一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，该方法包括以下步骤：一、肺炎链球菌的培养；二、灭活；三、肺炎链球菌荚膜粗多糖的提取；四、肺炎链球菌荚膜粗多糖的精制。
【专利说明】一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及疫苗的制备，特别涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法。
【背景技术】:
[0002]肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)又名肺炎双球菌,属于链球菌属。肺炎链球菌可引起多种疾病，主要有肺炎、脑膜炎、菌血症、中耳炎等。该菌为条件致病菌，正常人的口腔及鼻咽腔内均可形成带菌状态，在机体抵抗力下降的时候引起疾病，尤其是老年人、2岁以下儿童以及免疫缺陷或免疫力低下的人群。
[0003]保守估计肺炎链球菌在发展中国家每年导致100万以上5岁以下儿童死亡，并且死亡人数中大约20%~25%是该年龄组，甚至在那些很乐意接受有效防止微生物感染理论的发达国家，因肺炎疾病导致的发病率和死亡率也是真实存在的。例如，美国每年大约有500 000例肺炎链球菌性肺炎，50 000例菌血症，3 000例肺炎链球菌脑膜炎，它们共导致40 000人死亡。肺炎链球菌也是中耳炎流行的唯一致病菌，美国每年有2 400万人要看儿科医生，并且比其他传染病使用了更多的抗生素。因此，中耳炎对发达国家的卫生支出与其它传染病相比造成了很大的冲击，估计每年支出要超过50亿美元。
[0004]肺炎链球菌，为革兰氏阳性菌。其表面附着一层荚膜多糖，对菌体起保护作用，是主要的毒力因子。根据该荚膜的组成差异，已鉴定出约90个不同的肺炎球菌血清型，其中只有约20几种能引起人类疾病。科学家把这20几种不同血清型的肺炎球菌的荚膜多糖分别提取出来，制成疫苗用于预防由肺炎链球菌引起的各种疾病。目前，成人肺炎疫苗为23 价肺炎多糖疫苗 ，型别包括 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型，在不同国家和地区可覆盖85%~95%的流行菌株。荚膜多糖为T细胞非依赖性抗原，2岁以下儿童由于免疫系统的不成熟，多糖疫苗只能产生有限的免疫应答，并且没有免疫记忆反应。将荚膜多糖与载体蛋白结合(即所谓的多糖-蛋白结合疫苗)可使多糖抗原由T细胞非依赖性抗原转化成T细胞依赖性抗原，有效激发2岁以下儿童的免疫应答，并形成免疫记忆，目前全球上的肺炎多糖-蛋白结合疫苗的主要有7价、10价、13价等几个产品。但不论哪种肺炎疫苗产品，制备各型别的肺炎多糖均是第一步。
[0005]肺炎球菌荚膜多糖是肺炎疫苗的有效组分，现有制备方法很多，但实验室方法较多，难以应用于工业化，本发明建立了一种肺炎链球菌发酵培养方法和一种肺炎链球菌荚膜多糖(Pn-Ps)制备的工业化新方法。其特征是:①整个多糖提取过程主要以常规的物理、化学分离方法，避免采用以往文章中经常使用的有机试剂抽提(例如冷酚法、酚-氯仿法等)或酶处理去除多糖样品中的杂质的方法，最大程度的减少了对操作者的伤害和环境污染；②整个提取过程简单、易于掌握制备的多糖纯度高。
【发明内容】
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[0006]本发明提供一种肺炎链球菌的发酵培养新工艺，采用该工艺可使培养液中荚膜多糖的产量足够满足疫苗生产的需求。另外，本发明还提供一种肺炎链球菌荚膜多糖的提取工艺，灭活的培养液经离心、膜分离、分段醇沉、分子筛层析等组合技术从肺炎链球菌培养物中提取和纯化Pn-Ps，整个荚膜多糖提取过程避免使用有机试剂抽提或酶处理去除杂质的方法，并且所制备的Pn-Ps的化学组成符合欧洲药典5.0版要求，杂质蛋白、核酸的含量分别在1%以下。
[0007]本发明的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，经过以下步骤:
[0008]一、肺炎链球菌的培养
[0009]二、灭活
[0010]三、肺炎链球菌荚膜粗多糖的提取
[0011]四、肺炎链球菌荚膜粗多糖的精制。
[0012]其中，所述肺炎链球菌的培养，包括，采用羊血平板复苏肺炎链球菌；制备肺炎链球菌种子液；将种 子液接种到发酵罐中经培养获得含有Pn-Ps的培养液。
[0013]其中，所述灭活，包括使用常规方法对活的菌体进行灭活，如使用灭活剂对培养液中的肺炎链球菌进行灭活。
[0014]其中，所述肺炎链球菌荚膜粗多糖的提取，包括，发酵液通过连续流或者杯式离心机离心后，采用中空纤维或深层滤器等方式进一步澄清处理；经过澄清之后的发酵液用IOOkDa超滤膜包进行超滤浓缩；浓缩液经两段醇沉后对沉淀进行复溶。
[0015]其中，肺炎链球菌荚膜粗多糖的精制，包括，复溶后的溶液采用分子筛层析进行精纯；收集的样品溶液采用30kDa超滤膜包脱盐并浓缩，冷冻干燥获得精制多糖。
[0016]其中，所适用的肺炎链球菌菌型包括1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 型(菌株来源于 ATCC)0
[0017]其中，所述肺炎链球菌的培养，优选的步骤是:
[0018]在发酵罐中接种后，pH控制在6.5-8.0，转速50_200r/min，培养开始阶段采用从发酵罐底部通压缩气体，溶氧量控制在1-10%，当发酵液菌浓(0D600nm)达到0.5-1时，改变通气方式为从发酵罐的顶部通压缩气体，溶氧控制在0.01-2%,当发酵液菌浓达到2-2.5时，适量补充碳源，继续培养至菌体生长的平台期后灭活菌体。
[0019]特别优选的步骤是:
[0020]在搅拌式发酵罐中接种后，PH控制在7-7.5，转速70_150r/min，转速培养开始阶段采用从发酵罐底部通压缩气体，溶氧量控制在3-7%，当发酵液菌浓达到0.5-1时，改变通气方式为从发酵罐的顶部通压缩气体，溶氧控制在0.1-1.0%，当发酵液菌浓达到2-2.5时，适量补充碳源，继续培养至菌体生长的平台期后灭活菌体。
[0021]最优选的步骤是:
[0022]在搅拌式发酵罐中接种后，培养温度37°C ±2°C，pH维持在7.2±0.2，转速IOOr/min，转速培养开始阶段采用从发酵罐底部通压缩气体，溶氧量控制在5%，当发酵液菌浓达到0.5-1时，改变通气方式为从发酵罐的顶部通压缩气体，溶氧控制在0.2%，当发酵液菌浓达到2-2.5时，适量补充碳源，继续培养至菌体生长的平台期后灭活菌体。
[0023]以上步骤中，所述向发酵罐中所通入的气体为无菌的压缩空气，或者氧气与氮气或者二氧化碳的组合气体。
[0024]其中，所述肺炎链球菌荚膜粗多糖的提取中，优选的步骤是:
[0025]a、取灭活后的肺炎链球菌培养液，去除菌体、菌体碎片及培养液中的小分子成分，得浓缩液；
[0026]b、浓缩液缓慢加入乙醇至终浓度为15-35%后，2_8°C静置过夜；
[0027]C、所得静置液离心去除沉淀，上清继续加乙醇至终浓度为60-90%后，2_8°C静置过夜；
[0028]d、所得静置液离心收集沉淀，沉淀用水或NaCl溶液复溶后，离心去除沉淀，所得上清即为粗糖溶液；[0029]特别优选的步骤是:
[0030]a、取灭活后的肺炎链球菌培养液，去除菌体、菌体碎片、培养液中颗粒性物质及小分子成分，得浓缩液；
[0031]b、浓缩液缓慢加入乙醇至终浓度为20-30%后，2-8°C静置过夜；
[0032]C、所得静置液离心去除沉淀，上清继续加乙醇至终浓度为75-85%后，2-8°C静置过夜；
[0033]d、所得静置液离心收集沉淀，沉淀用水或NaCl溶液复溶后，离心去除沉淀，所得上清即为粗糖溶液；
[0034]最优选的步骤是:
[0035]a、取灭活的菌体后肺炎链球菌培养液，采用15000g离心30min去除菌体及菌体碎片，上清液进一步采用微滤或深层过滤的方式去除残余的颗粒性物质；澄清后的溶液采用IOOkDa的超滤系统浓缩并去除培养液中的小分子成分，最终得浓缩液；
[0036]b、浓缩液缓慢加入乙醇至终浓度为25%后，2_8°C静置过夜；
[0037]C、所得静置液离心去除沉淀，上清继续加乙醇至终浓度为80%后，2_8°C静置过夜；
[0038]d、所得静置液15000g离心30min收集沉淀，沉淀采用0.2M NaCl溶液复溶，复溶液15000g，离心30min去除沉淀得上清，即为粗多糖溶液。
[0039]其中，所述肺炎链球菌荚膜粗多糖的精制，优选的步骤是:
[0040]所得粗糖溶液，采用分子筛排阻层析分离，按照各个型别的肺炎多糖在欧洲药典
5.0版中的标准收集大分子多糖；分离后的多糖采用30kDa超滤膜包脱盐，再经冷冻干燥后即得肺炎链球菌荚膜多糖。
[0041]特别优选的步骤是:
[0042]对粗多糖溶液的精制采用分子筛排阻层析，分子筛排阻层析所用填料可选:Sepharose CL-2B、 Sepharose CL-4B、 Sephacryl S-200、 Sepharose 4 Fast Flow 或Superdex 200 ;按照各个型别的肺炎多糖在欧洲药典5.0版中的标准收集大分子多糖；分离后的多糖采用30kDa超滤膜包脱盐，再经冷冻干燥后即得肺炎链球菌荚膜多糖。
[0043]对用以上方法制备的肺炎链球菌荚膜多糖进行了生化检测，结果如下:
[0044]生化检测方法:蛋白含量采用1wry法测定，核酸含量采用紫外分光光度法测定，氮含量采用凯氏定氮法测定，磷含量采用钥酸铵法测定，糖醛酸含量采用咔唑-乙醇溶液法测定，胺基己糖含量采用二氨基苯甲醛显色法测定，甲基戊糖含量采用半胱氨酸显色法测定，O-乙酰基含量采用碱性盐酸羟胺-三氯化铁法测定。部分型别精制单价多糖生化检测结果见下表:
[0045]部分单价多糖生化检测结果
【权利要求】
1.一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，该方法包括以下步骤，肺炎链球菌的培养，灭活，肺炎链球菌荚膜粗多糖的提取，肺炎链球菌荚膜粗多糖的精制，其特征在于， 所述肺炎链球菌荚膜粗多糖的提取，方法如下: a、取灭活后的肺炎链球菌培养液，去除菌体、菌体碎片及培养液中的小分子成分，得浓缩液山、浓缩液缓慢加入乙醇至终浓度为15-35%后，2-8°C静置过夜；C、所得静置液离心去除沉淀，上清继续加乙醇至终浓度为60-90%后，2-8°C静置过夜；d、所得静置液离心收集沉淀，沉淀用水或NaCl溶液复溶后，离心去除沉淀，所得上清即为粗糖溶液； 其中，所述肺炎链球菌荚膜粗多糖的精制，方法如下: 所得粗糖溶液，采用分子筛排阻层析分离，按照各个型别的肺炎多糖在欧洲药典5.0版中的标准收集大分子多糖；分离后的多糖采用30kDa超滤膜包脱盐，再经冷冻干燥后即得肺炎链球菌荚膜多糖。
2.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，其中，所述肺炎链球菌荚膜粗多糖的提取，步骤如下: a、取灭活后的肺炎链球菌培养液，去除菌体、菌体碎片、培养液中颗粒性物质及小分子成分，得浓缩液山、浓缩液缓慢加入乙醇至终浓度为20-30%后，2-8°C静置过夜；C、所得静置液离心去除沉淀，上清继续加乙醇至终浓度为75-85%后，2-8°C静置过夜；d、所得静置液离心收集沉淀，沉淀用水或NaCl溶液复溶后，离心去除沉淀，所得上清即为粗糖溶液。
3.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，其中，所述肺炎链球菌荚膜粗多糖的提取，步骤如下: a、取灭活的菌体后肺炎链球菌培养液，采用15000g离心30min去除菌体及菌体碎片，上清液进一步采用微滤或深层过滤的方式去除残余的颗粒性物质；澄清后的溶液采用IOOkDa的超滤系统浓缩并去除培养液中的小分子成分，最终得浓缩液；b、浓缩液缓慢加入乙醇至终浓度为25%后，2-8°C静置过夜；C、所得静置液离心去除沉淀，上清继续加乙醇至终浓度为80%后，2-8°C静置过夜；d、所得静置液15000g离心30min收集沉淀，沉淀采用0.2M NaCl溶液复溶，复溶液15000g，离心30min去除沉淀得上清，即为粗多糖溶液。
4.如权利要求1中所述的制备方法，其中，所述肺炎链球菌荚膜粗多糖的精制采用分子筛排阻层析，其特征在于，分子筛排阻层析所用填料可选:S印harose CL_2B、SepharoseCL-4B、Sephacryl S-200、Sepharose 4 Fast Flow 或 Superdex 200 ;按照各个型别的肺炎多糖在欧洲药典5.0版中的标准收集大分子多糖；分离后的多糖采用30kDa超滤膜包脱盐，再经冷冻干燥后即得肺炎链球菌荚膜多糖。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中，所述肺炎链球菌的培养，步骤如下:搅拌式发酵罐接种后，PH控制在6.5-8.0，转速50-200r/min，培养开始阶段采用从发酵罐底部通压缩气体，溶氧量控制在1_10%，当发酵液菌浓达到0.5-1时，改变通气方式为从发酵罐的顶部通压缩气体，溶氧控制在0.01-2%,当发酵液菌浓达到2-2.5时，适量补充碳源，继续培养至菌体生长的平台期后灭活菌体。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，其中，所述肺炎链球菌的培养，步骤如下:搅拌式发酵罐接种后，PH控制在7-7.5，转速70-150r/min，培养开始阶段采用从发酵罐底部通压缩气体，溶氧量控制在3-7%，当发酵液菌浓达到0.5-1时，改变通气方式为从发酵罐的顶部通压缩气体，溶氧控制在0.1-1.0%，当发酵液菌浓达到2-2.5时，适量补充碳源，继续培养至菌体生长的平台期后灭活菌体。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述肺炎链球菌的培养，步骤如下:搅拌式发酵罐接种后，培养温度37°C ±2°C，pH维持在7.2±0.2，转速100r/min，转速培养开始阶段采用从发酵罐底部通压缩气体，溶氧量控制在5%，当发酵液菌浓达到0.5-1时，改变通气方式为从发酵罐的顶部通压缩气体，溶氧控制在0.2%，当发酵液菌浓达到2-2.5时，适量补充碳源，继续培养至菌体生长的平台期后灭活菌体。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述培养方法所适用的菌型包括1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 型。
9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，向发酵罐中所通入的气体为无菌的压缩空气，或者氧气与氮气或者二氧化碳的组合气体。
【文档编号】C12R1/46GK103833865SQ201210490414
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月26日 优先权日:2012年11月26日
【发明者】金永杰, 孙倩, 李军强, 赵秋敏, 李亚冰, 刘贺军, 曹小丹, 李静, 李剑 申请人:天士力制药集团股份有限公司