含有13种甘油酯的薏苡仁油、制剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药学领域，具体而言，本发明涉及一种薏苡仁油、制剂、制备方法及其 在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 薏该仁是禾本科薏该属植物薏该Coix lacryma-jobi L. var ma-yuen (Roman.) Stapf的成熟干燥种仁，为利水渗湿药，很久以来为药食两用品种。现代研究发现薏苡仁具 有镇痛抗炎、免疫调节、抗溃疡、降血脂和减肥等药理作用。近年来，国内外学者通过TLC、 HPLC-MS、GC等方法对薏苡仁的化学成分进行了研究，发现其含有多种活性成分，主要包括 薏苡仁酯、甘油三酯类、脂肪酸类、内酰胺类、薏苡仁内酯、糖类、留醇类、三萜类等化合物。 其中，酯类是首先被发现的具有抗肿瘤活性的成分，也是报道最多最受关注的化学成分。虽 然目前在中国临床上以薏苡仁油为有效成分的康莱特注射剂已得到普遍应用，但其使用的 薏苡仁油成分较复杂，除含有甘油三酯成分外，还含有甘油一酯、甘油二酯以及脂肪酸酯 等，这必然会使实际生产过程中的质量控制和临床用药安全面临很大的挑战。
[0003] 本发明以薏苡仁粉为原料，采用超临界二氧化碳萃取、碱化、中性氧化铝和高岭土 纯化等步骤，得到了一种薏苡仁油有效部位；通过对其活性成分的分离与鉴定，确定了其组 成主要为八种甘油三酯成分和五种甘油二酯成分；并进一步对其进行理化常数的检测，确 定了其最优酸值、碘值、皂化值、折光率和相对密度等。采用本发明所述薏苡仁油用药，成分 及组成确定，保证了工业生产中各批次间的质量稳定性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种从薏苡仁中提取的薏苡仁油，其特征在于：该薏苡仁 油中含有如下质量百分含量的5种甘油二酯类成分和8种甘油三酯类成分：1，3-二油酸甘 油二酯0. 40~0. 58%、1-亚油酸-3-油酸甘油二酯0. 91~1. 31 %、1，2-二油酸甘油二酯 0. 24~0. 35 %、1-油酸-2-亚油酸甘油二酯0. 66~0. 95 %、1，2-二亚油酸甘油酯0. 33~ 0. 47%、三亚油酸甘油酯4. 87~6. 99%、1-油酸-2, 3-二亚油酸甘油酯13. 00~18. 69%、 1-棕榈酸-2, 3-二亚油酸甘油酯5. 25~7. 54%、1，3-二油酸-2-亚油酸甘油酯13. 23~ 19. 02 %、1-棕榈酸-2-亚油酸-3-油酸甘油酯10. 26~14. 75 %、1，3-二棕榈酸-2-亚油 酸甘油酯2. 28~3. 28%、三油酸甘油酯14. 44~20. 76%和1-棕榈酸-2, 3-二油酸甘油 酯 8. 06 ~11. 58%。
[0005] 优选的，上述5种甘油二酯成分和8种甘油三酯成分的质量百分含量为：1，3-二 油酸甘油二酯〇. 45~0. 55%、1-亚油酸-3-油酸甘油二酯1. 03~1. 25%、1，2-二油酸甘 油二酯0. 27~0. 33%、1-油酸-2-亚油酸甘油二酯0. 75~0. 91%、1，2-二亚油酸甘油 酯0. 37~0. 45%、三亚油酸甘油酯5. 47-6. 69%、1-油酸-2, 3-二亚油酸甘油酯14. 63~ 17. 88%、1-棕榈酸-2, 3-二亚油酸甘油酯5. 9~7. 21 %、1，3-二油酸-2-亚油酸甘油酯 14.88~18. 19 %、1-棕榈酸-2-亚油酸-3-油酸甘油酯IL 55~14 11 %、1,3-二棕榈 酸-2-亚油酸甘油酯2. 57~3. 14%、三油酸甘油酯16. 25~19. 86 %和1-棕榈酸-2, 3-二 油酸甘油酯9. 07~11.08% ;
[0006] 更优选的，上述5种甘油二酯成分和8种甘油三酯成分的质量百分含量为： 1，3-二油酸甘油二酯0· 49~0· 51 %、1-亚油酸-3-油酸甘油二酯L 12~L 16 %、1，2-二 油酸甘油二酯〇. 29~0. 31 %、1-油酸-2-亚油酸甘油二酯0. 81~0. 85%、1，2-二亚油 酸甘油酯0. 40~0. 42%、三亚油酸甘油酯5. 96~6. 20%、1-油酸-2, 3-二亚油酸甘油酯 15. 93~16. 58%、1-棕榈酸-2, 3-二亚油酸甘油酯6. 43~6. 69%、1，3-二油酸-2-亚 油酸甘油酯16. 20~16. 87 %、1-棕榈酸-2-亚油酸-3-油酸甘油酯12. 57~13. 09%、 1，3-二棕榈酸-2-亚油酸甘油酯2. 79~2. 91 %、三油酸甘油酯17. 69~18. 42%和1-棕 榈酸-2, 3-二油酸甘油酯9. 87~10. 27%。
[0007] 上述含量均指甘油二酯或甘油三酯化合物在薏苡仁油中的质量百分含量，以本发 明所述方法制备得到的薏苡仁油为原料，经过制备色谱分离得到5个甘油二酯单体化合物 和8个甘油三酯单体化合物，称重、计算而得。也可根据本领域常规分析方法得出。
[0008] 其中，所述薏苡仁油按脂肪油检测理化常数为：20°C时相对密度0. 916~0. 920， 20°C时折光率L 471~L 474,酸值〈0· 2,碘值100~106,皂化值186~195 ;
[0009] 本发明所述的薏苡仁油是通过如下方法获得的：
[0010] 超临界二氧化碳萃取：取薏苡仁粉碎成10目~80目，采用600LX 2超临界CO2萃 取器萃取，将薏苡仁粉装入萃取釜，用夹套循环热水加热CO2预热器、萃取釜和分离柱，使萃 取温度和分离温度分别达到33~45°C和30~45°C，保持一级解析釜和二级解析釜出口温 度分别为20~50°C和15~35°C;液态CO 2以1~3t/h的流量经高压泵加压进入CO2预热 器，成为超临界状态下的流体，进入萃取釜，保持压力19~23Mpa，萃取薏苡仁油；溶有薏苡 仁油的OV流体进入分离柱，控制分离柱压力7~lOMpa，分离得到薏苡仁油；从分离柱出来 的CO 2气体先后进入一级、二级解析釜，分别保持压力为5~7Mpa和4~6Mpa，弃去解析得 到的水分等杂质，CO 2气体经冷凝器变成液态CO2，循环使用，连续萃取2~3h，得到薏苡仁 油；
[0011] 精制：取超临界CO2萃取得到的薏苡仁油，加入油重量60%的60°C~90°C石油醚， 再根据酸值，加入油重36%~56%的2% NaOH溶液，搅拌IOmin后，静置18~24h后，除 去下层皂脚，取上层用纯化水进行水洗，静置18~24h后，除去下层废水；取上层进行第二 次水洗，静置40~50h后，除去下层废水；取上层加油重70%~90%丙酮破乳，静置2~ 4h后，除去下层废丙酮；取上层油溶液，加入油重3%~8%的经活化的中性氧化铝，搅拌 30min后，过滤；滤液加热后，加入油重2%~6%高岭土，搅拌，在40~50°C下保温30min， 过滤；滤液减压回收溶剂后，再加纯化水进行水洗，静置1~2h后，除去下层废水；上层油 在充氮条件下，加热减压干燥，再加入油重8%~12%经活化的中性氧化铝，搅拌，置冷处 静置，过滤，过滤后的油在充氮条件下，加热减压浓缩，再经160~170°C减压干热灭菌1~ 2h，冷却后经0. 2 μ m微孔滤膜过滤，分装于500ml玻璃输液瓶中，充氮，密封，即得；
[0012] 优选地，所述精制步骤如下：
[0013] 取超临界CO2萃取得到的薏苡仁油，加入油重量60%的60°C~90°C石油醚，再根 据酸值，加入油重36 %~56 %的2 % NaOH溶液，搅拌IOmin后，静置20h后，除去下层皂脚， 取上层用纯化水进行水洗，静置22h后，除去下层废水；取上层进行第二次水洗，静置46h 后，除去下层废水；取上层加油重70%~90%丙酮破乳，静置3h后，除去下层废丙酮；取上 层油溶液，加入油重5%的经活化的中性氧化铝，搅拌30min后，过滤；滤液加热后，加入油 重4%经活化的高岭土，搅拌，在40~50°C下保温30min，过滤；滤液减压回收溶剂后，再加 纯化水进行水洗，静置Ih后，除去下层废水；上层油在充氮条件下，加热减压干燥，再加入 油重8%~12%经活化的中性氧化铝，搅拌，置冷处静置，过滤，过滤后的油在充氮条件下， 加热减压浓缩，再经160~170°C减压干热灭菌2h，冷却后经0. 2 μ m微孔滤膜过滤，分装于 500ml玻璃输液瓶中，充氮，密封，即得。
[0014] 本发明所述薏苡仁油为淡黄色的澄明液体，气微、味淡；其在石油醚或三氯甲烷中 极易溶解，在丙酮中易溶、在乙醇中微溶，在水中不溶。
[0015] 按照本发明所述方法制备得到的薏苡仁油，依照中国药典2010年版一部附录方 法进行检测，其理化常数均为：20°C时相对密度0. 916~0. 920, 20°C时折光率1. 471~ 1. 474,酸值〈0. 2,碘值100~106,皂化值186~195。其中，药典所述酸值系指中和脂肪、 脂肪油或其他类似物质1克中含有的游离脂肪酸所需氢氧化钾的重量（毫克数）。在油脂 类产品的质量研究中，酸值是一个重要评价指标，就本申请所述薏苡仁油而言，其酸值均小 于0. 2,即通过对制备工艺中超临界萃取参数和碱化等纯化工艺的优化，制备得到的薏苡仁 油具有如下优点：一方面作为杂质的游离脂肪酸含量极低，成品质量较好；另一方面富集 了大量甘油二酯、甘油三酯类活性成分，纯度较高，并且其中甘油二酯和甘油三酯类成分种 类明确、含量稳定。除此之外，其它理化常数，如皂化值、碘值等，多批次样品测得该值变化 范围均较小，进一步说明本发明所述薏苡仁油的质量稳定、临床用药更安全。本发明所述制 备方法收率高、成本低、产品稳定，适于工业化生产，安全可控。
[0016] 本发明的又一目的在于提供一种含有薏苡仁油的药物制剂，具体包括本发明所述 薏苡仁油及一种或几种药学上可接受的载体。
[0017] 其中，所述药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、乳 化剂、粘合剂、润滑剂、吸收促进剂、表面活性剂、崩解剂、润滑剂或抗氧化剂，必要时还可以 加入香味剂、甜味剂、防腐剂或着色剂。
[0018] 所述药学上可接受的载体可以选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫 代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、大豆磷脂、维生素 C、维生素 E、EDTA二钠 、EDTA 钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯 化钠、氯化钾、乳酸钠、羟苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨酸钾、醋酸氯己定、木糖醇、麦芽糖、葡萄 糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻 酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二 醇、环糊精、β -环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙或硬脂酸镁。
[0019] 所述药物制剂可以是口服固体制剂、口服液体制剂或注射剂。
[0020] 优选的，
[0021] 所述口服固体制剂选自胶囊剂、片剂、滴丸、颗粒剂、浓缩丸中的一种；所述口服液 体制剂选自水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或是一种在使用前可用水或其 它适宜的载体复配的干燥产品；所述注射剂选自纳米混悬剂、脂质体、乳剂、冻干粉针剂和 水针剂中的一种。
[0022] 更优选的，
[0023] 所述注射剂包括如下成分：本发明所述薏苡仁油50~350g，注射用大豆磷脂或 可供注射用大豆磷脂10~40g，注射用甘油或可供注射用甘油15~50g，注射用水加至 1000 ml0
[0024] 其可通过如下方法制备：
[0025] 称取处方配制量的注射用大豆磷脂或可供注射用大豆磷脂，加适量的注射用水 后，用高剪切分散乳化机分散至无块状及颗粒状固体，加入按配方量称取的注射用甘油或 可供注射用甘油，并加注射用水至规定量，搅拌均匀备用；
[0026] 另称取薏苡仁油，将称取的油酯与水相分别加热至60~70°C后，置高压均质机进 行高压乳化，乳化时均质机低压为5~12MPa，高压为25~50MPa，再循环均质3~6遍， 至2 μ m以下颗粒应不少于95 %，5 μ m以上颗粒不得检出，必要时用NaOH或HCl调节pH至 4. 8~8. 5,优选6. 8~L 0,最优选为6. 8 ;
[0027] 将制得均匀乳剂氮气加压通过小于等于3 μ m的微孔滤芯过滤器过滤，充氮灌装 灭菌，冷却即得。
[0028] 所述胶囊剂包括如下成分：薏苡仁油200~800g，抗氧化剂和/或乳化剂0. 20~ 0. 60g，制成 1000 粒。
[0029] 其可通过如下方法制备：
[0030] 胶液配制：按重量比为1:0. 6~1. 2:0. 3~0. 8:0. 0001~0. 01称取适量明胶、纯 化水、甘油和防腐剂；依次将甘油、纯化水、防腐剂（选自10%羟苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨 酸钾和醋酸氯己定中的一种）加入化胶罐内，加热至70°C~90°C后，再加入明胶不断搅拌、 抽真空，直至明胶完全溶解，将胶液过滤，在56~62 °C下存放，备用；
[0031] 药液配制：将配方量的薏苡仁油、抗氧化剂和/或乳化剂（抗氧化剂为维生素 E， 乳化剂为吐温80)加入配料罐内，不断搅拌，直至混合均匀；
[0032] 压胶囊：根据胶囊大小选择合适的压丸模具，在15~30°C、相对湿度小于35%条 件下进行压丸定型后干燥，剔除大小丸，再用95%药用乙醇洗丸后，继续干燥至含水量小于 12%，目检剔除不合格胶囊，印字，包装即得。
[0033] 本发明通过药效实验表明，所述薏苡仁油及其制剂对多种人肿瘤细胞株均有不同 程度的抑制作用，可作为治疗肿瘤疾病药物。
[0034] 因此，本发明的目的还在于提供一种上述薏苡仁油、药物制剂单独或与钼类、烷化 剂类、二氟核苷类、抗生素类、细胞毒类或激素类化学抗肿瘤药物在制备抗肿瘤或炎症药物 中的应用。
[0035] 其中，所述钼类优选为顺钼、卡钼，烷化剂类优选为环磷酰胺，二氟核苷类优选为 盐酸吉西他滨，抗生素类优选为米托蒽醌、丝裂霉素，细胞毒类优选为多西他赛、紫杉醇，激 素类优选为醋酸亮丙瑞林；所述肿瘤是指早期、中期或晚期的肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺 癌、卵巢癌、乳腺癌、肉瘤样癌或癌肉瘤；所述炎症是指前列腺增生。
[0036] 以下通过实验数据说明本发明所述组合物及其制剂在抗肿瘤或治疗炎症方面的 有益效果。
[0037] -、体外MTT法测定薏苡仁油及其制剂对8种人肿瘤细胞株的抑制作用
[0038] 1、实验材料及配制
[0039] (1)细胞株=PANC-I (人胰腺癌细胞）、SK0V3 (人卵巢癌细胞）、MCF_7 (人乳腺癌细 胞）、Bcap-37 (人乳腺癌细胞）、SMMC-7721 (人肝癌细胞）、H印G-2 (人肝癌细胞）、A549 (人 肺癌细胞）、H460 (人肺癌细胞），上述细胞株由上海医药工业研究药理评价研究中心保存， 传代维持。
[0040] (2)01^1完全培养基：添加10%新生牛血清（6四0)81^)、双抗。
[0041] (3)0. 25%胰蛋白酶溶液（Trypsin):购自 Invitrogen 公司，-20°C保存。
[0042] (4)磷酸缓冲液（PBS) :NaC18g，KC10. 2g，Na2HPO4L 15g，KH2PO4O. 2g，溶于 IL 双蒸 水，121°C高压消毒20min，4°C保存。
[0043] (5) MTT (AMRESC0)溶液：用 PBS 配成 5mg/ml 溶液。
[0044] (6)溶解液：每100mL去离子双蒸水含SDSlOg，异丁醇5ml，浓盐酸0· 1ml。
[0045] 2、实验方法
[0046] 样品对上述细胞株的抑制作用通过MTT法测得。
[0047] 具体步骤如下：
[0048] (1)细胞培养：①将细胞从液氮中取出，在37°C水浴中迅速解冻，细胞在无菌操作 台中移入IOml无菌离心管中加6ml细胞培养基，1000转/分钟离心5分钟。弃去上清液， 沉淀中加入5~6ml细胞培养基，滴管吹打使其悬浮后移入细胞培养瓶中，置37°C细胞培 养箱内。②次日，自培养箱中取出细胞，弃去细胞瓶中细胞培养基，加入5~6ml细胞培养 基，置37°C细胞培养箱内。③隔日，自培养箱中取出细胞，弃去细胞瓶中细胞培养基，加入 PBS (pH7. 4) 2~3ml晃动清洗，倒掉PBS溶液后再重复一次清洗。在培养瓶中加入3~5滴 0. 25 %胰蛋白酶溶液晃动均匀，加盖置于37°C细胞培养箱内3分钟左右，于显微镜下观察 发现细胞自培养瓶壁上脱离，加细胞培养基2ml，滴管吹打使细胞完全脱离瓶壁后，分别移 入2个干净培养瓶中，加入细胞培养基5~6ml吹打均匀，置于37°C细胞培养箱内。④隔 日，重复③步骤。在整个培养过程中，贴壁细胞不允许生长过密，悬浮细胞始终保持对数生 长期。
[0049] (2)样品及对照品制备：称取适量薏苡仁油样品溶解于DMSO中，得到浓度为IOmg/ ml 的溶液。再用 PBS 作梯度稀释，得到浓度 10mg/ml、5000 μ g/ml、2500 μ g/ml、1250 μ g/ml、 625 μ g/ml、312. 5 μ g/ml 的稀释样品。
[0050] (3)将稀释好的样品加入平底96孔板中，每孔10 μ 1，每点作两个平行测试。将 DMSO相应作梯度稀释后加入板中，作为对照。
[0051] (4)取处于对数生长期的细胞，细胞经胰酶消化并洗涤后悬浮于含10%小牛血清 的培养基中，经苔盼蓝染色排除法计活细胞数，并调节细胞悬浮液密度至2 X IO5个细胞/ ml 〇
[0052] (5)将加入细胞的平底96孔板在37°C、5% CO2细胞培养箱中培养48小时。
[0053] (6)每孔中加入20 μ 1的5mg/ml MTT溶液，继续在培养箱中保温3~4小时。
[0054] (7)每孔加入100 μ 1溶解液，继续在培养箱中保温过夜，使生成的甲臢晶体充分 溶解。测
[0055] 定570nm光吸收值。
[0056] (8)根据光吸收值计算各样品浓度组的细胞