专利名称：与黄瓜苦味性状相关的snp标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种与黄瓜苦味性状相关的SNP标记及其应用。
背景技术：
黄瓜的苦味是由一类称为葫芦素C的三萜化合物导致的。黄瓜果实中积累葫芦素C会严重影响黄瓜的商品品质。早期的经典遗传试验发现黄瓜的苦味有Bi和Bt两个基因控制。Bi基因主要控制叶片苦味，Bt基因主要控制黄瓜果实苦味。其中隐性bi基因对Bt基因具有上位效应。但到目前为止，Bi和Bt基因均未被克隆出来。育种学家们为了避免苦味对黄瓜品质的干扰，在育种过程中往往依靠品尝或是经验等主观评价方式来鉴定黄瓜 品种的苦味。此外，黄瓜叶片或果实的葫芦素C含量也可以用HPLC进行准确测量，据此判断黄瓜是否具有苦味。依靠经验或品尝等主观评价方式来判断黄瓜是否具有苦味非常不科学，受个体差异影响较大，不同个体对苦味的反应不尽相同，难以确保结果准确。而利用HPLC测量葫芦素C的方法结果虽然准确，但测量费用高且样品准备繁琐。育种学家们在选育不苦育种材料时需对成千上万的材料进行鉴定，没有可操作性，因此该方法一直没有被采用，仅用于小规模的科学研究。随着分子数量遗传学、分子生物学技术的飞速发展，有关分子遗传标记和标记辅助选择的研究被广泛开展，并在植物育种中应用，产生了巨大的影响。dCAPS (衍生的酶切扩增多态性序列，derived cleaved amplified polymorphic sequences)是在 PCR 技术基础上发展起来的，其基本原理是用PCR扩增目的DNA片段，通过在扩增引物中引入错配碱基，结合SNP位点引入新的限制性内切酶作用位点，用特异性限制性内切酶消化切割成不同大小片段，直接利用凝胶电泳图进行分析。用dCAPS法可以将几乎所有的SNP位点转化成以PCR为基础的分子标记。分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良作物的重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分子育种为农作物育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在农作物育种中的作用将日益突出。在黄瓜育种中，人们希望选择与黄瓜苦味性状密切相关的DNA标记，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而加快遗传育种进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种与黄瓜苦味性状相关的SNP标记及其应用。本发明的另一目的是提供用于检测所述与黄瓜苦味性状相关的SNP标记的引物对及含有该引物对的试剂盒。为了实现本发明目的，本发明首先提供一种黄瓜Csa6G088690蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明还提供编码所述Csa6G088690蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。本发明还提供含有编码所述Csa6G088690蛋白的基因的载体。本发明还提供含有编码所述Csa6G088690蛋白的基因的转基因细胞系。本发明还提供含有编码所述Csa6G088690蛋白的基因的工程菌。本发明还提供含有编码所述Csa6G088690蛋白的基因的转化植物细胞。
本发明还提供编码所述Csa6G088690蛋白的基因在葫芦素合成中的应用。本发明还提供编码所述Csa6G088690蛋白的基因在调控黄瓜苦味性状中的应用。进一步地，本发明提供一种与黄瓜苦味性状相关的SNP标记，其位于黄瓜Csa6G088690基因序列第1178bp处，此处碱基为G的黄瓜苦味，此处碱基为A的黄瓜不苦。本发明还提供用于检测上述与黄瓜苦味性状相关的SNP标记的引物对，包括正向引物 F5’ -GAAGATGAAAATAGTCGATATAGAT-3’和反向引物 R5’ -ATGATATGAATTGCTAGCTAGTTCT-3，。本发明还提供上述与黄瓜苦味性状相关的SNP标记在鉴定苦味黄瓜品种中的应用，其包括步骤I)提取待测黄瓜的基因组DNA ；2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用上述引物对F和R，进行PCR扩增反应；
3 )检测PCR扩增产物。其中，PCR反应使用的扩增体系以20 μ I计为10_20ng/ μ I模板DNAl μ 1，lOpmol/μ I 引物 F 和 R 各 I μ 1，10mmol/L dNTP mix O. 4 μ I，O. 5U/μ L TaqDNA 聚合酶0.3μ , 10XPCR反应缓冲液2 μ 1，余量为水。PCR反应条件为94 V 5分钟；94 V 20秒，55 V 20秒，72 V 30秒，35个循环；72 °C 10 分钟。步骤3)采用dCAPS法，具体为用内切酶EcoR V对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条208bp大小的条带，则待测黄瓜属于苦味黄瓜品种，检测结果为一条182bp大小的条带，则待测黄瓜属于普通品种。本发明还提供含有上述引物F和R的用于检测黄瓜苦味性状的试剂盒。优选所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选所述试剂盒还包括标准阳性模板。本发明提供了一种与黄瓜苦味性状相关的SNP标记及其应用，即根据基因型进行苦味或不苦黄瓜品种的选育，从而加快黄瓜的育种进程。首先对114份黄瓜核心种质材料进行重测序分析，同时对这114份材料进行苦味表型鉴定。采用全基因组关联分析(GffAS )的方法，从100万个SNP中找到了一个与苦味表型相关的SNP位点(图1)。该SNP位点位于编码Csa6G088690蛋白的基因序列第1178bp处，G突变为A，该突变导致Csa6G088690蛋白的393位氨基酸从半胱氨酸变为酪氨酸。即102份苦的黄瓜材料在该位点都是G，12份不苦的黄瓜在该位点都是A。为了进一步验证该SNP与苦味性状的相关性，采用叶片苦的黄瓜9930与叶片不苦的黄瓜9110GT构建了一个由1800个单株组成的F2群体。用酶切的方法对1800个单株的表型进行鉴定，结果显示该SNP位点完全与苦味表型连锁(图2)，符合预期。进一步分析发现，黄瓜Csa6G088690蛋白与西葫芦中的CPQ具有很高的同源性，CPQ能够环化氧化角鲨烯生成葫芦2烯醇，是合成葫芦素通路中的关键步骤。此外，Csa6G088690基因在黄瓜第6号染色体上的位置正好位于Bi基因所处的区域。根据以上结果，推测Csa6G088690基因很可能就是之前一直寻找的控制黄瓜苦味的Bi基因，而突变的Csa6G088690 (C393Y)即bi基因。为了证实这一推论，发明人利用酵母和烟草外源表达系统，对Csa6G088690基因的功能进行鉴定，结果发现，Csa6G088690蛋白能够环化氧化角鲨烯生成葫芦2烯醇，而突变的Csa6G088690 (C393Y)完全丧失了环化酶的功能。另一方面，发明人进行了转基因恢复试验，将正常的Csa6G088690基因转入不苦的黄瓜材料中，转化后该材料变苦，LC-q-TOF检测有苦味生成。综上所述，Csa6G088690即Bi基因，控制着黄瓜苦味合成通路中的关键步骤。本发明可替代传统的以主观方式判断黄瓜是否具有苦味的方法，完全排除人为因素的影响，使结果更加准确可靠。比采用HPLC鉴定苦味物质更简单、便捷，可用于大规模筛选育种材料，大大加快黄瓜的育种进程。
图1为本发明利用GWAS分析方法从100万个SNP中筛选到与黄瓜苦味相关联的SNP，用圆圈标记。该SNP位点位于黄瓜第6号染色体的Csa6G088690基因上。图2为本发明用dCAPS法检测1800个黄瓜单株组成的F2群体，对SNP与苦味的关系进行进一步验证；其中，M为DNA Marker,苦表示叶片具有苦味的单株。图3为本发明利用酵母表达系统验证Csa6G088690的功能；其中，A图为GC分析结果，可以看出在表达Csa6G088690的酵母(c)有葫芦2烯醇生成，箭头所指，位置与标样(d)吻合；B图中该特异峰的MS结果也与标样一致；而表达突变的Csa6G088690 (b)和空载体的酵母(a)均无葫芦2烯醇生成。图4本发明利用烟草表达系统验证Csa6G088690的功能。LC-q-TOF结果显示表达Csa6G088690的烟草样品(a)中有葫芦2烯醇生成，而空白对照(b)中无葫芦2烯醇产生。图5本发明利用转基因技术将Csa6G088690基因转入不苦黄瓜导致黄瓜变苦。LC-q-TOF结果显示有5个转基因株系有葫芦素C生成。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York:Gold Spring HarborLaboratory Press, 1989)。实施例1与黄瓜苦味性状相关的SNP标记的获得从世界各地收集了 3000多份黄瓜资源，从其中挑选114份作为黄瓜核心种质资源，它们代表了 80%的遗传多样性。对每份资源进行重测序，产生5G左右的数据量，平均覆盖IOx的黄瓜基因组。同时还对这114份种质资源进行了苦味表型鉴定。利用Yu J (YuJ,等(2005). Nature genetics 38 (2) : 203-208)和 Zhang ZCZhang Z,等(2010) · Naturegenetics 42(4) :355-360)中描述的方法，根据Mixed Liner模型，采用TASSEL软件进行GffAS分析，从100万个SNP中找到了一个与苦味表型相关的SNP位点(图1)。该SNP位点位于编码Csa6G088690蛋白的基因第1178bp处，G (叶片苦味)突变为A (叶片不苦)，该突变导致Csa6G088690蛋白的393位氨基酸从半胱氨酸变为酪氨酸。1.1目的片段和SNP位点的获得以及PCR-dCAPS分型(I)扩增含SNP位点的核苷酸片段包括正向弓丨物F 5’ -GAAGATGAAAATAGTCGATATAGAT-3’ 和反向引物 R5’ -ATGATATGAATTGCTAGCTAGTTCT-3’，扩增出待测 SNP 所在的核苷酸片段，如 SEQ ID NO. 3所示。该SNP位点位于该PCR扩增片段的26bp处，该处碱基可以为G或A，当该处碱基为A时，可被EcoRV内切酶(识别序列为GATATC)识别。
其中，PCR反应体系以 20 μ I 计为10-20ng/μ I 模板 DNA I μ 1，IOpmol/μ I 引物F和 R各 1μ l，10mmol/L dNTP mix O. 4 μ 1，O. 5U/μ L TaqDNA 聚合酶 0.1山10父？0 反应缓冲液2 μ I,余量为水。 PCR反应条件为94 V 5分钟；94 V 20秒，55 V 20秒，72 V 30秒，35个循环；72 °C 10 分钟。(2)针对第26位碱基的不同选择适当的内切酶进行PCR-dCAPS所得PCR产物用EcoRV内切酶酶切，反应体系以20 μ I计为IOU/μ LEcoRV内切酶 O. 5 μ 1，10ΧΝΕΒ 缓冲液 2 μ 1,10 μ g/μ I 100XBSA0. 2μ 1，PCR 产物 12 μ 1，余量为水。反应条件为37°C温育4小时。然后，将得到的酶切产物在琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，于凝胶成像系统中观察。1. 2基因型判定及苦味性状关联分析根据PCR-dCAPS的结果判定该位点在检测群体中的基因型。当扩增片段的26bp处碱基均为A时，EcoRV内切酶可识别该位点，即可将PCR扩增片段切开，电泳可见182bp较小的条带，该基因型记为bi型；当26bp处的碱基都为G时，EcoRV内切酶不可识别，即PCR扩增片段不能被切开，电泳可见208bp较大的条带，该基因型记为Bi型；当26bp处既含有G碱基又含有A碱基时，即凝胶电泳中含有两条带，长度分别为182bp和208bp，该基因型记为杂合型Bibi型(图2)。实施例2黄瓜不同基因型与苦味性状的关联分析及检测应用采用叶片苦的黄瓜9930 (BiBi)与叶片不苦的黄瓜9110GT (bibi)为亲本，构建了一个由1800个单株组成的F2群体。按照实施例2的方法，对1800个F2黄瓜群体进行了 PCR-dCAPS鉴定，PCR扩增序列如SEQ ID NO. 2所示，对扩增序列26bp位点的分析结果如表I和图2所示。表ISNP位点在1800个F2黄瓜群体中的分离情况
由表I可知，苦的黄瓜和不苦的黄瓜比例大约为3，苦味相对不苦是显性，F2后代符合3:1的分离预期，表明该SNP与黄瓜苦味性状连锁。实施例3黄瓜Csa6G088690基因的获得首先制备黄瓜cDNA文库，然后利用正向引物5’-AGATTAAAAGTGGGAAAAG-3’和反向引物 5’ -CAGTTTTGAGCTACCC-3’ 进行 PCR 扩增。PCR反应体系以20 μ I计为10-20ng/y I模板I μ 1，IOpmol/μ I正向、反向引物各 1μ 1,10mmol/L dNTP mix O. 4 μ I，O. 5U/μ L 高保真 Taq DNA 聚合酶 I μ 1,10XPCR 反应缓冲液2 μ I,余量为水。PCR反应条件为94°C 5分钟；94°C 20秒，55 °C 20秒，72 °C 2分30秒，35个循环； 72 0C 10 分钟。将扩增得到的大小为2358bp (SEQ ID No. 2)的片段与T-载体(TAKARA)连接，测序确认没有突变。实施例4利用酵母表达系统验证Csa6G088690基因的功能利用引物5’ -CCCAAGCTTATGTGGAGATTAAAAGTGG-3’ 和 5’ -CGCGGATCCTTATTCAGTCAAAACTC-3’，将 Csa6G088690 和突变的 Csa6G088690 (C393Y)基因构建到表达载体 pYES2(InvitiOgen)上。并转化酵母菌，诱导酵母表达蛋白，收集、裂解酵母，然后用正己烷抽提蛋白，纯化后的蛋白用GC-MS (Agilent)进行检测。结果如图3所示。实施例5利用烟草表达系统验证Csa6G088690基因的功能利用引物5 ’ -CATGCCATGGATATGTGGAGATTAAAAGTGGGAA-3 ’和 5 ’ -ATAAGAATGCGGCCGCTTATTCAGTCAAAACTCGATGGGAA-3’，将 Csa6G088690 基因构建到双元载体 pBIN-Plus 上。利用化学转化导入农杆菌EA105中。将含有Csa6G088690基因的农杆菌培养至0D_约1. O左右，用注射器将农杆菌注入6周左右的烟草中。一周后收集烟草叶片，用甲醇提取叶片中的蛋白，然后进行LC-q-TOF (Agilent)检测。结果如图4所示。实施例6利用转基因技术验证Csa6G088690基因的功能利用转基因技术将Csa6G088690基因转入不苦黄瓜导致黄瓜变苦。采用农杆菌侵染黄瓜子叶的方法进行黄瓜转基因操作。具体操作参考Rajagopalan (Rajagopalan, P. A.和 R. Perl-Treves (2005). HortScience 40 (2) : 431-435)的方法。简述如下培养5-6天黄瓜子叶外植体在MS培养基(BA Img/1+AS 100 μ Μ)上预培养I天。将农杆菌摇至0D0. 6，离心收集，用1/2MS液体培养基稀释10倍侵染30min，无菌纸巾擦干，转入MS培养基中共培养3天,用无菌水洗3遍,然后用含Cb (500mg/l)的无菌水洗IOmin,转入MS筛选培养基上(BA lmg/1+Kan 5Omg/1+Cb 500mg/l), 10天后将外植体转移至装有MS筛选培养基的三角瓶中继续发芽。待芽长至2cm时移至MS生根培养基(BAlmg/1+Cb 250mg/l)中生根。最终将成熟的黄瓜苗移栽到大田里种植。采集生长正常的黄瓜叶片，用甲醇抽提蛋白，然后进行LC-q-TOF (Agilent)检测。结果如图5所示。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.黄瓜Csa6G088690蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
3.含有权利要求2所述基因的载体。
4.含有权利要求2所述基因的转基因细胞系。
5.权利要求2所述的基因在葫芦素合成中的应用。
6.—种与黄瓜苦味性状相关的SNP标记,其特征在于,其位于编码黄瓜Csa6G088690蛋白的基因序列第1178bp处，此处碱基为G的黄瓜苦味，此处碱基为A的黄瓜不苦；所述编码黄瓜Csa6G088690蛋白的基因序列如SEQ ID No. 2所示。
7.用于检测权利要求6所述与黄瓜苦味性状相关的SNP标记的引物对，其特征在于，包括正向引物 F5’ -GAAGATGAAAATAGTCGATATAGAT-3’和反向引物 R5’ -ATGATATGAATTGCTAGCTAGTTCT-3，。
8.权利要求6所述与黄瓜苦味性状相关的SNP标记在鉴定苦味黄瓜品种中的应用，其包括步骤 1)提取待测黄瓜的基因组DNA； 2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用权利要求7所述引物对F和R，进行PCR扩增反应; 3)检测PCR扩增产物； 其中，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以20iil计为10-20ng/iil模板DNAlyl，lOpmol/ii I 引物 F 和 R 各 Iii l，10mmol/L dNTP mix 0. 4 u 1,0. 5U/u L Taq DNA 聚合酶0.1(,11, 10XPCR反应缓冲液2 ill，余量为水； PCR反应条件为94°C 5分钟；94°C 20秒，55°C 20秒，72°C 30秒，35个循环；72°C 10分钟； 步骤3)中检测PCR扩增产物采用dCAPS法，具体为用内切酶EcoR V对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条208bp大小的条带，则待测黄瓜属于苦味黄瓜品种，检测结果为一条182bp大小的条带，则待测黄瓜属于普通品种。
9.含有权利要求7所述引物对的用于检测黄瓜苦味性状的试剂盒，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的一种或多种。
10.权利要求6所述与黄瓜苦味性状相关的SNP标记在黄瓜分子标记辅助育种中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种与黄瓜苦味性状相关的SNP标记及其应用，其位于编码黄瓜Csa6G088690蛋白的基因序列第1178bp处，此处碱基为G的黄瓜苦味，此处碱基为A的黄瓜不苦。本发明采用全基因组关联分析的方法(GWAS)筛选到与黄瓜苦味性状相关的SNP标记，并通过衍生的酶切扩增多态性序列(dCAPS)的方法来检测待测黄瓜的基因型，根据基因型进行苦味或不苦黄瓜品种的选育，从而加快无苦味黄瓜的育种进程。与传统的以主观方式判断黄瓜是否具有苦味的方法相比，结果更加准确可靠，比采用HPLC鉴定苦味物质更简单、便捷，可用于大规模筛选育种材料。另外，本发明首次发现黄瓜Csa6G088690蛋白控制着黄瓜苦味合成通路中的关键步骤。
文档编号C12N15/61GK103013966SQ20121055985
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者黄三文, 尚轶, 张忠华, 李颖, 马永硕, 齐建建, 王深浩, 王晔 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所