凸台边长为IOOnm 20 μ m,高为IOOnm 100 μ m,微凸台间间距为IOOnm 20 μ m。依照此方法也可以形成其他规则或不规则图形的微凸台阵列。而其他方法和结构均与实施例I相同。实施例3 本发明电极板16可以制备成厚度一致的平板，实现均一的流体剪切力作用。电极板16也可以制备成厚度均匀变化的楔形板，实现连续剪切力作用。图12是厚度均匀变化的电极板16的剖视图，图13是图12所示底面电极板16的侧视图。在制备厚度均匀变化的电极板16时可保持PDMS膜23厚度均一，将薄片22制成5 60°倾斜度的楔形，也可保持薄片22厚度均一，将PDMS膜23制成5 60°倾斜度的楔形。为方便加工，优选保持PDMS膜23厚度均一，将薄片22制成5 60°倾斜度的楔形。而其他方法和结构均与实施例I或实施例2相同。本发明提供的平板流动腔的使用方法如下(I)根据研究需要选择所需微拓扑结构的电极板16，在电极板16上接种细胞19，若接种细胞19需要可对电极板16表面先进行表衬再种细胞19。(2)将接种好细胞19的电极板16放入流动小室18后，通过螺栓或者夹具装配好平板流动腔。(3)利用聚四氟乙烯导管将流动腔、储液槽和蠕动泵连接成一个循环流动的系统。(4)根据研究需要选择电极板，将电极板导线和电源连接。(5)将蠕动泵、信号发生器和稳压电源以外的其他装置都放入培养箱内。(6)通过蠕动泵设置剪切力加载模式(连续、振荡或脉冲等)和强度，通过信号发生器和稳压电源设置电刺激作用模式(连续、脉冲等)和强度。(7)开启蠕动泵、信号发生器和稳压电源。储液槽中的液体由蠕动泵泵出后，沿着导管流入平板流动腔，对电极板16上的细胞19施加剪切力作用，然后流出，沿着流出导管回到储液槽中。若仅需要三种刺激方式中的一种或两种，也可仅开启所需的设备。当不需要施加微拓扑结构刺激时，可用普通载玻片代替电极板16。(8)刺激作用结束后关闭蠕动泵、信号发生器和稳压电源。本发明提供的平板流动腔通过在流动小室六个面安装电极板，实现对细胞施加不同模式和强度电和流体剪切力作用，在流动小室底面电极板表面形成微拓扑结构同时考察基底微拓扑结构对细胞生物学特性的影响，还可以通过改变流动小室底面电极板厚度实现均一流体剪切力和连续剪切力作用。与现有技术相比，本发明提供的平板流动腔具有如下效果
(I)本发明提供的流动腔可对细胞施加剪切力刺激、电刺激和微拓扑结构刺激中的一种、两种和三种，有利于研究和观察细胞对多种因素联合刺激的响应，以实现加速组织修复速度和提高组织修复质量。相对于现有刺激方式，可以在一个结构紧凑的装置内同时实现多种因素刺激，考察多因素刺激的协同作用效果。(2)本发明提供的流动腔方便同时对细胞施加剪切力刺激、电刺激和微拓扑结构刺激，更易模拟细胞在体内的微环境。现有装置通常只能实现一种或两种因素刺激，与细胞在体内微环境差异较大。(3)本发明提供的流动腔中每一种刺激因素均可实现多种模式和强度。其中，剪切力加载模式和强度可由蠕动泵控；电极刺激模式和强度可由信号发生器和稳压电源控制，且可同时使用多个电极实现多方向电刺激；微拓扑结构可以是微沟槽阵列，也可是三角形、四边形、五边形或六边形微凸台阵列，还可是圆柱形微凸台阵列等多种拓扑结构。现有流动腔装置基本不能实现微拓扑结构刺激，且剪切力和电刺激的形式较单一。正是由于这些综合因素，使得本发明所提供的流动腔相比以往的平板流动腔有独特的优势。
权利要求
1.一种可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔，由三层平板和两层垫片叠加组成，上平板设置有流体进出口，上垫片设置有导流槽，中平板设置矩形狭缝，下垫片设置有流动小室，流动小室六面均设有电极板，其特征在于所述位于流动小室(18)下方的电极板(16)包括薄片(22)、PDMS膜(23)和石墨烯薄膜(24)，PDMS膜(23)固定在具有不同微拓扑结构的薄片(22)上，石墨烯薄膜(24)是通过旋涂在PDMS膜(23)表面上而形成的，电极板(16)两端分别设置有导线(8)和导线(25)。
2.根据权利要求I所述的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔，其特征在于所述薄片(22)上的微拓扑结构是微沟槽阵列，该微沟槽的和深分别为IOOnm 20 μ m和IOOnm 100 μ m,微沟槽间间距为IOOnm 20 μ m。
3.根据权利要求I所述的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔，其特征在于所述薄片(22)上的微拓扑结构是三角形、四边形、五边形或六边形微凸台阵列，该微凸台各边边长为IOOnm 20 μ m,高为IOOnm 100 μ m,微凸台间间距为IOOnm 20 μ m0
4.根据权利要求I所述的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔，其特征在于所述薄片(22)上的微拓扑结构是圆柱形微凸台阵列，该微凸台直径为IOOnm 20 μ m,高为IOOnm 100 μ m,微凸台间间距为IOOnm 20 μ m。
5.根据权利要求I所述的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔，其特征在于所述电极板(16)为厚度一致的平板或厚度均匀变化的楔形板，在制备厚度均匀变化的电极板(16)时可保持PDMS膜(23)厚度均一，将薄片(22)制成5 60°倾斜度的楔形；或保持薄片(22)厚度均一，将PDMS膜(23)制成5 60°倾斜度的楔形。
6.根据权利要求I所述的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔，其特征在于所述导线(8)和导线(25)之一或两者同时连接电源一极，将电极板(16)与电极板(X)作为一对电极使用。
7.根据权利要求I所述的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔，其特征在于所述导线(8)和导线(25)分别连接电源两极，将电极板(16)单独作为一个电极使用，使电流通过电极板(16)对细胞(19)产生电刺激。
8.根据权利要求I所述的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔，其特征在于所述电极板(7)、电极(14)和电极(17)由石墨烯薄膜或者铟锡氧化物导电玻璃或者铟锡氧化物导电膜或者银、金或钼贵金属板制得。
9.根据权利要求I所述的可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔，其特征在于所述薄片(22)由硅片或者玻片制得。
全文摘要
本发明公开了一种可施加电和剪切力刺激的具有微拓扑结构的平板流动腔，由三层平板和两层垫片叠加组成，上平板(2)设置有流体进出口，上垫片(3)设置有导流槽(4)，中平板(5)设置矩形狭缝(6)，下垫片(10)设置有流动小室(18)，中平板(5)在位于流动小室(18)上方设有电极板(7)，下平板(11)在位于流动小室(18)下方放置电极板(16)，流动小室(18)四边分别放置一对电极(14)和电极(17)，电极板(16)由薄片(22)、PDMS膜(23)和石墨烯薄膜(24)组成，且在表面有微拓扑结构，在对细胞(19)施加不同模式和强度电和剪切力刺激的同时，实现对细胞(19)进行微拓扑结构调控，该装置结构简单紧凑，且可靠。
文档编号C12M1/42GK102936567SQ20121041790
公开日2013年2月20日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者吕永钢, 董单娟, 邹杨 申请人:重庆大学