专利名称：一种利用海洋胶原蛋白酶mcp-01制备胶原蛋白小肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用海洋胶原蛋白酶MCP-Ol制备胶原蛋白小肽的方法，属于生物技术技术领域背景技术
胶原蛋白(collagen)是由动物细胞合成的一种生物性高分子，广泛存在于动物的骨、腱、软骨和皮肤中，是结缔组织中极其重要的一种水不溶性蛋白质。由于其具有特殊的结构，很难被生物学降解，所以只有少数的蛋白酶能够在特定的条件下水解胶原纤维，这类酶被称为胶原蛋白酶。胶原蛋白酶在医学、食品学和材料学上有着广泛应用，常被应用于细胞培养、富含胶原的肉食品(如牛肉)加工、胶原沉积性疾病如烧伤、手术后过度增殖性瘢痕的降解、腰椎间盘突出症等病症的治疗。
胶原蛋白肽是天然胶原蛋白经降解处理后制成的，具有较高的消化吸收性，相对分子质量为2000 30000道尔顿的肽段。胶原蛋白多肽产物由于其独特的生理功能及特点，可用于开发多种功能性健康食品；同时，胶原多肽以其独特的分子结构和较小的分子量、良好的渗透性、与皮肤良好的相容性等优势，已成功地应用于保湿型化妆品。这些预示着胶原蛋白肽将有非常广阔的市场前景。
目前胶原蛋白活性肽的获得方法包括从天然生物体中提取、通过化学方法和重组 DNA技术合成、体外水解蛋白质等。然而天然产物中活性肽含量很少，只能提取用于试验研究；化学合成法成本高，副产物对人体有害；重组DNA技术合成法多用于生产长肽和蛋白质，而许多活性肽却是短肽。所以体外水解蛋白质成为获得活性肽的有效方式。随着酶制剂工业的迅猛发展，酶法水解比传统的酸水解、碱水解法更为温和、安全、专一，不仅降解时间短，产品营养流失较少，而且无环境污染。目前市场常用的小肽制备的酶有植物性蛋白酶 (木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶)、细菌性蛋白酶(枯草杆菌的碱性蛋白酶、中性蛋白酶)、动物蛋白酶(胰酶、胶原酶)等；但是目前尚没有深海来源的细菌胶原蛋白酶在胶原小肽制备中的应用的报道。发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用海洋胶原蛋白酶MCP-Ol制备胶原蛋白小肽的方法。
术语说明
胶原蛋白小肽是指分子量小于IOOODa的肽段占85%以上的胶原蛋白肽。
一种利用海洋胶原蛋白酶MCP-Ol制备胶原蛋白小肽的方法，包括如下步骤
(I)将海洋胶原蛋白酶MCP-Ol溶于Tris-HCl缓冲液中，配成酶浓度为O. 3 O. 5mg/mL的酶液；
(2)按照重量体积比为18 22:1的比例将牛肌腱I型不可溶胶原蛋白加入酶液中，单位mg/ml，在45 50°C的水浴锅中反应24 26小时，在4°C条件下，13000转/分钟离心10 15min,制得胶原蛋白肽；
(3)上述胶原蛋白肽经过截留量为3000Da的超滤管超滤离心，收集下层滤过物， 即制得胶原蛋白小肽。
根据本发明优选的，所述步骤(I)中，Tris-HCl缓冲液浓度为50mM，pH9. O。
根据本发明优选的，所述步骤(I)中，酶液中酶浓度为O. 4mg/mL。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，牛肌腱I型不可溶胶原蛋白与酶液的重量体积比为20:1。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，反应条件为50°C的水浴锅中反应24小时。
本发明的优良效果
本发明根据海洋细菌胶原蛋白酶MCP-Ol催化结构域的特点，设计最佳降解条件，使海洋胶原蛋白酶MCP-Ol高效降解胶原蛋白，产生的胶原蛋白肽分子量大部分低于 IOOOODa,制得的胶原蛋白小肽中分子量小于IOOODa的肽段占85%以上，从而使其降解产物在医药、食品、化妆品等高附加值领域中具有巨大的应用潜力。
图1. SDS-PAGE分析MCP-Ol催化结构域的异源表达的电泳图2. SDS-PAGE分析纯化的重组酶纯度的电泳图3. Tricine-SDS-PAGE检测重组MCP-01催化结构域降解胶原蛋白的电泳图；
图4. HPLC分析重组MCP-Ol催化结构域降解胶原蛋白的高压液相峰值图；其中A，对照；B，海洋胶原蛋白酶MCP-Ol在50°C酶解胶原蛋白24h ;C，海洋胶原蛋白酶MCP-Ol在27°C酶解胶原蛋白24h。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
E. coli DH5a、E.coli BL21 (DE3)菌株购自 TransGen Biotech ；
pET_22b ( + )表达载体购自 Novagen ;
PCR 扩增试剂均购自 TransGen Biotech ；
限制性内切酶及连接酶Solution I购自Takara ;
细菌基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；
DNA胶回收试剂盒购自Omega ;
所用抗生素氨苄青霉及诱导剂IPTG购自Merck ；
从牛肌腱中分离的I型不可溶胶原蛋白，购自Worthington Biochemical Co.；
乙腈购自TEDIA公司；甲酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司；
培养基配制原料均为本领域常用原料，可市场购得；
DNA测序在北京博尚生物技术有限公司完成；
引物合成在华大基因完成；液质联质谱分析在北京华大蛋白质公司完成；
深海适冷菌假交替单胞菌株(Pseudoalteromonas sp. ) SM9913,购自中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO:M2010223。
培养基配方
海水LB液体培养基蛋白胨lwt%，酵母粉O. 5wt%,人工海水配制，pH7. 5。
淡水LB液体培养基蛋白胨lwt%，酵母粉O. 5wt%, NaCllwt%,蒸馏水配制，pH7. 5。
淡水LB固体培养基蛋白胨lwt%，酵母粉O. 5wt%，NaCllwt%，琼脂1. 5wt%，蒸馏水配制，PH7.5。
半海水LB液体培养基蛋白胨lwt%，酵母粉O. 5wt%, 50wt%的人工海水配制， ρΗ7· 5。
实施例1:海洋胶原蛋白酶MCP-Ol催化结构域的重组表达及分离纯化
1、海洋胶原蛋白酶MCP-Ol催化结构域基因片段克隆及重组表达载体构建
按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取Pseudoalteromonas sp. SM9913基因组 DNA，根据本实验已克隆的MCP-Ol的基因序列(GenBank accessionNo. :DQ371965)在CDD数据库分析结果，设计如下两条引物
A :5’ ~GCTTGGACCATATGAAAACAAAATTATCTATT~3/，划线处为 Nde I 酶切位点。
B :5，-CGCGCTCGAGAAAGCCTGGAGTTGGATCA-3'，划线处为 Xho I 酶切位点。
经PCR扩增得到1350bp核酸条带，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码氨基酸 450个，其表达的重组酶命名为⑶。试剂盒回收DNA条带并利用限制性内切酶Nde I及 Xho I双酶切后连接到同样酶切过的pET-22b ( + )载体上，构建得到表达质粒。按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组质粒转至大肠杆菌DH5 α感受态细胞，挑取转化子酶切验证后送测序，测序验证正确的重组菌做甘油管_80°C保存。
2、海洋胶原蛋白酶MCP-Ol催化结构域在E. coli BL21 (DE3)中的异源表达
将构建好的表达质粒按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法转化至表达菌株 E. coliBL21 (DE3)中，在含有终浓度100微克/毫升氨苄青霉素的淡水LB固体培养基培养，挑选重组菌。将挑选的重组菌接种至含有终浓度100微克/毫升氨苄青霉素淡水LB液体培养基，在37° C下培养至0D_=0. 6^0. 8时，加入1. OmM IPTG，诱导4小时，SDS-PAGE分析表达情况。结果表明，胶原蛋白酶MCP-01催化结构域能在E. coli BL21 (DE3)中大量表达(图1)。
3、海洋胶原蛋白酶MCP-01催化结构域的诱导表达
将重组菌接种于含有终浓度100微克/毫升氨苄青霉素的半海水LB液体培养基中，37°C培养重组菌至菌体浓度为0D_=2. 0，每100毫升培养基加入终浓度为0. 05mM的 IPTG作为诱导剂，在15°C，200rpm条件下培养7天。
4、重组蛋白酶⑶的分离纯化
按照3所述条件在15°C下发酵培养I升的重组菌，离心收集发酵液。将发酵液经过50mMTris_HCl (pH9. O)缓冲液透析过夜,经过DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱进行分离。SDS-PAGE分析纯度，收集纯度较高的部分。将收集的样品浓缩约10倍，通过 Superdex75凝胶过滤层析柱进行进一步分离纯化,收集经SDS-PAGE鉴定为单带的活性部分，即最终纯化的重组酶⑶(图2)。
实施例2
一种利用海洋胶原蛋白酶MCP-Ol制备胶原蛋白小肽的方法，具体包括如下步骤
(I)将海洋胶原蛋白酶MCP-Ol溶于Tris-HCl缓冲液中，Tris-HCl缓冲液浓度为 50mM、pH9. O,配成酶浓度为O. 4mg/mL的酶液；
(2)按照重量体积比为20:1的比例将牛肌腱I型不可溶胶原蛋白加入酶液中，单位mg/ml，在500C的水浴锅中反应24小时，在4°C条件下，13000转/分钟离心10 15min， 制得胶原蛋白肽；
(3)上述胶原蛋白肽经过截留量为3000Da的超滤管超滤离心，收集下层滤过物， 即制得胶原蛋白小肽。
对比例I
如下步骤
(I)将海洋胶原蛋白酶MCP-Ol溶于Tris-HCl缓冲液中，Tris-HCl缓冲液浓度为 50mM、pH9. O,配成酶浓度为O. 4mg/mL的酶液；
(2)按照重量体积比为20:1的比例将牛肌腱I型不可溶胶原蛋白加入酶液中，单位mg/ml，在27°C的水浴锅中反应24小时，在4°C条件下，13000转/分钟离心10 15min， 制得酶解溶液。
(3)上述酶解溶液经过截留量为3000Da的超滤管超滤离心，收集下层滤过物，即制得胶原蛋白小肽。
对比例2
如下步骤
(I)将海洋胶原蛋白酶MCP-Ol溶于Tris-HCl缓冲液中，Tris-HCl缓冲液浓度为 50mM、pH9. O,配成酶浓度为O. 4mg/mL的酶液；
(2)按照重量体积比为20:1的比例将牛肌腱I型不可溶胶原蛋白加入酶液中，单位mg/ml，在50°C的水浴锅中反应10小时，在4°C条件下，13000转/分钟离心10 15min， 制得酶解溶液。
结果分析
1、胶原蛋白肽的电泳检测
常规的SDS-PAGE方法多用来分析分子量在15 200kDa的蛋白质，而对于分子量小于IOkDa的多肽分离效果差。本发明利用改良的Trinice-SDS-PAGE方法分析MCP-Ol酶解胶原蛋白后肽段的分子量分布。
改良的Tricine-SDS-PAGE凝胶配制及检测方法如下
每个凝胶分为三层，从上至下依次为浓缩胶、夹层胶及分离胶；加大分离胶的浓度，并在分离胶中加入质量百分比为20%的甘油，整个电泳过程均在低温条件下进行。 Tricine-SDS-PAGE具体配方见表I。其中G_B(3X)为用去离子水溶解36. 3g Tris,O. 3g SDS，用lmol HCl滴定至pH8.45，再加水定容至100mL。3C丙烯酰胺储存液为48%丙烯酰胺和1. 5%甲叉丙烯酰胺，用去离子水溶解。6C丙烯酰胺储存液为48%丙烯酰胺和3. 0%甲叉丙烯酰胺，用去离子水溶解。
将实施例2制得的胶原蛋白肽、对比例I和对比例2制得的酶解溶液与6X SDS-PAGE载样缓冲液混匀，沸水煮5分钟，10000转/分钟离心20秒，根据凝胶的厚度，每上样孔加样15 30微升；凝胶之间加入负极电泳缓冲液(O.1M Tris+0.1MTricine+0. lwt%SDS),电泳槽底部加入正极电泳缓冲液(O. 2M Tris-HCl, pH8. 9),电泳分离条件为用30V的电压预电泳10分钟再上样；进样以后，先用50V电压压胶，当染料进入夹层胶后，电压加到150V，继续电泳直到溴酚蓝抵达分离胶底部时停止电泳。整个电泳过程在冰上或4°C进行。
表 I
权利要求
1.一种利用海洋胶原蛋白酶MCP-Ol制备胶原蛋白小肽的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将海洋胶原蛋白酶MCP-Ol溶于TriS-HCl缓冲液中，配成酶浓度为O.3 O. 5mg/ mL的酶液；(2)按照重量体积比为18 22:1的比例将牛肌腱I型不可溶胶原蛋白加入酶液中，单位mg/ml，在45 50°C的水浴锅中反应24 26小时，在4°C条件下，13000转/分钟离心 10 15min,制得胶原蛋白肽；(3)上述胶原蛋白肽经过截留量为3000Da的超滤管超滤离心，收集下层滤过物，即制得胶原蛋白小肽。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中，Tris-HCl缓冲液浓度为 50mM，pH9.O。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中，酶液中酶浓度为O.4mg/mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，牛肌腱I型不可溶胶原蛋白与酶液的重量体积比为20:1。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应条件为50°C的水浴锅中反应24小时。
全文摘要
本发明涉及一种利用海洋胶原蛋白酶MCP-01制备胶原蛋白小肽的方法，包括如下步骤(1)将海洋胶原蛋白酶MCP-01溶于Tris-HCl缓冲液中，配成酶浓度为0.3～0.5mg/mL的酶液；(2)将牛肌腱I型不可溶胶原蛋白加入酶液中，在水浴锅中反应，在4℃条件下，离心后超滤，制得胶原蛋白小肽。本发明根据海洋细菌胶原蛋白酶MCP-01催化结构域的特点，设计最佳降解条件，使海洋胶原蛋白酶MCP-01高效降解胶原蛋白，产生的胶原蛋白小肽分子量小于1000Da的肽段占85%以上，从而使其降解产物在医药、食品、化妆品等高附加值领域中具有巨大的应用潜力。
文档编号C12P21/06GK102994601SQ201210540438
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者张玉忠, 冉丽媛, 王磊, 刘德华, 陈秀兰, 宋晓妍, 秦启龙, 苏海楠, 周百成 申请人:山东大学