专利名称：一株酿酒酵母及其在干红葡萄酒酿造中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一株酿酒酵母菌株及其在发酵特色优质干红葡萄酒中的应用。
背景技术：
红葡萄酒是以新鲜葡萄为原料经酵母发酵酿制而成的饮料酒。葡萄酒酿造是一个复杂的微生物学过程，其中由酵母菌主导的酒精发酵是葡萄酒生产最重要的阶段之一。酵母菌的生物多样性及微生物群体组成不仅对葡萄酒的风味、口感等感观质量具有重要影响，而且会直接影响葡萄酒的产量、质量、经济性及发酵性能管理，对葡萄酒的特色及风格形成有至关重要的影响。一株好的酿酒酵母菌株不但能提高葡萄酒品质，还能缩短发酵周期和降低生产成本，进而提高企业的竞争优势和获利能力。国内对葡萄酒酵母的研究和生产起步较晚，我国果酒用商业酵母的研究开发，以始于1986年的安琪酵母为代表，但由于产品种类少，专业化程度远远不能满足生产需求，因而在葡萄酒行业应用很少。目前国内葡萄酒行业大多使用进口葡萄酒活性干酵母进行生产，多来自欧美等国，价格昂贵。长期使用进口葡萄酒活性干酵母进行葡萄酒生产，不仅让企业和国家损失大量外汇，更为重要的是会影响中国本土区域化特色葡萄酿酒酵母菌的生物多样性，对自然发酵菌种产生相当的抑制作用，使得由自然发酵产生的风味和香气物质消失，最终导致产品的同质化，缺乏地域特征。因此，加强我国本土葡萄酒酵母菌资源的开发与利用，进行中国原产地葡萄酒相关酵母及野生葡萄酒酵母的研究，选育适合中国各区域葡萄原料发酵的特色葡萄酒酵母，对于生产具有中国本土地区特色的优质葡萄酒，创造中国特色的地方名牌葡萄酒(形成葡萄酒中的“茅台、五粮液、西凤”)，促进中国葡萄酒产品差异特色化及中国葡萄酒特质文化的形成；打破国外葡萄酒辅料商垄断中国市场，降低葡萄酒生产成本，促进我国葡萄酒产业的健康发展具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株适用于中国各地区红葡萄原料发酵的特色酿酒酵母菌株。该菌株也可用于蓝莓酒、枣酒等各种特色高端果露酒及各种普通果酒的酿造。本发明一方面提供了一种酿酒酵母WRl 104(Saccharomyces cerevisiaeffR1104),于2012年12月5日保藏在位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 CCTCC NO:M 2012500。本发明一方面提供了上述酿酒酵母在酿制特色优质干红葡萄酒中的应用。本发明还提供了上述酿酒酵母在酿制蓝莓酒、枣酒等各种果露酒中的应用。本发明的酿酒酵母抗逆性强，耐高糖，耐高温，耐高酒精，耐渗性好，产酒精度高，可广泛应用于中国产区各个特色红葡萄品种的优质干红葡萄酒的酿制。本发明的酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄原料酿制而成的新酒比商业酵母RC212发酵的新酒澄清度更好， 香气更加浓郁、柔和、愉快，新酒挂壁感、口感醇厚度更优；发酵赤霞珠葡萄原料酿制而成的新酒比商业酵母RC212发酵的新酒澄清度更好，香气更加浓郁协调，口感更加醇厚、挂壁感更好。本发明的酿酒酵母也适合于西拉、蛇龙珠等红葡萄品种的发酵，也可用于蓝莓酒、枣酒等特色高端果露酒的发酵及普通果酒的酿制。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步详细说明。下述实施例中各培养基的配方如下:Yro 培养基:酵母粉 10g/1000ml，蛋白胨 20g/1000ml，葡萄糖 20g/1000ml，自然 pH值、115°C、20min高压灭菌。固体培养基加入20g/1000ml琼脂粉。WL琼脂培养基:酵母粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，琼脂2%，磷酸二氢钾0.055%,氯化钾0.0425%,氯化钙0.0125%,氯化铁0.00025%,硫酸镁0.0125%,硫酸锰
0.00025%，溴甲酚绿 0.0022%, pH 值为 6.5，121°C、20min 高压灭菌。赖氨酸培养基(1-1):D-葡萄糖10g，L-组氨酸lmg，DL-蛋氨酸2mg，DL-色氨酸2mg,对-氨基苯甲酸200Pg,生物素20Pg,叶酸2Pg,肌醇IOmg,烟酸400Pg,泛酸2mg,盐酸批哆醇40(^g，核黄素20(^g，盐酸硫胺素40(^g，硼酸50(^g，结晶氯化铜4(^g，碘化钾lOOPg，结晶氯化铁20(^g，结晶硫酸锰40(^g，结晶钥酸钠20(^g，结晶硫酸锌40(^g，磷酸二氢钾850mg,磷酸氢二钾150mg,结晶硫酸镁500mg氯化钠IOOmg,结晶氯化I丐IOOmg,赖氨酸盐酸盐2.5g，琼脂20g, pH值自然，121°C、20min高压灭菌。糖发酵培养基、同化氮源基础培养基、同化碳源基础培养基、产酯培养基、产生类淀粉化合物培养基、高渗透压培养基均采用常规配方。实施例1酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WR1104的分离纯化与筛选1、出发菌株的选育(I)果表酵母分离无菌称量IOg成熟葡萄，放入盛有90ml无菌水三角瓶，震荡培养30min，制成菌悬液，准确吸取50ul放入YPD固体培养基，以无菌刮铲刮匀，25°C培养24-28h ；(2)自然发酵酵母分离无菌称量约IOOg新鲜成熟度好的葡萄，放入无菌500ml三角瓶，以无菌研锤破碎，置于27°C培养，每隔24h取发酵液1ml，加入9ml无菌水中进行梯度稀释至10_7，取50ul稀释后菌液放入YPD固体培养基，以无菌刮铲刮匀，25°C培养24-28h ；(3 )对(I)(2 )中Yro培养48h的酵母菌株，挑取培养基中长出的肉眼可见的真菌菌落，分别移入YPD固体平板培养基上，恒温培养、纯化直至得到单菌落后，转接至斜面试管作为出发菌株，得到301株菌。2、酵母菌株初筛(I)镜检初筛对斜面试管菌株在YPD液体培养基中培养48h，以16 X 40倍显微镜镜检，筛选出以多端出芽繁殖的菌株，得到123株菌；(2)WL琼脂培养基筛选将镜检筛选出的菌株，接种YPD液体培养基活化24h后接种到WL琼脂培养基，27°C培养5d后观察，筛选出菌落颜色为奶油色(浅黄色)-绿色，球形突起的表面光滑、不透明、 奶油状的菌株，得到62株菌；
(3)菌株发酵力及产香特性筛选将WL培养基筛选出的菌株，接种到倒扣杜氏管的YPD液体试管培养基中，27 °C培养，检测4h、6h、8h、IOh的产气情况(以产气至杜氏管体积计发酵力)和产香特性(分为有异味、香气淡、香气稍好、香气浓郁四个级别)，筛选出IOh内产气满管、产香不错或产香浓郁的菌株，得到36株菌。3、模拟酒精发酵复筛将上述得到的36株菌株接种到含糖20%的IOOmlYPD液体摇瓶培养基中，27°C培养96h，检测模拟酒精发酵后的CO2失重量(g)、酒精度(％vol)及产香情况，筛选出发酵后CO2失重量在IOg以上，酒精度在9%以上，产香较好或浓郁的菌株，得到24株菌。4、复筛得到酵母菌株耐高糖、耐高温、耐酒精、耐渗性等抗逆性评价及最 高产酒精度试验(I)酵母菌株耐高糖评价将模拟酒精发酵得到的24株菌同时接到含有600g/L葡萄糖YPD液体试管培养基和固体平板培养基上，27°C培养，观察液体试管培养48h的产气情况及固体平板培养96h的菌株存活情况和菌落生长情况，筛选出上述条件下存活并产气、菌落生长良好且菌落较大的菌株；(2)酵母菌株耐高温评价将模拟酒精发酵得到的24株菌采用50°C和55°C两个温度点处理，水浴培养12h后，观察供试菌株产气情况(均为产气)，然后点种到YPD平板上的28°C下培养48-72h，观察菌落生长情况，筛选出菌落生长良好且菌落较大的菌株；(3)酵母菌株耐酒精评价将模拟酒精发酵得到的24株菌分别接到YH)含有12%、16%,20%乙醇的液体试管培养基和含有12%、16%、20%乙醇的固体平板培养基上，27°C培养，观察液体试管培养48h的产气和存活情况及固体平板培养96h的菌落生长情况，筛选出上述条件下存活并产气、菌落生长良好且菌落较大的菌株；(4)酵母菌株耐渗性评价将模拟酒精发酵得到的24株菌分别接到YPD含有100g/L、120g/LNaCl的液体试管培养基和含有100g/L、120g/LNaCl的固体平板培养基上，27°C培养，观察液体试管培养48h的产气和存活情况及固体平板培养96h的菌落生长情况，筛选出上述条件下存活并产气、菌落生长良好且菌落较大的菌株(5)菌株最高产酒精度试验将模拟酒精发酵得到的24株菌接到120ml含20g/L糖度的含30%蔗糖西瓜汁发酵液中，27°C培养，检测发酵96h后的CO2失重量(g)、酒精度(%vol)及产香情况，筛选出发酵后产酒精度较高(13%以上)，产香较好或浓郁的菌株；综合(I)(2) (3) (4) (5)优筛，得到 12 株菌。5、优筛菌株模拟葡萄汁培养基发酵筛选把12株优筛菌株分别以I X 106CFU/mL接种量接种于400ml模拟红葡萄原料培养基(400mL玫瑰香葡萄破碎液，添加10%蔗糖)中，25°C模拟发酵静置培养25d左右，检测发酵酒样的CO2失重量(g)、酒精度(％vol)、总酸(以酒石酸计，g/L)、挥发酸(以乙酸计，g/L)、总糖(g/U、还原糖(g/L)等基本理化指标，并作产香香气分析和简单感官评价，筛选出整体表现优良的菌株，得到6株菌。6、菌株以梅鹿辄、赤霞珠葡萄原料4L发酵小试和400L发酵中试筛选6株菌以IX 106CFU/mL接种量分别接种于采自甘肃民勤县、武威市和青岛平度市、烟台蓬莱等地葡萄园的以蔗糖调糖度为20%的梅鹿辄、赤霞珠葡萄破碎液中，进行优筛菌种4L发酵小试实验和400L发酵中试实验，均以商业酵母法国拉曼公司的RC212作为对照菌株，25°C模拟发酵，25d左右(中试样品定期检测，后熟半年后进行专家感官品评)，检测发酵酒样的CO2失重量(g)、酒精度(％vol)、总酸(以酒石酸计，g/L)、挥发酸(以乙酸计，g/L)、总糖(g/L)、还原糖(g/L)等基本理化指标，并作产香香气分析和专家感官品评，筛选出整体表现突出的菌株，得到酵母菌株WRl 104，具体步骤如实施实例3所述。实施例2酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WR1104菌株的鉴定1、赖氨酸培养基鉴定(酿酒酵母不能采用赖氨酸作为氮源因而在该培养基上不能生长)将酵母菌株WRl 104接种YPD液体培养基活化24h后，按照1%接种量接种到5mL无菌水中进行饥饿处理，7d后接种到赖氨酸培养基，27°C培养5d后观察没有酵母生长，继续培养和观察，直到15d后仍无菌落生长，说明该菌株是酿酒酵母。2、生理生化鉴定将酵母菌株WR1104分别接种到各培养基上进行糖发酵(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、核糖、菊糖)、碳源同化(鼠李糖、L-阿拉伯糖、肌醇、纤维二塘、可溶性淀粉、菊糖、甲醇、D-木糖、山 梨糖、柠檬酸)、氮源同化(硫酸铵、天门冬素、硝酸钾、亚硝酸钠、L-赖氨酸)、产生类淀粉及产酯、耐渗透压等生理生化鉴定，以商业酵母RC212作为对照，结果如下:表I酵母菌株糖发酵鉴定结果
权利要求
1.一株酿酒酵母，其保藏编号为CCTCC NO: M 2012500。
2.权利要求1所述的酿酒酵母在葡萄酒酿制中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的葡萄酒为红葡萄酒。
4.权利要求1所述的酿酒酵母在果露酒酿造中的应用。
5.如权利要求4所述的 应用，其特征在于所述的果露酒为蓝莓酒或枣酒。
全文摘要
本发明提供了一株酿酒酵母，保藏编号为CCTCC NO: M 2012500。该酿酒酵母抗逆性强，耐高糖，耐高温，耐高酒精，耐渗性好，产酒精度高，可广泛应用于中国产区各个特色红葡萄品种的优质红葡萄酒的酿制，也可用于蓝莓酒、枣酒等各种特色高端果露酒及普通果酒的酿制。本株酿酒酵母发酵梅鹿辄葡萄原料酿制而成的新酒比商业酵母RC212发酵的新酒澄清度更好，香气更加浓郁、柔和、愉快，新酒挂壁感、口感醇厚度更优；发酵赤霞珠葡萄原料酿制而成的新酒比商业酵母RC212发酵的新酒澄清度更好，香气更加浓郁协调，口感更加醇厚、挂壁感更好。本发明的酿酒酵母亦适合于西拉、蛇龙珠等红葡萄品种的发酵，也可用于蓝莓酒、枣酒等各种特色高端果露酒的发酵及普通果酒的酿制。
文档编号C12R1/865GK103215195SQ20121054998
公开日2013年7月24日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者杨晓英, 刘天明, 刘鲁民 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司