一种来源于枝孢霉的脂肪酶、其编码基因序列及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种来源于枝孢霉的脂肪酶、其编码基因序列及其用途。具体而言，本发明涉及一种基因序列，其编码(i)具有SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列；或(i)的第22-464位所示的氨基酸序列；或由(i)所示序列的衍生蛋白序列，或(i)的第22-464位序列的衍生蛋白序列。本发明还涉及包含SEQ?ID?NO:2所示序列的蛋白或SEQ?ID?NO:2所示序列的衍生蛋白。本发明的脂肪酶具有耐有机溶剂、宽广的pH稳定性、较好的温度稳定性等特点，在生物柴油、医药工业、食品加工、油脂化工、环境保护、洗涤剂、纺织、造纸等多个工业领域具有广泛的应用价值。
【专利说明】一种来源于枝孢霉的脂肪酶、其编码基因序列及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程和酶工业领域。更具体而言，本发明涉及一种脂肪酶、其编码基因序列及其用途。
【背景技术】
[0002]脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)即三酰基甘油酰基水解酶，是一类特殊的酯键水解酶，广泛存在于动植物和微生物体中。脂肪酶的基本构成单位为氨基酸，多为一条多肽链，其催化活性由其蛋白质结构决定。脂肪酶可催化疏水性的天然底物油脂变成水溶性的脂肪酸、甘油或单甘脂或甘二酯，在无机溶剂中保持高催化活力和极强的稳定性，在有机溶剂中脂肪酶多会变性或活力下降；但在适宜酶活环境下，脂肪酶对底物具有广谱性或特殊专一性的特点，这促使其被广泛运用于精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、饲料工业、油脂加工、生物柴油、酯键化合物的合成和手性药物合成等领域。
[0003]在油脂加工及油脂化工行业多利用脂肪酶制取脂肪酸和甘油、进行油脂改性、制备特种油脂、提高中性油得率和制备单甘酯等，而且油脂加工或化工行业中不同作业环境，对脂肪酶的温度、催化活性、底物选择性以及有机溶剂耐受性等方面的特性的要求也各不相同。
[0004]在洗涤剂工业中，通过脂肪酶的加入，可提高洗涤剂的去污能力、减少表面活性剂和三聚磷酸钠的用量、减轻环境污染等优点。洗涤行业对脂肪酶特性的要求，包括在洗涤体系中良好的酶催化活性、稳定性、最适PH和pH适用区间需在碱性范围内等。
[0005]在生物柴油工业中，酶法生产生物柴油是生物柴油工业化生产的行之有效的选择。目前其主要瓶颈在于对脂肪酶的热稳定性和对甲醇等短链有机醇的耐受性提出更高的要求(李宇扬，孙佩慧，胡基埂等.中国生物工程杂志.2008.28(10): 136-140)。
[0006]在医药工业上，多用脂肪酶来催化有机合成反应，如合成手性胺、硫氮酮等(Jaeger K.E., Reetz Μ.T.Trends in Biotechnology.1998, 16:39-6403)，这要求脂肪酶具有较强的有机溶剂耐受性、较强的催化活性等。
[0007]对于近年已发现的具有机溶剂稳定性的脂肪酶，通常由耐有机溶剂极端微生物产生，该类微生物由于能适应有机溶剂对细胞的毒性或结构破坏而具有独特的抵抗恶劣环境的能力；因此这类微生物生产的脂肪酶，尤其是胞外酶，多数具有有机溶剂耐受性的特点。尽管如此，但这些脂肪酶的有机溶剂耐受能力不足，脂肪酶的产量较低。
[0008]综上所述，脂肪酶已广泛应用在精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、饲料工业、油脂加工、生物柴油、酯键化合物的合成和手性药物合成等多个行业，不同的工业条件对脂肪酶性质的要求也各不相同，没一种脂肪酶产品能适用所有的工业环境或条件，因而寻找和开发不同性质的产量适宜的脂肪酶产品成为酶工业中的一种共识。
[0009]在酶工业上，酶制剂多源自微生物，脂肪酶也无例外。用于脂肪酶生产的微生物多培养简单、生产周期短、脂肪酶产量大。已知大约有2%的微生物可生产脂肪酶，囊括至少65个属，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属(汪小锋，王俊，杨江科等.微生物发酵生产脂肪酶的研究进展.生物技术通报.[0010]2008, (4):47-53.) O在这些微生物中，研究较多的为芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、地霉属(Geotrichum)、假丝酵母属(Candida)、青霉属(PeniciIlium)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)和毛霉属(Mucor)等。虽然有很多微生物可生产脂肪酶，但在实际使用条件下应用并能通过微生物发酵高产的脂肪酶即商品化的脂肪酶却依然很少。因而本领域中依然急需各种鉴定过的特性不同的备选脂肪酶，以待进一步开发。
[0011]本发明所提供的一种新颖的脂肪酶，经过鉴定其具有很强的有机溶剂耐受性、宽广的PH稳定性、较好的温度稳定性等性质，无疑将在精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、饲料工业、油脂加工、生物柴油、酯键化合物的合成和手性药物合成等领域具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0012]本发明的目的:提供一种脂肪酶，及编码该脂肪酶的基因序列。所述脂肪酶具有耐有机溶剂的脂肪酶活性、宽广的PH稳定性、较好的温度稳定性等特点，在精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、饲料工业、油脂加工、生物柴油、酯键化合物的合成和手性药物合成等多个工业领域拥有广泛的应用价值。
[0013]本发明提供一种编码脂肪酶的基因序列，所述基因序列编码:
[0014]⑴具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白质；或
[0015](ii)具有SEQ ID N0:2的第22_464位所示的氨基酸序列；或
[0016](iii)在⑴或(ii)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有脂肪酶活性的衍生蛋白质。
[0017]本发明提供一种脂肪酶基因序列，所述基因序列选自:
[0018](i')具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的序列；或
[0019](ii')具有SEQ ID NO:1的第64-1392位所示的核苷酸序列；或
[0020](iii')在严格条件下与(i')或(ii')限定的序列杂交、且编码脂肪酶或具有脂肪酶活性的衍生蛋白的序列。
[0021]本发明提供一种脂肪酶，所述脂肪酶的氨基酸序列选自:
[0022](a)具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的蛋白质；或
[0023](b)具有SEQ ID N0:2中第22-464位所示的氨基酸序列；或
[0024](c) (a)或(b)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有脂肪酶活性的衍生蛋白质；或
[0025](d) (a)或(b)或(C)中蛋白质的活性片段或其保守性变异蛋白。
[0026]本发明提供一种包含本发明所述脂肪酶基因序列的载体。
[0027]本发明提供一种包含本发明所述脂肪酶基因序列的宿主细胞。
[0028]本发明提供一种生产本发明所述脂肪酶的方法，包括:采用包含所述脂肪酶基因序列的宿主细胞产生所述的脂肪酶的条件下，培养所述宿主细胞；以及，分离由所述宿主细胞产生的所述脂肪酶。
[0029]本发明提供一种进行脂肪酶催化反应的方法，包括:[0030](A)使本发明所述的脂肪酶、宿主细胞与反应体系接触；以及
[0031](B)在适宜所述脂肪酶进行催化的条件下，进行催化反应。
[0032]本发明提供一种进行本发明所述脂肪酶催化反应的方法，还包括:本发明所述催化反应在有机溶剂环境中进行，所述有机溶剂浓度为0-50%，优选为5~45%，优选为10-40%，更优选为15~35%。优选的，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、DMS0、苯、甲苯、正己烷和异辛烷中的一种或多种。
[0033]本发明提供一种增强本发明所述脂肪酶催化活性的方法，包括:所述的脂肪酶或所生产的脂肪酶进行催化反应时，添加Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+、Ni2+、Triton X-100或AEO-9中的一种或多种，优选的，所述Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+或Ni2+的添加浓度为(T50mM，所述的Triton X-100 或 AE0-9 的浓度为 0~2%。
[0034]本发明提供一种抑制本发明所述脂肪酶催化活性的方法，包括:采用本发明所述的脂肪酶或生产的脂肪酶进行催化反应时，添加Zn2+、Co2+、SDS或CTAB中的一种或多种，优选的，所述Zn2+、Co2+的浓度为(T50mM，添加的SDS或CTAB的浓度为0~2%。
[0035]本发明还提供一种本发明所述的基因序列、脂肪酶、载体、宿主细胞在脂肪酶催化反应中的应用。
[0036]本发明还提供一种脂肪酶制剂，所述制剂包含:
[0037]a)本发明所述的脂肪酶或制备的脂肪酶；
[0038]b)包装物；和
[0039]c)任选的，可接受的辅料。
[0040]本发明还提供本发明所述的脂肪酶或制备的脂肪酶在精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、饲料工业、油脂加工、生物柴油、酯键化合物的合成或手性药物合成领域的应用。
[0041]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。并且，本领域普通技术人员可对本文中所述的各种特征和方面进行有效的组合，这些组合仍然在本申请所要求保护的范围之内。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]下面结合附图对本发明作进一步说明，其中以下附图显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
[0043]图1:本发明脂肪酶的表达载体(pPIC9k-lipcS)图；
[0044]图2:反应温度曲线；
[0045]图3:温度稳定性曲线；
[0046]图4:反应pH曲线；
[0047]图5:pH稳定性曲线；
[0048]图6:本发明脂肪酶在不同浓度甲醇中的稳定性；
[0049]图7:本发明脂肪酶在不同有机溶剂中的稳定性；
[0050]图8:0.5%浓度的不同表面活性剂对本发明脂肪酶活性的影响；
[0051]图9:不同金属离子对本发明脂肪酶活性的影响。
[0052]菌种保藏[0053]本发明中所使用的枝孢霉菌株WBRD3.10062425于2011年6月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.4962。
【具体实施方式】
[0054]本发明人经过长期而深入的研究，从枝孢霉菌株WBRD3.10062425中获得了脂肪酶编码基因序列，并采用基因工程方法使得该基因序列在合适的宿主细胞(如毕赤酵母)中重组表达，并获得了相应的重组脂肪酶。本发明人进一步对该重组脂肪酶的性质进行了鉴定，结果表明该重组脂肪酶具有耐有机溶剂、宽广的PH稳定性、较好的温度稳定性。在此基础上,本发明人完成了本发明。
[0055]发明人进一步在patentLens、EMBL和NCBI等数据库中展开检索，在NCBI中检索到与本发明SEQ ID N0:2的氨基酸序列同源性最高的序列，即编码金龟子绿僵菌推定蛋白的氨基酸序列，但其同源性也仅为62%，而其核苷酸片段与本发明SEQ ID N0:1的核苷酸序列同源性更低，仅为6%。EMBL中的结果也来源于金龟子绿僵菌推定蛋白的氨基酸的序列，但没有具体功能说明；在Patentlens等数据库文献检索中，未发现与该脂肪酶有显著同源性的相关核酸序列的报道。由此，进一步证明了本发明的基因和脂肪酶序列的独特性。
[0056]如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上
由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”
属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0057]可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。`
[0058]在本发明的第一方面中，提供了一种脂肪酶的编码基因序列，所述序列编码:
[0059]⑴具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的脂肪酶；或
[0060](ii)具有SEQ ID N0:2的第22-464位所示的氨基酸序列；或
[0061](iii)在(ii)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有脂肪酶活性的衍生蛋白质。
[0062]在一些优选例中，所述多肽与SEQ ID NO:2的脂肪酶有65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的序列相同性。
[0063]在另一些优选例中，所述基因源自保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC、保藏号为CGMCC N0.4962的枝孢霉菌株。
[0064]在本发明的一些实施方式中，所述基因序列选自:
[0065](i')具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
[0066](Iii )具有SEQ ID NO:1的第64-1392位所示的核苷酸序列；或
[0067](iii')在严格条件下与(i')或(ii')限定的序列杂交、且编码脂肪酶或具有脂肪酶活性的衍生蛋白序列。
[0068]在一些优选例中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1的序列有70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上或99%以上的序列相同性。
[0069]在本发明的另一些实施方式中，所述序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。[0070]在本发明的第二方面中，提供了一种脂肪酶，所述脂肪酶的序列选自:
[0〇71] (a)具有SEQ ID NO:2所不氣基酸序列的蛋白质；或
[0072](b)具有SEQ ID NO: 2的第22_464位所示的氨基酸序列；或
[0073](c) (a)或(b)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有脂肪酶活性的衍生蛋白质；或
[0074](d) (a)或(b)或(C)中蛋白质的活性片段或其保守性变异蛋白。
[0075]在本发明的一些实施方式中，所述脂肪酶的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0076]在一些优选例中,所述(b)中包含I~10个、I~8个、I~6个、I~4个、I~2个或I个氨基酸残基的取代、缺失或添加。
[0077]在另一些优选例中，所述脂肪酶源自保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC、保藏号为CGMCC 4962的枝孢霉菌株。
[0078]在本发明的第三方面中，提供了一种包含本发明的基因序列或脂肪酶的载体。
[0079]在一些优选例中，所述载体包括但不限于:pAZ9、pColdfK、pET?、pPic9k或pMA5。
[0080]在本发明的第四方面中，提供了一种细胞，其包含本发明的基因序列、脂肪酶或载体。
[0081]在一些优选例中，所述细胞选自:枝孢霉属(Cladosporium)微生物，例如，惚木枝抱菌(Cladosporium araliae)、`十字花科枝抱菌(Cladosporium brassicicola)、蘇木枝抱菌(Cladosporium caesalpiniae)、嗜果枝抱菌(Cladosporium carpophilum)、绿頂头枝抱菌(Cladosporium chlorocephalum)、高大枝抱菌(Cladosporium elatum)、雅致枝抱菌(Cladosporium elegans)、尖抱枝抱菌(Cladosporium oxysporum)、嗜菌核枝抱菌(Cladosporium sclerotiophilum)、枝抱样枝抱霉(Cladosporium cladosporioides)、芋枝抱菌(Cladosporium colocasiae)、Cladosporium colombiae、Cladosporiumcoralloides、瓜枝抱菌(Cladosporium cucumerinum)、球抱枝抱霉(Cladosporiumsphaerospermum)、变异枝抱霉(Cladosporium variabile)、枝抱霉(Cladosporiumuredini Co la)、枝抱霉(Cladosporium cel Iare )、卡氏枝抱霉(Cladosporium carrionii )、地窖枝抱霉(Cladosporium cellare)、夏抱生枝抱菌(Cladosporium uredinicola)等。
[0082]在另一些优选例中，所述细胞为保藏号为CGMCC 4962的枝孢霉菌株。
[0083]在本发明的第五方面中，提供了一种脂肪酶的制备方法，所述方法包括:在适合本发明的细胞产生本发明的脂肪酶的条件下，培养所述细胞；以及，分离由所述细胞产生的所述脂肪酶。
[0084]在一些优选例中，所述培养的过程是发酵生产过程。
[0085]在另一些优选例中，所述培养的温度为20~70°C、25~60°C、30~55 °C、35~50°C、或 40~45°C。
[0086]在另一些优选例中，所述培养的pH为3.0~11.0,4.0~10.0,5.0~9.0或6.0~
8.0。
[0087]在另一些优选例中，所述培养制备的脂肪酶活性受到十二烷基硫酸钠(SDS)、CTAB中的一种或多种化合物所强烈抑制，或被Zn2+或Co2+中的一种或多种离子强烈抑制。
[0088]在另一些优选例中，所述培养制备的脂肪酶活性受到0-2%的SDS或CTAB或二者的混合所强烈抑制，或被(T50mM的Zn2+或Co2+或二者的混合”所强烈抑制。[0089]在另一些优选例中，所述培养制备的脂肪酶活性被Triton X-100或AE0-9中的一种或多种化合物所提高，或被Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+或Ni2+中一种或多种离子所提高。
[0090]在另一些优选例中，所述培养制备的脂肪酶活性被0~2%的Triton X-100或AE0-9或二者的混合所提高，或被Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+或Ni2+中一种或多种且浓度在(T50mM之间的所述离子所提高。
[0091]在另一些优选例中，本发明提供的脂肪酶可在有机溶剂环境中进行催化反应，优选的，所述有机溶剂浓度为0~50%，优选为5~45%，优选为10~40%，更优选为15~35%。
[0092]在另一些优选例中，本发明提供的脂肪酶可在甲醇、乙醇、丙酮、DMS0、苯、甲苯、正己烷和异辛烷中的一种或多种有机溶剂存在的环境中进行催化反应，优选的，所述有机溶剂浓度为0~50%，优选为5~45%，优选为10~40%，更优选为15~35%。
[0093]在另一些优选例中，所述方法还进一步包括对分离的脂肪酶进行纯化、冻干、包装和/或储存的步骤。
[0094]在另一些优选例中，所述储存的温度为-80°C~_20°C、-20°C~20°C、10~55°C、15 ~50°C或 20 ~40°C。
[0095]在另一些优选例中，所述储存的pH为3~11，优选为4~9，更优选为5~8。
[0096]在本发明的第六方面中，提供了一种进行脂肪酶催化反应的方法，所述方法包括:
[0097](A)使本发明的脂 肪酶、细胞、或用本发明所述方法生产的脂肪酶与反应体系接触；以及
[0098](B)在适宜所述脂肪酶进行催化的条件下，进行催化反应。
[0099]在另一些优选例中，所述脂肪酶或细胞是分散的、或固定化的。
[0100]在另一些优选例中，所述反应体系用于选自下组的反应:水解反应、酯交换反应、醇解反应、转酯化反应、酯类的逆向合成反应、生物表面活性剂的合成反应、催化旋光异构体的拆分反应、手性药物的合成反应。
[0101]在另一些优选例中，所述反应用于粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、造纸工业或药物合成。
[0102]在另一些优选例中，所述反应的温度为20~70°C，优选为25~60°C，更优选为30~55°C、最优选为35~50°C。
[0103]在另一些优选例中，所述反应的温度为20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27 °C >28 °C >29 °C >30 °C >31 °C >32 °C >33 °C >34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 °C >41 °C >42 °C >43 °C >44 °C >45 °C >46 °C >47 °C >48 °C >49 °C >50 °C >51 °C >52 °C >53 °C >54 °C >55 °C >56 V、57。。、58。。、59。。、60。。、61。。、62。。、63。。、64。。、66。。、66。。、67。。、68。。、69。。、70。。。
[0104]在另一些优选例中，所述反应的pH为3~11，优选为4~10，更优选为5~9。
[0105]在本方面的第七方面中，提供了本发明的基因序列、脂肪酶、载体、宿主细胞在脂肪酶催化反应中的应用。
[0106]在另一些优选例中，所述脂肪酶或宿主细胞是分散的、或固定化的。
[0107]在另一些优选例中，所述反应体系用于选自下组的反应:水解反应、酯交换反应、醇解反应、转酯化反应、酯类的逆向合成反应、生物表面活性剂的合成反应、催化旋光异构体的拆分反应、手性药物的合成反应。[0108]在另一些优选例中，所述反应用于粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、污水处理工业、有机溶剂污染区域治理、洗涤剂工业、造纸工业或药物合成。
[0109]在另一些优选例中，所述反应的温度为20~60°C、25~50°C或30~40°C。
[0110]在另一些优选例中，所述反应的温度为20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27 °C >28 °C >29 °C >30 °C >31 °C >32 °C >33 °C >34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 °C >41 °C >42 °C >43 °C >44 °C >45 °C >46 °C >47 °C >48 °C >49 °C >50 °C >51 °C >52 °C >53 °C >54 °C >55 °C >56 V、57。。、58。。、59。。、70。。。
[0111]在另一些优选例中，所述反应的pH 为 3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11。
[0112]在本发明的第八方面中，提供了一种脂肪酶制剂，其包含:
[0113]a)本发明的脂肪酶或用本发明的方法制备的脂肪酶；
[0114]b)包装物；和
[0115]c)任选的，可接受的辅料。
[0116]在一些优选例中，所述脂肪酶以粉末、溶液、颗粒、酶片、分散体、胶体、固定化酶、胶囊、或膜反应器形式存在。
[0117]在另一些优选例中，所述可接受的辅料选自:缓冲剂、填料、固定化载体、溶剂或分散基质、赋形剂。
[0118]本发明的脂肪酶编码基因
[0119]如本文所用，术语“脂肪酶基因”、“脂肪酶编码序列”或“编码脂肪酶的核苷酸”可互换使用，均是指编码本发明所述的脂肪酶或其衍生蛋白或活性片段的核苷酸序列。所述基因可为具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的序列、在严格条件下与SEQ ID N0:1序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的基因分子，所述基因表达本发明的脂肪酶。
[0120]如本文所用，术语“严格条件”是指:(I)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2 X SSC, 0.1%SDS, 600C ;或⑵杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。例如，所述序列可为具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的互补序列，例如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的互补序列。
[0121]本发明的脂肪酶基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0122]应理解，本发明的脂肪酶的编码基因最初获自保藏号为CGMCC N0.4962的枝孢霉菌株。与初始基因具有高度同源(如具有50%以上，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上，更优选85%以上如85%、90%、95%、甚至98%、99%以上序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。[0123]本发明的脂肪酶
[0124]如本文所用，术语“脂肪酶”、“三酰基甘油酰基水解酶”、“本发明的重组脂肪酶”可互换使用，是指具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质或其同源蛋白，或这些蛋白质具有脂肪酶活性的变异或修饰形式、活性片段等。例如，所述脂肪酶可选自:(a)SEQ ID N0:2的氨基酸序列；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有脂肪酶活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。
[0125]本发明的蛋白质或多肽可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、曲霉、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等)中产生。
[0126]本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本发明的脂肪酶或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有脂肪酶活性。
[0127]可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述(b)中的蛋白质或多肽。可利用编码所述蛋白质或多肽的编码序列来构建转基因生物。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括脂肪酶的活性片段和活性衍生物。
[0128]该多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与脂肪酶编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗脂肪酶的抗血清获得的脂肪酶或蛋白。本发明还可使用其它多肽，如包含脂肪酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白质外，本发明还包括了脂肪酶的可溶性片段。通常，该片段具有脂肪酶序列的至少约10个连续氨基`酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。
[0129]载体和宿丰
[0130]本发明还涉及包含脂肪酶基因的载体以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞。
[0131]通过常规的重组DNA技术(如Science，1984 ；224:1431)，可利用本发明的编码序列可用来表达或生产重组的脂肪酶。一般来说有以下步骤:
[0132](I)用本发明的编码脂肪酶的基因(或变异体)，或用含有该基因的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0133](2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；和
[0134](3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。
[0135]本发明中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、动物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
[0136]本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含脂肪酶编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本发明中可使用pAZ9、PCold?、pET?spPic9k或pMA5等载体。
[0137]此外，表达载体可任选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如绿色荧光蛋白(GFP)或四环素或氨苄青霉素抗性等。
[0138]包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如动物细胞。代表性例子有:黑曲霉、大肠杆菌、链霉菌属、农杆菌等；真菌细胞如酵母，如毕赤酵母、啤酒酵母等。在本发明中，优选采用黑曲霉细胞作为宿主细胞。
[0139]在上面的方法中的重组脂肪酶可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
口 ο
[0140]酶制剂
[0141 ] 本发明还提供了一种酶制剂，所述制剂含有有效量的本发明的脂肪酶或其编码序列、包装物、和任选的可接受的辅料。
[0142]如本文所用，术语“可接受的”是指适用于脂肪酶的保存和使用，不会过分影响酶促反应及其产物的物质，即`有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量”是指可产生所需功能或活性的、且可在酶促反应中被接受的量。
[0143]本发明的辅料是本领域普通技术人员所熟知的，包括但不限于:缓冲剂、填料、固定化载体、溶剂或分散基质、赋形剂、助流剂。
[0144]本发明酶制剂中的脂肪酶可为粉末、溶液、颗粒、酶片、分散体、胶体、固定化酶、胶囊或膜反应器形式。如果本发明的酶制剂是固体制剂，则可在使用前，根据需要将所需量的本发明酶制剂分散或溶解在适当的溶剂或反应体系中。
[0145]本发明酶制剂的保存温度通常为10~55°C、15~50°C或20~40°C，保存的pH通常为6~9.5、7~9或7.5~8.5。如果本发明的酶制剂是固体形式，则其对温度和pH的要求通常低于相应的液体制剂。使用本发明酶制剂的反应的温度可为20~60°C、25~50°C或30~40°C ;反应体系的pH可为7.0~9.0,7.5~8.5或7.8~8.2。
[0146]本发明的酶制剂中脂肪酶或其编码序列有效成分占组合物总重量的0.001~99.9wt% ;优选为组合物总重量的I~95wt%，较优选为5~90wt%，更优选10~80wt%。余量为辅料等物质。
[0147]应理解，所用脂肪酶或其编码序列的有效量可随待施用的反应体系、反应效果、反应速度等而变化。可由本领域普通技术人员根据具体情况来检测、判断和/或决定所述有效量。
[0148]应思
[0149]本发明的脂肪酶可用于需要其进行催化的各种反应中，这些反应包括但不限于:水解反应、酯交换反应、醇解反应、转酯化反应、酯类的逆向合成反应、生物表面活性剂的合成反应、催化旋光异构体的拆分反应、手性药物的合成反应等。
[0150]本发明的脂肪酶可用于粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、造纸工业或药物合成等，具有广泛的应用前景。
[0151]本发明的优点
[0152]1.本发明的脂肪酶具有耐有机溶剂、宽广的pH稳定性、较好的温度稳定性等特点。
[0153]2.本发明的脂肪酶在精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、饲料工业、油脂加工、生物柴油、酯键化合物的合成和手性药物合成等多个工业领域具有广阔的应用价值。
[0154]实施例
[0155]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
[0156]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。以下实施例中所有试剂都可来源于市售，例如，本发明所用的培养基成分均可购自国药集团化学试剂有限公司。
[0157]除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0158]出发菌株来源、选育、鉴定和保藏
[0159]1、采样
[0160]本发明所提供的菌株Cladosporium sp.WBRD3.10062425分离自中国西藏、甘肃等地区的藏族传统食品一天然藏酥油。
[0161]2.筛选平板的制备
[0162]罗丹明B的平板的制作方法是:配方甲液(硫酸铵0.1%，酵母浸出汁0.5%，胰蛋白胨0.5%，K2HPO40.1 %，KC10.5 %，七水合硫酸镁0.05%,七水合硫酸亚铁0.01%,琼脂2.0%)115°C灭菌30min后加入同样方式灭菌的配方乙液(橄榄油与2 %聚乙烯醇以1:3比例混合，1000Orpm搅拌乳化)，充分混合后按照1% (v/v)的量加入过滤除菌的0.1%的罗丹明B溶液。充分混匀后制备得到筛选平板。
[0163] 3.产脂肪酶丝状真菌Cladosporium sp.WBRD3.10062425的分离筛选及鉴定
[0164]取一块尽可能新鲜的藏酥油样品，去除约Icm厚度表层后，切取约IOg左右的藏酥油样品置于IOOmL含1.0%Tween 80的无菌水中。振荡30min后按照传统的稀释涂布的方法稀释成不同的稀释度，并将各个稀释度的样品涂布于罗丹明B平板上置于28°C生化培养箱中培养。
[0165]每24h在紫外灯下观察罗丹明B平板上是否有荧光圈出现，产脂肪酶的丝状真菌的生长速度较慢往往需要96h后才能观察到。挑取荧光圈较大的微生物进行进一步的稀释涂布分离以获得纯种菌株，而后再次用罗丹明B平板对这些纯种菌株进行脂肪酶检测，结果发现有一株荧光圈十分显著的菌株标记为WBRD3.10062425。
[0166]该菌的生长状态和形态学特征如下:
[0167]该菌在察氏培养基上25°C温度下生长速度极慢，培养7天时菌落直径为10mm，菌丝呈绒状、暗黄绿色、质地致密、背面呈黑绿色；该菌在麦芽汁培养基上25°C温度下生长7天时达菌落直径可达30mm，菌丝厚绒状，灰色、质地致密、背面墨黑色；在查氏酵母膏琼脂培养基上25°C温度下生长7天时的菌落直径约20mm，菌丝绒状，形成同心环纹，中间橄榄色，外围暗黄绿色，质地致密，背面黄绿至褐色；该菌在PDA (马铃薯葡萄糖琼脂)培养基上25°C温度下培养7天时的菌落直径约15mm，菌丝绒状或絮状，黄绿色，质地致密，背面绿黑色边缘白色。在显微镜下观察，分生孢子梗单生、丛生、直立或曲屈状，偶有分枝，具隔膜；枝孢0-3个，隔膜，平；分生孢子椭圆形近球形，孢脐明显，褐色，顶生。
[0168]根据以上形态特征以及显微形态特征观察结果，参考《真菌鉴定手册》(魏景超遗著.真菌鉴定手册.上海科学技术出版社.1979年9月第一版)、《真菌的形态和分类》(戴芳澜遗著.真菌的形态和分类.科学出版社.1987年3月第一版)以及《中国真菌志》(张中义主编.中国真菌志第十四卷枝孢属黑星孢属梨孢属.科学出版社.2003年4月第一版)等判断其与枝孢霉(Cladosporium)属菌最相似。 [0169]根据有关微生物鉴定方法，对该菌的18S rDNA测序结果(如SEQ ID NO: 14)进行比对后发现该菌与 Cladosporium cladosporioidesCGENBANK 号 AY251093.2), Cladosporiumbruhnei (GENBANK 号 AY251096.2), Cladosporium uredinicola (GENBANK 号 AY251097.2)以及 Cladosporium cellare (GENBANK 号 NG016540.1)具最高同源性超过 99%。
[0170]委托广东省微生物菌种保藏中心(即GMCC，中国广州市先烈中路100号)对该菌种进行鉴定，鉴定结果为枝孢霉，拉丁学名为:Cladosporium sp.。
[0171]将该枝孢霉菌株WBRD3.10062425于2011年6月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.4962。
[0172]在本发明的下述实施例中，脂肪酶活力的检测采用pNPP法，具体过程如下:
[0173]本发明采用对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)法来测定脂肪酶的活力大小，该方法以对硝基苯棕榈酸酯为反应底物，通过脂肪酶的催化产生有色产物对硝基苯酚(p-NP)，该产物在405-410nm波长下具有强烈吸收。酶活力单位定义为:1个单位即指在标准实验条件下每分钟催化释放Iymol的p-NP所需的酶量。p-NPP法测定脂肪酶活力的更详细描述可参见，，Mahadik N.D., Puntambekar U.S., Bastawde K.B., et al.Production of acidiclipase by Aspergillus niger in solid state fermentation.Process Biochem.2002，38:715 - 721.”该方法是国内外测定脂肪酶活力的常用方法，操作简便，反应快且灵敏度闻，是一种精确而闻效的活力测定方法。
[0174]在本发明中，溶液置换可以采用凝胶层析、透析或超滤等方式进行，优选超滤进行溶液置换。超滤过程中的超滤膜优选截留分子量为5-10KDa的超滤膜，超滤膜的材质优选聚醚砜、再生纤维素等材质。
[0175]实施例中采用的培养基如下:
[0176]种子培养基组成为:葡萄糖3%、蛋白胨0.3%、玉米粉0.5%、NaH2PO4.12H20 0.2%、MgSO4.12H20 0.1%、CaCl20.05%, pH 6.5 ；
[0177]发酵培养基组成是:蔗糖2%、蛋白胨3%、玉米粉0.5%、酵母浸出粉1%、吐温-800.5%、滑石粉 0.1%,NaNO30.3%,KH2PO40.7%,Na2HPO4.12Η20 0.25%、MgS04.12Η20 0.1%、CaCl20.05%、橄榄油 0.5%, pH 6.5 ；
[0178]YPD培养基:lwt%酵母提取物，2wt%蛋白胨，lwt%葡萄糖；
[0179]LB培养基:lwt%胰蛋白胨，0.5wt%酵母提取物，lwt%NaCl ；
[0180]MD平板培养基:1.34wt%酵母氮源基础(YNB)，4X 10_5wt%生物素，2wt%葡萄糖，1.5wt%琼脂；
[0181]BMMY-Rho B平板培养基:1%酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸钾，pH7.0，
1.34%YNB，4X 10、生物素，0.5%甲醇，0.001%罗丹明B, 4%聚乙烯醇，2%橄榄油；
[0182]BMGY液体培养基:1%酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸钾，pH7.0, 1.34%YNB，4X10_5%生物素，1%甘油；
[0183]BMMY 培养基:1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，IOOmM 磷酸钾，pH7.0, 1.34%YNB，4X 10、生物素，0.5%甲醇。
[0184]实施例1.脂肪酶编码基因的克隆
[0185]通过分子生物学方法从菌株枝孢霉菌株WBRD3.10062425中克隆出脂肪酶编码基因，具体步骤如下:
[0186]1.1野生脂肪酶的生产
`[0187]加入IOmL左右的无菌生理盐水至一支新鲜培养好的枝孢霉WBRD3.10062425斜面以制备孢子悬浮液，而后取ImL的悬浮液接种至装液量为30mL的250mL容积的种子培养基中于 28 °C、200rpm 培养 24h。
[0188]种子培养好后，取3mL的种子培养液接种至250mL发酵培养基中，28°C，200rpm,发酵67h左右，检测胞外脂肪酶活力。结果显示，发酵清液中的脂肪酶活力达到L03units/
mLo
[0189]1.2野生脂肪酶的分离纯化和脂肪酶氨基酸N端序列的获得
[0190]收集发酵液，用双层滤纸进行过滤，以除去菌丝体，获得发酵上清。将发酵上清液用0.22 μ m的微孔滤膜过滤，再使用IOkDa的超滤膜(Omega TM10K，美国PALL公司)进行超滤，得到超滤浓缩液。
[0191]在冰浴状态下缓慢加入硫酸铵粉末至超滤浓缩液中直至饱和度达到30%，冰浴静置2h后，15000rpm离心25min (高速冷冻离心机CR22GIII，日本日立公司)收集离心上清液。再次缓慢加入硫酸铵粉末直至饱和度达到60%，此盐析步骤一直在冰浴下完成。盐析样品4°C静置过夜后，离心收集盐析沉淀。
[0192]室温下用约20mL的起始缓冲液(50mM的含0.4M(NH4)2SO4的口取.5的Tris.HCl缓冲液)溶解60%饱和度的盐析沉淀样品，经过0.22 μ m的微孔滤膜过滤后粗酶液用HiTrapphenyl HP 5mL (GE Healthcare)苯基疏水层析柱进行纯化,具体过程如下:使用100%的洗脱缓冲液(50mM Tris.HCl缓冲液，pH7.5)进行洗脱至基线稳定，用蒸馏水洗脱至基线稳定，用70%的乙醇溶液进行洗脱，收集活性组分。
[0193]经过疏水层析纯化的脂肪酶样品再经缓冲液(50mM Tris.HCl缓冲液，pH7.5)置换后，用Mono QTM 4.6/100PE(GE Healthcare)阴离子层析柱进行纯化并收集活性组分。离子交换层析过程所使用的缓冲液有两种，一种是浓度为20mM，pH值为7.5的Tris.HCl起始缓冲液，另一种为含有2M NaCl的浓度20mM，pH值为7.5的Tris.HCl洗脱缓冲液。洗脱过程的流速为lmL/min，采用线性梯度洗脱的方式进行洗脱。
[0194]以上过程均在室温下完成，层析过程使用的设备为GE公司的AKl \ExplorerlOO。层析纯化后的样品经过缓冲液(50mM Tris.HCl缓冲液，pH7.5)置换后保存于浓度为20mM，pH值为7.5的Tris.HCl缓冲液中，4°C储存。
[0195]将上述经过层析过程纯化的野生多肽，进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝R250进行染色。从胶上切取本发明多肽对应条带，通过N端序列分析法，得到的一段肽段的氨基酸序列，其序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0196]N端序列分析法是目前本领域中进行蛋白质分析和鉴定的一种较为常规的方法，具体可参见 Edman、Hewick 等的方法(Edman P, Begg G.Eur J Biochem, 1967, 1:80-91.Hewick RM, Hunkapiller MW, Hood LE, Dreyer WJ.J Biol Chem, 1981，256:7990-7997)。
[0197]1.3兼并PCR获取目标多肽的下游编码核苷酸序列
[0198]根据QiagenRNeasy Plant Mini Kit说明书操作，提取枝孢霉WBRD3.10062425总RNA。根据 Promega Reverse Transcription Kit 说明书操作，将 RNA 反转录为 cDNA。而后根据N端序列分析法获取的野生多肽的部分氨基酸序列DPFYQP设计的兼并引物(SEQ IDNO:3 和 SEQ ID NO:4)。
[0199]简并PCR 体系(引物对 BRC (SEQ ID NO: 3) /oligodT (SEQ ID NO:4)作 PCR):ExTaq 0.5ul, IOXEx PCR buffer 5ul, dNTP mixture 8ul, primer Ilul, primer 21ul, cDNAlul，水 33.5ul。反应条件:95°C 2min，5 个循环(95°C 30s, 40°C lmin,72°C lmin)，30 个循环(95°C 30s，48°C lmin，72°C Imin),72°C 10min，4°C保温。所得阳性 PCR 产物胶回收后，直
接送至上海美季生物公司测序。
[0200]经测序，获取目标多肽的核苷酸序列片段1500bp。
[0201]1.45’ RACE获取目标多肽的上游序列
[0202]根据Invitrogen Firstchoice RLM-RACE Kit 说明书实时操作。
[0203]第一步PCR:
[0204]PCR 体系:Ex Taq 0.5ul, IOXEx PCR buffer 5ul, dNTP mixture 8ul, primerRACERl (SEQ ID NO:7) lul,primer GSPl (SEQ ID NO: 5) lul, cDNA lul,水 33.5ul。PCR 的反应条件:94°C 3min，35 个循环(94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 2min 30s), 72°C 7min，4°C保温。
[0205]第二步PCR:
[0206]PCR 体系:Ex Taq 0.5ul, IOXEx PCR buffer 5ul, dNTP mixture 8ul, primerRACER2 (SEQ ID NO:8) lul, primer GSP2 (SEQ ID N0:6) lul，第一步 PCR 反应液 lul，水33.5ul。PCR反应条件同第一步。
[0207]第二步PCR反应产物经过OmegaGel Extraction Kit 回收,连接pMD18_T simplevector，转化DH5 α，挑取转化子，经过验证的阳性克隆子送至上海美季生物公司测序。
[0208]转化方法如下:感受态细胞置于冰中融化，将IOOul的感受态细胞移至灭菌处理的试管内，加入连接产物10ul，冰中放置30分钟，42°C放置90秒，冰中放置2_3分钟，加入LB培养基，使终体积为lml，37°C振荡培养Ih (150rpm)，将菌液离心，上清去除700ul，剩余液体重新混匀，涂布3块含100ug/mg氨节青霉素的LB平板,每块平板IOOul, 37°C, 200rpm过夜培养。
[0209]将5’ RACE测序结果与已经获取的核苷酸片段进行拼接，共获取枝孢霉目标多肽核苷酸完整阅读框1395bp，见SEQ ID NO: 1，并将该基因命名为lipcs。该基因编码的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。
[0210]实施例2.重组表达载体的构建
[0211]2.1枝孢霉目标脂肪酶基因(mlics)的克隆
[0212]枝孢霉WBRD3.10062425来源脂肪酶在氨基酸水平上与Malassezia furfur来源的脂肪酶(G1:73765555)的最高一致性为39%。且与其他脂肪酶一样，活性中心的保守序列为“GYSGG”。其中，SEQ ID N0:2的氨基酸序列中的第1_21位氨基酸为信号肽区域，22-464位氨基酸为成熟肽区域，成熟肽分子量为46796Da。将编码成熟肽的基因命名为mlipcs。
[0213]用TakaRa Mini BEST Universal Genomic DNA Extraction kit Ver.4.0 试剂盒(宝生物工程(大连)有 限公司)提取枝孢霉WBRD3.10062425的基因组，然后以其为模板，以 primer Iipcs-U(SEQ ID NO:9)和 primer Iipcs-D(SEQ ID NO: 10)为上下游引物，进行PCR。其中，PCR反应体系:Prime star Taq HS (DRO10A,宝生物工程(大连)有限公司)
0.5ul,5XReaction Buffer IOul, dNTP 4ul,primer Iipcs-U Iul, primer Iipcs-D lul,genome 0.3uljjC34ul。反应条件:94°C 3min，35 个循环(94°C 30s, 55°C 15s,72°C 2min)，72。。，IOmin。
[0214]2.2基因和载体的酶切及酶切产物的精制
[0215]将上述PCR产物胶回收，同时将PCR产物和质粒pPIC9k (购自Invitrogen)用EcoR I和Not I分别双酶切，酶切体系:20.0μ I胶回收产物(或PIC9k质粒)，11.0μ IddH20, 5.0ul BSA,5.0ul Triton X-100,5.0μ I 10ΧΗ Buffer, 2.0 μ I EcoR I 和 2.0 μ INot I，37°C条件下过夜酶切。按厂商提供的方法，将酶切产物用Omega PCR产物纯化试剂盒(购自Omega公司)纯化。
[0216]2.3连接载体
[0217]将mlipcs基因(经EcoR I和Not I酶切)与载体DNA片段(经EcoR I和Not I酶切)于22°C连接lh，获得重组质粒；其中，连接反应体系如下:4.25 μ I DNA片段，4.25 μ I载体，Iul 10X ligation buffer, 0.5ul Fermentas ligase。
[0218]2.4重组质粒转化大肠杆菌DH5 α
[0219]按照实施例1.4的方法进行转化，转化菌液涂布含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板，370C，过夜培养。挑取数个转化子在5ml含相应抗生素的LB液体培养基中培养，按照Axygen Plasmid Extraction Kit说明书抽提质粒；将转化子送至上海美季生物公司测序，测序结果显示，在上述转化子中成功插入目的基因，将其命名为pPIC9k-lipcs，其表达载体如图1。
[0220]实施例3重组工程菌株的构建
[0221]3.1毕赤酵母感受态的制备
[0222]挑取毕赤酵母GS115单菌落，接种至含有30ml YI3D培养基的250ml三角瓶中，28°C、200rpm培养过夜。取500 μ I的培养物接种至含有30ml新鲜YPD培养基的250ml三角摇瓶中，30°C、200rpm培养过夜，至0D_达到1-1.5。将培养液于4°C,1500g离心5min，用500ml冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。4°C，1500g离心5min，用250ml冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。4°C，1500g离心5min，用20ml冰预冷的IM山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。4°C，1500g离心5min离心，用Iml冰预冷的IM山梨醇溶液将菌体沉淀重悬(每支感受态包含200D细胞)，分装至2ml离心管待用(IOOul/支)。
[0223]3.2毕赤酵母的电击转化
[0224]将重组质粒用Bgl II限制性内切酶线性化(线性化条件:25.0μ I质粒，18.0 μ LddH2O, 5.0 μ I IOXH Buffer, 2.0 μ I Bgl II，37°C酶切 6h)，将酶切片段进行胶回收。取酶切产物5 μ I分别与100 μ I新鲜毕赤酵母感受态菌体GS115混匀，移取至冰预冷的电转杯中，冰浴5min。以1.5kV、25yF、400Q条件电击I次，立即加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，并移取菌液涂布于MD平板上。于28°C培养48-55h，至单菌落出现。
[0225]3.3重组毕赤酵母工程菌的鉴定
[0226]从MD平板上挑取单菌落至BMMY-Rho B转化培养基平板上，28°C培养24h挑取在紫外光下(254nm)呈现荧光圈的数个GS115单菌落(优先挑选圈大的菌落)，分别接种于30ml YH)液体培养基(37°C，200rpm)，培养18h后，取Iml菌液(以GS115空菌落做空菌对照)，5000rmp离心5min,去上清,加Iml无菌水重悬。然后放在沸水处理IOmin,接着放入-80°C冰箱处理15min，最后再用沸水处理lOmin。将抽提的基因组样品再用乙醇脱氢酶引物(AOX-U(SEQ ID NO: 11) AOX-D (SEQ ID NO: 12))按以下方法进行 PCR 扩增。PCR 反应体系:rTaq 0.25ul, IOXPCR buffer 2ul, dNTP mixture2.5ul, primer AOX-U 0.5ul,primer AOX-D 0.5ul,菌液 0.5ul，水 13.75ul。反应条件:94°C 5min，30 个循环(94°C 30s,53°C 30s, 72°C 2min)，72°C 10min，4°C保温。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，将有含有正确扩增条带出现的单克隆保存备用。将重组菌命名为GS115 (pPIC9k-mlipcS)。
[0227]实施例4.脂肪 酶的重组表达
[0228]4.1本发明脂肪酶的重组表达
[0229]将验证正确的单克隆接种至30mlYPD液体培养基(培养GS115空宿主作为对照)。28°C，200rpm培养30_40h。取少量菌液接种至30ml BMGY液体培养基(28°C、200rpm摇至OD600 达到 2-6。
[0230]1500-3000g、4°C离心5min，收集细胞，去除上清，用30ml BMMY培养基等体积重悬细胞，28°C、200rpm条件下培养，使用0.5%甲醇进行诱导表达。每24h，加甲醇至终浓度为
0.5%以继续诱导。
[0231]分别在他、2411、4811、7211、9611、12011、14411、16811，取Iml 培养液，用于生物量测定、
目标脂肪酶的蛋白表达检测及酶活分析，以确定诱导后收集细胞的最佳时间。
[0232]4.2表达产物的SDS-PAGE电泳鉴定
[0233]取Iml诱导72h后的菌液，10000r/min离心lmin，收集发酵上清。加入一定量的5 X上样缓冲液，沸水煮5min。取10 μ I对上清蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，以鉴定mlipcs在毕赤酵母中的表达情况，在约47KDa处出现明显的目标蛋白条带。
[0234]实施例5.重组脂肪酶的分离纯化
[0235]将收获的毕赤酵母发酵液采用1000Orpm离心15min (高速冷冻离心机CR22GIII，日本日立公司)，收集离心上清液。而后缓慢加入硫酸铵粉末直至饱和度达到60%，此盐析步骤一直在冰浴下完成。盐析样品4°C静置过夜后，离心收集盐析沉淀。
[0236]室温下用约40mL的起始缓冲液(50mM浓度含0.4M(NH4)2S04的ρΗ7.5的Tris.HCl缓冲液)溶解60%饱和度的盐析沉淀样品，经过0.22 μ m的微孔滤膜过滤后粗酶液用HiTrapphenyl HP (购自GE Healthcare)苯基疏水层析柱进行纯化,收集活性组分。疏水层析过程的洗脱液有:洗脱缓冲液(50mM Tris -HCl缓冲液，pH7.5)、蒸馏水和70%的乙醇水溶液。层析过程流速为3mL/min。洗脱过程是先用100%的洗脱缓冲液进行洗脱至基线稳定，而后再用蒸馏水洗脱至基线稳定，最后用70%的乙醇溶液进行洗脱。
[0237]经过疏水层析纯化的脂肪酶样品再经置换缓冲液(50mM Tris.HCl缓冲液，PH7.5)置换后，用Mono QTM 4.6/100PE (GE Healthcare)阴离子层析柱进行纯化并收集活性组分；其中，以浓度为20mM，pH值为7.5的Tris -HCl作为起始缓冲液，以含有2MNaCl的浓度20mM，pH值为7.5的Tris.HCl作为洗脱缓冲液。
[0238]层析过程使用的设备为GE公司的AKTA Explorer 100。层析纯化后的样品经过缓冲液(50mM Tris.HCl缓冲液，pH7.5)置换后保存于浓度为20mM，pH值为7.5的Tris.HCl缓冲液中，4°C储存。
[0239]实施例6.重组脂肪酶的酶学性质分析
[0240]6.1脂肪酶活性的最适作用温度
[0241]在0_70°C下按照pNPP法测定脂肪酶活力，以测定酶活最高时的酶活力为100%，计算其他温度下的相对酶活(％)，结果如图2所示。由图2可见，本发明脂肪酶的活力随着温度的提高呈现先上升后下降的趋势，其中40°C时的酶活最高，为其最适作用温度，15°C可保持脂肪酶活力仍能达到55%，60°C时仍然有超过75%的脂肪酶活力。由此可见，本发明脂肪酶表现出作用温度范围广的性质，此特性对于进一步拓宽该脂肪酶的实际应用非常有利。
[0242]6.2脂肪酶活性的温度稳定性
[0243]将实施例5中制备所得的脂肪酶溶液(79units/ml)分别在4°C、25°C、35°C、40°C、45°C、60°C、7(TC保温1.5h，并从Omin开始，每隔30min取样I次，于40°C、pH8.0条件下按照PNPP方法检测脂肪酶活力。以0°C、0m`in测定的脂肪酶活力为100%，计算其他温度和其他时间酶的相对活力，结果如图3所示。由图3可见，本发明脂肪酶在0-45°C范围内温浴
1.5h，脂肪酶活力保持不变，70°C温浴1.5h后，脂肪酶活力仍能保持50%以上。
[0244]6.3最适作用pH
[0245]将pNPP法测定酶活的缓冲体系分别调整为0.1M浓度的pH (3.0-11.0)—系列不同PH值的缓冲液，而后于40°C下按pNPP法分别测定不同pH缓冲体系中的实施例5制备的脂肪酶的活力大小。以最高时的酶活力为100%，计算其它pH下酶的相对活力(％)，结果如图4所示。由图4可见，本发明脂肪酶在pH8.0时的脂肪酶活力最高，但是在pH3.0和ρΗΙΟ.0时仍具有近20%的脂肪酶活力。由此推断，本发明所述脂肪酶为弱碱性脂肪酶，其可作用pH范围非常大，即在PH3.0-10.0范围内皆具有20%以上的脂肪酶活力。
[0246]6.4本发明脂肪酶的pH稳定性
[0247]取实施例5制备的脂肪酶溶液(79units/ml)，以1:1 (v/v)分别置于0.4M的不同pH (3.0-11.0)的缓冲体系中，于4-8°C保温42h，再于35°C、pH8.5下按pNPP法分别测定脂肪酶的活力。以在ρΗ8.0缓冲液中所测得的酶活力为100%，计算其它pH下的相对酶活力，结果如图5所示。由图5可见，本发明所述脂肪酶的脂肪酶活力在较宽pH范围内(3.0-11.0)保持稳定，在PH3.0时其的脂肪酶活力竟得到增强。
[0248]6.5甲醇中的稳定性[0249]将甲醇与本发明实施例5制备的脂肪酶溶液(79units/ml)按照甲醇含量从0-95%(v/v)的配比进行配制，而后将含甲醇的脂肪酶溶液置于4-8°C条件下放置22h后用pNPP法进行脂肪酶活力的检测，以不添加甲醇的样品做对照，结果见图6。由图6可见，本发明脂肪酶具有较强的甲醇耐受性，其脂肪酶活性即使在50%的甲醇中仍然能够保持超过70%的活性。
[0250]6.6部分有机溶剂中的稳定性
[0251]准备有机溶剂甲醇、乙醇、丙酮、和DMSO ;水不溶有机溶剂苯、甲苯、正己烷和异辛烷。配制含25% (v/v)有机溶剂的脂肪酶溶液(300uL实施例5制备的酶液(79units/ml)+100此有机溶剂)400此，4-81:、50印111缓慢振荡18h。孵育结束后，取同等酶量按照pNPP标准方法检测脂肪酶的活力，以不加有机溶剂的脂肪酶溶液作为对照，计算剩余相对活力，结果见图7。由图7可见，本发明脂肪酶的活性几乎不受众多有机溶剂的影响，因此，是一种具有耐有机溶剂脂肪酶。
[0252]6.7表面活性剂对本发明脂肪酶活性的影响
[0253]在检测本发明脂肪酶活性的pNPP反应体系中分别添加0.5%的阳离子表面活性CTAB、阴离子表面活性剂SDS、非离子表面活性剂Tween 80、AE0_9和Triton X-100，以不添加表面活性剂的样品做对照，计算剩余相对活力，结果见图8。本发明脂肪酶的脂肪酶活性可以被0.5%的非离子表面活性剂Triton X-100和AE0-9增强，而被0.5%的SDS、CTAB等强烈抑制。
[0254]6.8金属离子对脂肪酶活性的影响
[0255]配制CaCl2、MgSO4, ZnSO4, CuSO4, MnCl2, NiSO4, CoCl2 等无机盐贮存液。按照 pNPP方法，首先配制反应混合液 ，向每个反应管中分装400uL混合液，并添加无机盐贮存液至无机盐的终浓度为5mmol/l，再按照pNPP方法测定活性。以添加空白20mM Tris (pH7.9)为对照，计算剩余相对活力，结果见图9。由图9可见，Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+和Ni2+等具有增强本发明脂肪酶的活力的作用，相反Zn2+和Co2+等则强烈抑制了该脂肪酶的活力。
[0256]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改或对本文所描述的特征进行组合，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种编码脂肪酶的基因序列，所述序列编码: (i)具有SEQ ID NO:2所不氣基酸序列的蛋白质；或 (?)具有SEQ ID NO:2的第22-464位所示的氨基酸序列；或 (iii)在(i)或(ii)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有脂肪酶活性的衍生蛋白质。
2.如权利要求1所述的基因序列，其特征在于，所述基因序列选自: (i')具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或 (ii')具有SEQ ID NO:1的第64-1392位所示的核苷酸序列；或(iii,)在严格条件下与(i')或(ii,)限定的序列杂交、且编码脂肪酶或具有脂肪酶活性的衍生蛋白的序列。
3.一种脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶的氨基酸序列选自: (a)、具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列；或 (b)、具有SEQID NO: 2中第22-464位所示的氨基酸序列；或 (c)、(a)或(b)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有脂肪酶活性的衍生蛋白质；或 (d)、(a)、(b)或(c)中蛋白质的活性片段或其保守性变异蛋白。
4.一种包含权利要求1~2中任一项所述的基因序列或权利要求3中所述的脂肪酶的编码基因序列的载体。
5.一种宿主细胞，其特征在`于，所述细胞包含权利要求1~2中任一项所述的基因序列、权利要求3中的脂肪酶的编码基因序列或权利要求4中所述的载体。
6.一种生产脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包括:在适合权利要求5所述的宿主细胞产生如权利要求3所述的脂肪酶的条件下，培养所述宿主细胞；以及，分离由所述宿主细胞产生的所述脂肪酶。
7.一种进行脂肪酶催化反应的方法，其特征在于，所述方法包括: (A)使权利要求3中所述的脂肪酶、权利要求5中所述的宿主细胞、或用权利要求6所述方法生产脂肪酶与反应体系接触；以及 (B)在适宜所述脂肪酶进行催化的条件下，进行催化反应。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化反应在有机溶剂环境中进行，优选的，所述有机溶剂浓度为0~50%，优选为5~45%，优选为10~40%，更优选为15~35%。
9.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、DMSO、苯、甲苯、正己烷和异辛烷中的一种或多种。
10.一种增强脂肪酶催化活性的方法，其特征在于，所述方法包括:采用权利要求3所述的脂肪酶或权利要求6生产的脂肪酶进行催化反应时，添加Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+、Ni2+、Triton X-100或AE0-9中的一种或多种。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH4+或Ni2+的添加浓度为0~50禮，所述的Triton X-100或AE0-9的浓度为0~2%。
12.—种抑制脂肪酶催化活性的方法，其特征在于，所述方法包括:采用权利要求3所述的脂肪酶或权利要求6生产的脂肪酶进行催化反应时，添加Zn2+、Co2+、SDS或CTAB中的一种或多种。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的Zn2+、Co2+的添加浓度为(T50mM，所述的的SDS或CTAB的浓度为0-2%。
14.权利要求1或2所述的基因序列、权利要求3中所述的脂肪酶、权利要求4中所述的载体、权利要求5所述的宿主细胞在脂肪酶催化反应中的应用。
15.—种脂肪酶制剂，其特征在于，所述制剂包含: a)权利要求3中所述的脂肪酶或用权利要求6所述的方法制备的脂肪酶； b)包装物；和 c)任选的，可接受的辅料。
16.权利要求3中所述的脂肪酶或用权利要求6所述的方法制备的脂肪酶在精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、饲料工业、油脂加工、生物柴油、酯键化合物的合成或手性药 物合成领域的应用。
【文档编号】C12N15/63GK103865941SQ201210532087
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月11日 优先权日:2012年12月11日
【发明者】徐正军, 陈苗苗, 周美凤, 许骏 申请人:丰益(上海)生物技术研发中心有限公司