专利名称：一种α-熊果苷生产过程中蔗糖磷酸化酶的回收方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，涉及一种α -熊果苷生产过程中蔗糖磷酸化酶的回收方法。
背景技术：
熊果苷是一种氢醌的葡萄糖苷衍生物，首次发现于熊果属的植物叶子中。熊果苷具有镇咳、祛痰、抗炎、抗菌等生理活性，因而被用作镇咳药物和尿道消毒剂等使用。更为重要的是，熊果苷能够抑制酪氨酸酶的活性，从而遏制黑色素的生长，因此可以作为一种美白成分添加于化妆品中。熊果苷有两种异构体α-熊果苷和β_熊果苷。其中，α-熊果苷的结构比β_熊果苷更稳定，美白效果是β_熊果苷10倍以上，并且对表皮细胞的正常生长没有影响，具有稳定、有效、安全的特点，因此α-熊果苷是21世纪最有竞争力的美白添加剂之一。
·
α -熊果苷与β -熊果苷的来源有所不同，β -熊果苷可以通过植物提取、植物细胞培养、有机合成以及糖基转移酶或糖苷酶的转糖基反应或逆水解反应获得。，而α -熊果苷一般只能通过微生物直接转化或或微生物的酶催化转糖基反应获得。但通过微生物直接转化制备熊果苷的产率较低，而糖苷酶的价格昂贵，只适于实验室制备，都不适用于工业化大规模生产α-熊果苷。因而较低成本的获得高酶活的糖苷酶对于生产催化合成α-熊果苷十分必要。专利201110009399. 6公开了一株表达重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌，利用该菌发酵可以生成高酶活的蔗糖磷酸化酶，并且利用该酶催化蔗糖和氢醌进行转糖基反应可以大量生产α-熊果苷，生产成本相对于直接利用糖苷酶低。此外由于整个酶催化反应的条件温和，反应时间短，所以反应结束后，反应液中蔗糖磷酸化酶的酶活仍然较高。因此回收并重复利用蔗糖磷酸化酶，可以进一步降低生产成本。固定化蔗糖磷酸化酶可以重复利用，这可以在一定程度上降低酶的使用成成本较高。但整个酶的固定化成本也比较高,包括酶的分离纯化成本及固定化成本。因此直接利用非固定的即游离的蔗糖磷酸化酶作为催化剂，可有效地省去酶的分离、纯化、固定化等过程，大大降低酶的制备成本。在利用游离的蔗糖磷酸化酶催化合成α-熊果苷的过程中，能否实现非固定化蔗糖磷酸化酶的多次回收利用是降低酶成本的关键，也是游离蔗糖磷酸化酶能否应用于工业化生产α-熊果苷的制约因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种α -熊果苷生产过程中蔗糖磷酸化酶的回收方法，有效地解决游离蔗糖磷酸化酶的回收利用，使得蔗糖磷酸化酶的使用成本显著降低，对于游离蔗糖磷酸化酶应用于酶催化领域有着重大的意义。本发明以蔗糖和氢醌为底物，利用游离蔗糖磷酸化酶粗酶液作为催化剂催化生产α -熊果苷，反应结束后，利用膜分离方法进行游离蔗糖磷酸化酶的回收，再利用回收的蔗糖磷酸化酶进行下一批次的催化反应。本发明中，利用游离的蔗糖磷酸化酶粗酶液作为催化剂催化合成α -熊果苷可以采用现有技术公开的任一种技术方案，作为本发明的最佳实施方式，优选合成过程为加入浓度为20-50% (w/v)的蔗糖，浓度为1-5% (w/v)的氢醌，酶活为100-300 U/mL的蔗糖磷酸化酶粗酶液，反应PH为6-7，反应温度为20-40 0C，轻微搅拌，反应20-30h后，氢醌的转化率可达到90%，更优选合成过程为将浓度为20% (w/v)的蔗糖，浓度为2% (w/v)的氢醌，酶活为200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反应器中，调节pH至6，反应温度为35 V,轻微搅拌，反应24h。。上述合成反应结束后，首先加入浓度为1%_10% (w/v)的稳定添加剂，然后利用陶瓷膜过滤除去不溶性的絮状物质以及一些大分子蛋白，再利用孔径较小的超滤膜进行游离蔗糖磷酸化酶的回收。该超滤回收过程中，α-熊果苷作为滤出液滤出，收集处理后可得合成产物α -熊果苷。本发明所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，蔗糖磷酸化酶的回收率达到95%以上，回收的酶液中残留的反应物以及产物均小于5%。最后利用回收的蔗糖磷酸化酶进行下一批·次的催化合成α -熊果苷，除了不需要另外添加酶液以外，其他反应条件与前一批次相同，这样可以达到反复使用蔗糖磷酸化酶的目的。如此进行5个批次反应后，回收的蔗糖磷酸化酶的活性还可以保持在初始酶活的85%以上。本发明所述蔗糖磷酸化酶为游离的蔗糖磷酸化酶粗酶液，理论上所述的蔗糖磷酸化酶可以来源于多种菌株，为实现更好的回收效果，本发明优先考虑大肠杆菌SP1515，该酶在催化反应结束之后仍然具有较高的酶活力。本发明所述的添加剂为海藻糖、葡聚糖和/或甘露醇，所述添加剂的用量为反应液的1%-10% (w/v)。优选地,所述的添加剂为相当于反应液5% (w/v)的海藻糖、葡聚糖或甘露醇。更优选所述的添加剂为相当于反应液5% (w/v)的海藻糖。本发明所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法中，特别的使用了添加剂来增强蔗糖磷酸化酶的稳定性，使得回收过程中蔗糖磷酸化酶的酶活损失较少。本发明所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法中，所述陶瓷膜的孔径为O. 1-0. 15Mffl，优选为 O. 12Mm。本发明所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法中，所述超滤膜为醋酸纤维膜、混合纤维膜或聚砜膜，优选醋酸纤维膜膜，所述超滤膜的截留分子量为2000-10000Da，优选为5000Dao采用上述技术方案，本发明的有益效果在于本发明首次提出利用膜回收游离蔗糖磷酸化酶，有效地解决游离蔗糖磷酸化酶的回收利用。并通过加入添加剂，增加回收过程中酶的稳定性，提高了酶活的回收率。此外先利用陶瓷膜过滤除去不溶性的絮状物质以及一些大分子蛋白，然后再利用孔径较小的超滤膜进行游离蔗糖磷酸化酶的回收，对于降低膜污染，延长膜的使用寿命，降低生产成本等都具有重大意义，从而使得游离蔗糖磷酸化酶在酶催化领域有很好的应用前景。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例I :
将浓度为20% (w/v)的蔗糖，浓度为I. 6% (w/v)的氢醌，酶活为200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反应器中，调节PH至6，反应温度为25 °C，轻微搅拌，反应24h。在此反应条件下，氢醌的转化率可达到90%。反应结束后，向反应液中加入相当于反应液5% (w/v)的海藻糖并搅拌均匀，先利用膜孔径为O. 的陶瓷膜过滤除去不溶性的絮状物质以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量为5000Da的醋酸纤维膜进行超滤，回收游离的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率达到97%，回收的酶液中残留的反应物以及产物均小于5%。实施例2
将浓度为20% (w/v)的蔗糖，浓度为I. 6% (w/v)的氢醌，酶活为200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反应器中，调节PH至6，反应温度为25 °C，轻微搅拌，反应24h。在此反应条件下，氢醌的转化率可达到90%。
·
反应结束后，向反应液中加入相当于反应液5% (w/v)的海藻糖并搅拌均匀，先利用膜孔径为O. IMffl的陶瓷膜过滤除去不溶性的絮状物质以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量为2000Da的醋酸纤维膜进行超滤，回收游离的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率达到93%，回收的酶液中残留的反应物以及产物均小于5%。实施例3
将浓度为20% (w/v)的蔗糖，浓度为I. 8% (w/v)的氢醌，酶活为200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反应器中，调节PH至6，反应温度为30 °C，轻微搅拌，反应24h。在此反应条件下，氢醌的转化率可达到85%。反应结束后，向反应液中加入相当于反应液5% (w/v)的葡聚糖并搅拌均匀，先利用膜孔径为O. 的陶瓷膜过滤除去不溶性的絮状物质以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量为5000Da的混合纤维膜进行超滤，回收游离的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率达到90%，回收的酶液中残留的反应物以及产物均小于5%。实施例4
将浓度为20% (w/v)的蔗糖，浓度为I. 8% (w/v)的氢醌，酶活为200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反应器中，调节PH至6，反应温度为30 °C，轻微搅拌，反应24h。在此反应条件下，氢醌的转化率可达到85%。反应结束后，向反应液中加入相当于反应液3% (w/v)的葡聚糖并搅拌均匀，先利用膜孔径为O. IMffl的陶瓷膜过滤除去不溶性的絮状物质以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量为IOOOODa的混合纤维膜进行超滤，回收游离的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率达到86%，回收的酶液中残留的反应物以及产物均小于5%。实施例5
将浓度为20% (w/v)的蔗糖，浓度为2% (w/v)的氢醌，酶活为200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反应器中，调节PH至6，反应温度为35 °C，轻微搅拌，反应24h。在此反应条件下，氢醌的转化率可达到81%。反应结束后，向反应液中加入相当于反应液5% (w/v)的甘露醇并搅拌均匀，先利用膜孔径为O. 的陶瓷膜过滤除去不溶性的絮状物质以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量为5000Da的聚砜膜进行超滤，回收游离的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率达到88%，回收的酶液中残留的反应物以及产物均小于5%。实施例6
将浓度为20% (w/v)的蔗糖，浓度为2% (w/v)的氢醌，酶活为200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反应器中，调节PH至6，反应温度为35 °C，轻微搅拌，反应24h。在此反应条件下，氢醌的转化率可达到81%。反应结束后，向反应液中加入相当于反应液3% (w/v)的甘露醇并搅拌均匀，先利用膜孔径为O. 的陶瓷膜过滤除去不溶性的絮状物质以及一些大分子蛋白，然后利用截留分子量为2000Da的聚砜膜进行超滤，回收游离的蔗糖磷酸化酶。蔗糖磷酸化酶的回收率达到84%，回收的酶液中残留的反应物以及产物均小于5%。虽然，上文中已经用一般性说明具体实施方式
及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种α-熊果苷生产过程中蔗糖磷酸化酶的回收方法，以蔗糖和氢醌为底物，利用游离的蔗糖磷酸化酶粗酶液作为催化剂催化合成α-熊果苷，其特征在于合成反应结束后，首先向除去α-熊果苷的反应液中加入添加剂以增加蔗糖磷酸化酶的稳定性，然后利用陶瓷膜过滤除去不溶性的絮状物质以及大分子蛋白，再利用超滤膜进行游离蔗糖磷酸化酶的回收。
2.根据权利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述蔗糖磷酸化酶来源于大肠杆菌spl515。
3.根据权利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述的添加剂为海 藻糖、葡聚糖或甘露醇，所述添加剂的用量为反应液质量体积比的1%-10%。
4.根据权利要求3所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述的添加剂为相当于反应液质量体积比5%的海藻糖、葡聚糖或甘露醇，并搅拌均匀。
5.根据权利要求4所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述的添加剂为相当于反应液质量体积比5%的海藻糖，并搅拌均匀。
6.根据权利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述陶瓷膜的孔径为 O. 1-0. 2Mflio
7.根据权利要求6所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述陶瓷膜的孔径为 O. 15Mm。
8.根据权利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述超滤膜为醋酸纤维膜、混合纤维膜或聚砜膜。
9.根据权利要求I所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述超滤膜为醋酸纤维膜。
10.根据权利要求1-9任一项所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，其特征在于，所述超滤膜的截留分子量为2000-10000Da。
全文摘要
本发明提供了一种α-熊果苷生产过程中蔗糖磷酸化酶的回收方法，所述α-熊果苷生产过程以蔗糖和氢醌为底物，利用游离的蔗糖磷酸化酶粗酶液作为催化剂催化合成α-熊果苷。反应结束后，首先向反应液中加入一定浓度的添加剂以提高其稳定性，然后利用陶瓷膜过滤除去不溶性的絮状物质以及一些大分子蛋白，再利用孔径较小的超滤膜进行游离蔗糖磷酸化酶的回收，最后利用回收的蔗糖磷酸化酶进行下一批次的催化反应。反复操作，达到重复利用蔗糖磷酸化酶的目的。本发明首次提出蔗糖磷酸化酶的回收利用，并且该方法对于降低膜污染，延长膜的使用寿命，降低生产成本等都具有重大意义，从而使得游离蔗糖磷酸化酶在酶催化领域有很好的应用前景。
文档编号C12N9/10GK102925418SQ20121047470
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者姜岷, 万月佳, 贺爱永, 马江锋, 张敏, 陈可泉, 韦萍, 欧阳平凯 申请人:南京工业大学