专利名称：：一种甘油解反应制备偏甘油酯的方法
技术领域：
：本发明涉及一种富含偏甘油酯的油脂生产方法。
背景技术：
：偏甘油酯是单甘油酯和甘油二酯的统称，甘油二酯和单甘油酯都是非常重要的食品添加剂。单甘油酯作为一种重要的乳化剂在食品、制药、化妆品行业等领域有广泛应用。甘油二酯功能性食用油是以天然食用油为原料、通过生物酶催化改性而成的新型油脂，具有明确的防止肥胖、降血脂等功能且食用安全，作为普通食用油的换代产品，在不改变现有饮食习惯的前提可以从根本上解决由于油脂的过量摄取引起的脂质过量积累。偏甘油酯的生产按催化剂的不同可分为化学法和酶法。化学法具有能耗大、反应产物易降解、分离提纯困难等缺点，不适于不饱和脂肪酸偏甘油酯的生产。利用酶催化制备甘油二酯，由于在温和条件下反应，不仅可减少能量的消耗及生产工艺对环境的影响，还可以得到产颜色、风味、口感等均具有良好品质的产品；更为重要的是，由于脂肪酶的生物活性及特异选择性高(立体和位置)，酶法甘油解反应副反应少，可获得特定结构的偏甘油酯产品。从脂肪酶的反应机制看，偏甘油酯的制备方法主要有甘油和脂肪酸酯化法，天然油脂的部分水解法以及甘油解法。脂肪酸与甘油在催化剂作用下进行酯化反应可以获得单甘油酯、甘油二酯，同时也可能得到副产物甘油三酯。但是，由于甘油和脂肪酸一般是经过天然油脂的高压水解制备而来，以二者为原料再经过酶法酯化反应制备甘油二酯，这一工艺路线在生产成本上要比油脂甘油解法高得多。甘油三酯的酶法水解法合成偏甘油酯的工艺路线在规模化应用时具有明显的弊端，首先，水解反应产生大量的副产物游离脂肪酸和一定量的甘油；其次，单甘油酯和甘油二酯在水解产物中的得率较低。甘油与甘油三酯在脂肪酶催化下反应，可以生成单甘油酯和甘油二酯，每摩尔油脂理论上可生成3mol的单甘油酯或1.5mol的甘油二酯。相比其他几种生产偏甘油酯的方法，甘油解途径具有原料来源广泛，易获得，而且底物利用效率高等优点，因此很多学者都从甘油解反应入手，研究酶法生产偏甘油酯的工业化方法。但是由于甘油与油脂的不互溶性以及无溶剂反应体系较高的黏度，酶催化的甘油解反应难以有效进行；虽然通过添加有机溶剂以及保持反应体系一定的含水量可以促进甘油解反应的进行，但是有机溶剂会给后续的溶剂回收带来成本压力并且会有溶剂残留的危险，而且反应体系中的水分会引起油脂的水解，产生与单甘油酯难以分离的脂肪酸。专利CN100376541C提供了一种酶法甘油解法合成甘油二酯的方法，该方法在加有甘油的反应系统中添加亲水性载体硅胶作为吸附剂使得甘油形成吸附态，从而克服了甘油对酶的包裹而带来的一系列问题，改善了脂肪酶的催化效果。尽管该方法大大改善了酶法甘油解的反应速度，但存在硅胶和固定化酶无法分离、硅胶自动粘结带来的搅拌困难、硅胶难以再生等缺点，产业化实施的困难很大。专利CN101397577A提供了一种利用酶法连续甘油解制备甘油二酯的方法，该方法以低沸点的单相有机溶剂为反应介质降低了反应黏度，提高了反应效率并对酶具有保护作用；但是该方法在反应体系中引入了有机溶剂，这就需要进行后续的溶剂回收操作，并且严格控制产品中的溶剂残留。过去的研究表明，脂肪酶催化的油脂反应需要一定量的水，这部分水作为底物或者作为维持脂肪酶活性构象所必需的水。专利US6337414B1提供了一种往反应体系中添加水顺利实现甘油解的酶反应方法，由于该方法中添加了水，也发生了水解反应，产物中产生了大量游离脂肪酸，增加了副反应产物分离和产品后续精炼的成本。因此开发无水，无溶剂体系的甘油解反应合成偏甘油酯可以获得高效、经济、环保的偏甘油酯生产工艺。
发明内容本发明的目的在于针对已有技术存在的缺点，利用大孔弱极性吸附树脂固定化脂肪酶LipaseTl,提供一种以疏水性材料为载体的固定化酶作催化剂,在无水、无溶剂体系下催化甘油解反应生产偏甘油酯的方法，该方法没有脂肪酸产生。甘油解产物经分子蒸馏后可以得到单甘油酯和富含甘油二酯的油脂产品，简化了后续的分离的工艺。本发明为实现上述目的通过以下技术方案实现一种甘油解反应制备偏甘油酯的方法，包括如下步骤(I)脂肪酶LipaseTl的固定化取510份质量经预处理的弱极性大孔吸附树脂、1020份质量的Tris-HCl缓冲液、O.Γ份质量的游离脂肪酶LipaseTl混合，在2535°C下搅拌吸附广2小时，然后过滤并干燥至水分含量不高于1%，得到疏水性树脂固定化的脂肪酶LipaseTl；(2)固定化脂肪酶催化油脂甘油解反应取10份质量的植物油、Γ4份质量的甘油混合加入至原料罐，搅拌均匀后不断通过装有固定化脂肪酶LipaseTl的填充柱并循环回原料罐，整个反应系统置于l(T500Pa的真空系统下中，在75、5°C下反应2飞个小时，得产物混合物；(3)分离所述产物混合物经离心分离，得到上层油相即为富含偏甘油酯的油脂，再经分子蒸馏分离得到单甘油酯和富含甘油二酯的产品。优选地，步骤(I)中所述大孔吸附树脂的预处理工艺为以95%乙醇浸泡24h，水洗至滤液不呈白色浑浊；以5%的HCl溶液浸泡2h，水洗至滤液呈中性；再以2%的NaOH溶液浸泡2h，水洗至滤液呈中性即可。优选地，所述步骤(I)中的TriS-HCl缓冲液浓度为O.05mol/L,pH为8.8。优选地，步骤(2)所述反应体系中的水分含量不超过O.1%。优选地,步骤(2)所述固定化脂肪酶LipaseTl的装填量为反应原料质量的110%。优选地，所述的植物油包括大豆油、菜籽油、花生油、玉米油、葵花籽油、棕榈油、棕榈仁油、椰子油、亚麻油、芝麻油、山茶籽油、橄榄油中的一种或一种以上的混合物。众所周知脂肪酶具有界面激活现象，在极性环境中脂肪酶的活性中心中被一个可移动的“盖子”遮蔽住，而“盖子”在底物与水的界面处打开，从而使酶的活性中心暴露出来，底物可以进入到此中心发生反应。不同的脂肪酶“盖子”打开的方式可能不一样，LipaseTl脂肪酶具有双“盖子”结构，一个是疏水性的α6螺旋，一个是半疏水半亲水性的α7螺旋，目前对于其盖子打开机制还处于研究中。本课题组研究发现将LipaseTl固定化后在自身含水量不高于1%时，用于含水量极低(O.1%以下)的甘油解反应体系中，甘油解反应效率非常高而且不产生游离脂肪酸，这可能与其独特的双盖子结构和盖子的打开机制有关。相对于目前大量使用的商品化的固定化脂肪酶(含水量25%)，以疏水性大孔弱极性吸附树脂为载体固定化的脂肪酶LipaseTl在较低含水量时，可以高效催化甘油解反应，相对于目前对于甘油解反应的研究，这是意想不到的。通过选择适宜的脂肪酶以及脂肪酶载体，采用适宜的反应参数可以使得油脂的甘油解反应在无水无溶剂体系下有效进行。相对于现有技术，本发明的有益效果在于(I)本发明所用的脂肪酶LipaseTl的热稳定性高，采用疏水性大孔吸附树脂固定化后可以在75、5°C的范围内，极低含水量、无溶剂环境下催化甘油解反应；避免了油脂的水解等副反应的发生，简化了反应产物的回收以及后续的分离工艺。(2)本发明在无溶剂体系、微水环境中进行甘油解反应，甘油解反应效率高，不产生游离脂肪酸，不产生副产物，产物中偏甘油酯含量高，固定化酶可以重复利用，因此本方法在工业上具有良好的应用前景。图1为本发明所使用的酶反应器催化油脂甘油解反应生产偏甘油酯的一种装置示意图。其中原料罐1、搅拌电机2、流量计3、泵4、填充床酶反应器5和压力表6通过管道依次连接。具体实施例方式以下通过实施例更详细地介绍本发明的实施。在所述实施例中，所有百分比均以质量计。疏水性大孔吸附树脂的预处理工艺为以95%乙醇浸泡24h，水洗2遍至滤液不呈白色浑浊；以5%的HCl溶液浸泡2h，水洗至滤液呈中性；再以2%的NaOH溶液浸泡2h，水洗至滤液呈中性，40C冰箱存放备用。`实施例1取500g经活化处理的大孔弱极性吸附树脂AB-8，IOOOg的Tris-HCl缓冲液(浓度0.05mol/L,pH8.8),20g的游离脂肪酶LipaseTl(LeowTC,RahmanRNZRA,BasriM,SallehAB.HighlevelexpressionofthermostablelipasefromGeobaciIIussp.strainTl[J].Bioscience,biotechnology,andbiochemistry2004；68(I):96-103.)混合，在30°C下搅拌吸附I个小时，然后过滤，真空干燥至水分含量为0.5%，得大孔吸附树脂固定化的脂肪酶LipaseT1，4°C冰箱保存备用。将9Kg精炼大豆油与IKg甘油加入原料罐I中，控制反应体系中的水分含量不超过0.1%，在磁力搅拌的情况下，如图1所示，反应物经泵4输送流经酶反应器5后回到原料罐I中，固定化脂肪酶LipaseTl的用量为300g，反应温度为80°C,整个反应系统置于压力为IOOPa的真空状态下,4小时后停止反应,反应产物经离心后取上层油相进行组成分析，甘油三酯含量为17.5%，甘油二酯含量为55.2%，单甘油酯的含量为27.3%。对油相进行分子蒸馏，分离混合物中的单甘油酯，得到的轻馏分中单甘油酯为97.6%，甘油二酯为2.3%;重相中甘油三酯为35.1%，甘油二酯为64.8%。实施例2取500g经活化处理的大孔弱极性吸附树脂AB-8，IOOOg的Tris-HCl缓冲液(浓度0.05mol/L,pH8.8),20g的游离脂肪酶LipaseTl混合,在30°C下搅拌吸附I个小时，然后过滤，真空干燥至水分含量为0.5%，得大孔吸附树脂固定化的脂肪酶LipaseT1，4°C冰箱保存备用。将9Kg精炼大豆油与1.84Kg甘油加入原料罐I中，控制反应体系中的水分含量不超过0.1%，在磁力搅拌的情况下，如图1所示，反应物经泵4输送流经酶反应器5后回到原料罐I中，固定化脂肪酶LipaseTl的用量为300g，反应温度为80°C，整个反应系统置于压力为50Pa的真空状态下，6小时后停止反应，反应产物经离心后取上层油相进行组成分析，甘油三酯含量为12.6%，甘油二酯含量为55.9%，单甘油酯的含量为31.5%。对油相进行分子蒸馏，分离混合物中的单甘油酯，得到的轻馏分中单甘油酯为97.5%，甘油二酯为2.4%;重相中甘油三酯为19.1%，甘油二酯为70.4%。实施例3取5Kg经活化处理的大孔弱极性吸附树脂AB-8，IOKg的Tris-HCl缓冲液(浓度0.05mol/L,pH8.8),IOOg的游离脂肪酶LipaseTl混合,在25°C下搅拌吸附I个小时，然后过滤，真空干燥至水分含量为0.6%，得大孔吸附树脂固定化的脂肪酶LipaseT1，4°C冰箱保存备用。将90Kg精炼大豆油与18.4Kg甘油加入原料罐I中，控制反应体系中的水分含量不超过0.1%，在磁力搅拌的情况下，如图1所示，反应物经泵输送流经酶反应器后回到原料罐I中，固定化脂肪酶LipaseTl的用量为3Kg，反应温度为80°C，整个反应系统置于压力为50Pa的真空状态下，6小时后停止反应，反应产物经离心后取上层油相进行组成分析，甘油三酯含量为13.7%，甘油二酯含量为53.1%，单甘油酯的含量为33.2%。对油相进行分子蒸馏，分离混合物中的单甘油酯，得到的轻馏分中单甘油酯为98.1%，甘油二酯为1.7%;重相中甘油三酯为21.2%，甘油二酯为68.4%。实施例4取500g经活化处理的大孔弱极性吸附树脂AB-8，IOOOg的Tris-HCl缓冲液(浓度0.05mol/L，pH8.8)，20g质量的游离脂肪酶LipaseTl混合，在30°C下搅拌吸附I个小时，然后过滤，真空干燥至水分含量为0.5%，得大孔吸附树脂固定化的脂肪酶LipaseT1，4°C冰箱保存备用。将9Kg精炼大豆油与1.84Kg甘油加入原料罐I中，控制反应体系中的水分含量不超过0.1%，在磁力搅拌的情况下，如图1所示，反应物经泵输送流经酶反应器后回到原料罐I中，固定化脂肪酶LipaseTl的用量为300g，反应温度为80°C，整个反应系统置于压力为500Pa的真空状态下，6小时后停止反应，反应产物经离心后取上层油相进行组成分析，甘油三酯含量为19.6%，甘油二酯含量为51.8%，单甘油酯的含量为28.6%。对油相进行分子蒸馏，分离混合物中的单甘油酯，得到的轻馏分中单甘油酯为97.7%，甘油二酯为2.1%;重相中甘油三酯为28.2%，甘油二酯为71.7%。权利要求1.一种甘油解反应制备偏甘油酯的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)脂肪酶LipaseTl的固定化取510份质量经预处理的弱极性大孔吸附树脂、1020份质量的Tris-HCl缓冲液、O.Γ份质量的游离脂肪酶LipaseTl混合，在2535°C下搅拌吸附广2小时，然后过滤并干燥至水分含量不高于1%，得到疏水性树脂固定化的脂肪酶LipaseTl；(2)固定化脂肪酶催化油脂甘油解反应取10份质量的植物油、f4份质量的甘油混合加入至原料罐，搅拌均匀后不断通过装有固定化脂肪酶LipaseTl的填充柱并循环回原料罐，整个反应系统置于l(T500Pa的真空系统下中，在75、5°C下反应2飞个小时，得产物混合物；(3)分离所述产物混合物经离心分离，得到上层油相即为富含偏甘油酯的油脂，再经分子蒸馏分离得到单甘油酯和富含甘油二酯的产品。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述大孔吸附树脂的预处理工艺为以95%乙醇浸泡24h，水洗至滤液不呈白色浑浊；以5%的HCl溶液浸泡2h，水洗至滤液呈中性；再以2%的NaOH溶液浸泡2h，水洗至滤液呈中性即可。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的Tris-HCl缓冲液浓度为O.05mol/L,pH为8.8。4.根据权利要求1所述的方法，步骤(2)所述反应体系中的水分含量不超过O.1%。5.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，步骤(2)所述固定化脂肪酶LipaseTl的装填量为反应原料质量的10%。6.根据权利要求1或2或3或4所述的方法，所述的植物油包括大豆油、菜籽油、花生油、玉米油、葵花籽油、棕榈油、棕榈仁油、椰子油、亚麻油、芝麻油、山茶籽油、橄榄油中的一种或一种以上的混合物。全文摘要本发明公开了一种甘油解反应制备偏甘油酯的方法，属于油脂改性
技术领域：
。该方法包括以下步骤(1)脂肪酶LipaseT1的固定化；(2)固定化脂肪酶催化油脂的甘油解反应；(3)产物分离。本发明所用的脂肪酶LipaseT1的热稳定性高，采用疏水性大孔吸附树脂固定化后可以在75~95℃的范围内，无水环境下催化甘油解反应；不产生副产物，产物中偏甘油酯含量高，固定化酶可以重复利用，因此本方法在工业上具有良好的应用前景。文档编号C12P7/64GK103060394SQ201210559918公开日2013年4月24日申请日期2012年12月20日优先权日2012年12月20日发明者王永华,王卫飞,杨博,蓝东明,李响,宁柠申请人:华南理工大学