专利名称：一种(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法
技术领域：
本发明涉及一种(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法。
背景技术：
⑶-4-氯-3-羟基丁酸乙酯是制备羟甲基戊二酰CoA (HMG-CoA)还原酶抑制剂如他汀类药物的关键手性中间体。他汀类药物是目前世界上最为畅销的降胆固醇和降血脂药物，也是销售额最高的一类药物。因此，作为他汀类药物关键手性中间体的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯具有较高的需求量和广泛的应用范围。 目前，利用还原法生产4-氯-3-羰基丁酸乙酯的方法可以分为化学法和生物法，其中生物法以其所具有的反应条件温和、立体专一性强、转化率高等特点被广泛地研究和应用。中国发明专利申请例如申请号200810124754. 2,201010213724. 6,201110225388. I等公开了数种酮还原酶生产(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，然而这些方法的酶和辅因子用量较高，并需要添加葡萄糖作为氢供体。其底物浓度虽然可以达到30%，但是必须添加大量有机溶剂形成两相体系，并且需要分批补料加入底物，操作繁琐，安全性不好。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下一种(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯为底物，使该底物在生物催化剂、辅因子及氢供体的存在下发生不对称还原反应生成(S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯，其特征在于所述生物催化剂为重组酮还原酶，该酮还原酶的制备方法为将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35 40°C下活化8 12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35 40°C下振荡培养，培养至0D_值达到O. 6 O. 8时，加入诱导剂，于25 33°C下继续培养8 12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8 12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-10°C _25°C，然后再冻干24 48小时，即得冻干粉状的重组酮还原酶；所述的氢供体为异丙醇，所述不对称还原反应在pH为7. O 9. O的水相缓冲液和甲苯的混合体系中进行，其中，水相缓冲液与甲苯的体积比为4 20 I。根据本发明的进一步实施方案反应起始时的反应体系中，底物的浓度为10% 40% (w/v)，重组酮还原酶的用量为底物质量的O. 5% 2.0% (w/w)，异丙醇的物质的量为底物的物质的量的I. 05 I. 2倍，辅因子的用量为底物质量的O. 02% O. 1% (w/w)。根据一个优选方面，反应起始时的反应体系中，底物的浓度为31% 40% (w/v)。进一步地，所述的诱导剂可以为异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，乳糖等，其中优选异丙基_ β -D-硫代半乳糖苷。
进一步地，所述的辅因子可以为NAD/NADH或NADP/NADPH，其中更优选NADP/NADPH0
根据本发明，所述的水相缓冲液可以为磷酸盐缓冲液或Tri-HCl缓冲液，其中更优选磷酸盐缓冲液。根据一个具体方面，所述的水相缓冲液为磷酸氢盐、磷酸二氢盐和水配制而成的磷酸盐缓冲液，磷酸氢盐与磷酸二氢盐的总浓度为10 200mM。 优选地，所述水相缓冲液与甲苯的体积比为4 10 I，更优选为4 6 I。根据本发明的一个具体方面，所述制备方法的实施过程如下在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液或形成所述水相缓冲液所需要的成分，然后依次加入甲苯、异丙醇、底物、重组酮还原酶以及辅因子，于温度25V 45°C下搅拌反应，利用HPLC-MS方法或气相色谱方法检测反应进程，至转化率达到80% 100%，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯产品。优选地，至转化率大于99%时，方加入乙酸乙酯进行萃取。通常在所述反应条件下，反应24h后，转化率即达到99%以上。通过该实施过程获得的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯产品已经达到应用的要求，无需再进一步纯化。根据本发明，所用的原料4-氯-3-羰基丁酸乙酯、含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落及其它使用到的原料均可商购获得。此外，本发明中所述的重组酮还原酶，由于本申请人有对应的商品在销售，它人在实施本发明方法时可以按照本发明所述方法制备或购买。本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势本发明方法通过采用特定的重组酮还原酶，解决了传统生物法中有机溶剂甲苯加入过多、催化效率低以及成本高的问题。该方法反应条件温和，反应效率高，操作简便，特别是，反应底物的浓度可以提高至40%，大大提高了制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的效率和降低了反应的成本。
具体实施例方式以下提供的(S)-4_氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，是在pH为7. O 9. O的磷酸盐缓冲液中，加入重组酮还原酶作为生物催化剂，采用少量甲苯作为底物分散剂，在辅因子NADPH的存在下，不对称还原浓度为35% 40% (w/v)的4-氯-3-羰基丁酸乙酯，加入I. 2至I. 5当量的异丙醇作为氢供体，在24小时左右，以大于99%的转化率，生成目的产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，其反应式如下所示
权利要求
1.一种(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯为底物，使该底物在生物催化剂、辅因子及氢供体的存在下发生不对称还原反应生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，其特征在于所述生物催化剂为重组酮还原酶，该酮还原酶的制备方法为将含有酮还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35 40°C下活化8 12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35 40°C下振荡培养，培养至OD6tltl值达到O. 6^0. 8时，加入诱导剂，于25 33°C下继续培养8 12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8 12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-10°C '25°C，然后再冻干2Γ48小时，即得冻干粉状的重组酮还原酶；所述的氢供体为异丙醇，所述不对称还原反应在PH为7. (T9. O的水相缓冲液和甲苯的混合体系中进行，其中，水相缓冲液与甲苯的体积比为4 20:1。
2.根据权利要求I所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于反应起始时的反应体系中，底物的浓度为10°/Γ40% (w/v)，重组酮还原酶的用量为底物质量的0.59T2.0% (w/w)，异丙醇的物质的量为底物的物质的量的1.051.2倍，辅因子的用量为底物质量的O. 029Γ0. 1% (w/w)。
3.根据权利要求2所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于反应起始时的反应体系中，底物的浓度为319T40% (w/v)。
4.根据权利要求I或2或3所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于所述的诱导剂为异丙基_β -D-硫代半乳糖苷。
5.根据权利要求I或2或3所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH。
6.根据权利要求I或2或3所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于所述的水相缓冲液为磷酸氢盐、磷酸二氢盐和水配制而成的磷酸盐缓冲液，磷酸氢盐与磷酸二氢盐的总浓度为1(T200 mM ;或者，所述的水相缓冲液为Tri-HCl缓冲液。
7.根据权利要求I所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于所述水相缓冲液与甲苯的体积比为Γιο: I。
8.根据权利要求7所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于所述水相缓冲液与甲苯的体积比为4飞1。
9.根据权利要求I或2或3或6所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于所述制备方法的实施过程如下在反应容器中加入配制好的所述水相缓冲液或形成所述水相缓冲液所需要的成分，然后依次加入甲苯、异丙醇、底物、重组酮还原酶以及辅因子，于温度25°C 45°C下搅拌反应，利用HPLC-MS方法或气相色谱方法检测反应进程，至转化率达到809^100%，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有机相并蒸发脱去溶剂，即得(S)-4-氯-3-轻基丁酸乙酯广品。
10.根据权利要求9所述的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其特征在于至转化率大于99%时，方加入乙酸乙酯进行萃取。
全文摘要
本发明涉及一种(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物制备方法，其以4-氯-3-羰基丁酸乙酯为底物，使该底物在生物催化剂、辅因子及氢供体的存在下发生不对称还原反应生成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，生物催化剂为重组酮还原酶，氢供体为异丙醇，所述不对称还原反应在pH为7.0~9.0的水相缓冲液和甲苯的混合体系中进行，水相缓冲液与甲苯的体积比为4~20:1。本发明方法解决了传统生物法中需要额外加入辅酶体系、有机溶剂加入过多、催化效率低以及成本高的问题。该方法反应条件温和，反应效率高，操作简便，反应底物的浓度可以提高至40%，大大提高了制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的效率和降低了反应的成本。
文档编号C12N9/02GK102925501SQ201210465009
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者鞠鑫, 唐圆圆 申请人:苏州汉酶生物技术有限公司