专利名称：淀粉废水及麦芽根制备培养基及发酵普鲁兰多糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵普鲁兰多糖的方法，具体涉及一种以淀粉废水及麦芽根制备培养基来发酵普鲁兰多糖的方法。
背景技术：
普鲁兰多糖是一类具有重要应用价值的微生物胞外多糖，成膜性、成纤维、阻气性、生物安全且无毒的特点，使其在食品、医药、化工和石油领域得到广泛应用。淀粉废水是加工淀粉过程中不可避免的一种副产物，营养丰富；麦芽根为麦芽制造过程中的副产物，含有丰富的淀粉酶、麦芽酶、果酸酶及蛋白酶，富含B族维生素，并含有大量未知生长因子。目前文献中报道的普鲁兰多糖发酵培养基的碳源较多的是使用耐高温淀粉酶酶解后的淀粉或者蔗糖，价格昂贵，工艺复杂，增加了普鲁兰多糖发酵成本。此外目前缺少色素产生少和胞外多糖合成能力高的菌株，这些都促使普鲁兰多糖整体成本的上升。
发明内容
为了解决上述由于技术不足产生的问题，进一步降低普鲁兰多糖的成本，本发明的目的在于提供一种以淀粉废水及麦芽根制备培养基来发酵普鲁兰多糖的方法，原料来源广泛，利用麦芽根所含有的丰富酶系和生长因子来酶解淀粉工业废水，培养基简单，既提高了多糖产量，降低了多糖生产成本，也解决了由淀粉废水及麦芽根带来的环境问题。此外，通过该方法培养的菌株色素产生能力明显下降，减少了脱色这个步骤，大大降低了普鲁兰多糖的成本。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种以淀粉废水及麦芽根制备培养基来发酵普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤:所述培养基制备方法如下:(I)将麦芽根粉碎，过20目筛，制备麦芽根汁，质量浓度20%_50% ；(2)将麦芽根汁与工业淀粉废水按照质量比20 40:100添加混合，在38 40°C浸溃25-40min ;控制温度为45°C进行蛋白质(Pr)休止，保持20_40min，控制温度为55°C进行第二次蛋白质休止保持30分钟，控制温度在63°C进行第一段糖化，保持时间40min ;第二段糖化温度为68°C，至碘液反应为无色；升温到76 78°C，过滤，洗糟，调pH到5.6-7.4，添加2 3g/L的NaCU0.2 0.4g/L的MgSO4,3 5g/L的K2HPO4,灭菌成为培养基。所述发酵培养方法如下:(I)将出芽短梗霉(Aureobsidium pullulans)CGMCCN0.7055 菌株活化，即将其从蔗糖琼脂培养基斜面上转接到500ml的挡板瓶中，挡板瓶装液量为80ml，在恒温28°C转速180r/min，培养 30h。(2)以4%体积比将(I)所得种子菌液转接到500ml培养基的挡板瓶中，挡板瓶装液量为100ml，在恒温28°C转速200r/min，培养84 104h后，取发酵液离心去除菌丝体。
(3)在上层清液中加入三倍体积的无水乙醇，搅拌，4°C放置过夜，使普鲁兰多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min离心30min得普鲁兰多糖沉淀,沉淀用无水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或浅黄色多糖粗品。本发明的优点如下:本发明利用工业废弃物-淀粉工业废水进行普鲁兰多糖的制备，不仅能变废为宝，大大降低普鲁兰多糖的生产成本，还会减少淀粉工业废水对环境所造成的污染，起到了资源和环境双赢的效果。本发明利用了麦芽制造厂的副产物一麦芽根中的丰富酶系代替水解酶进行废水中的淀粉水解，还利用了麦芽根中丰富的生长因子促进出芽短梗霉菌的生长代谢，提高了
普鲁兰多糖的产量。经本发明培养的菌株色素产生明显降低，从而减少产品脱色步骤，大大降低了成本。
具体实施实例下面结合具体实例对本发明作进一步的说明。实施例1一种以淀粉废水及麦芽根制备材料来发酵普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤:一、将麦芽根粉碎，过20目筛，制备麦芽根汁浓度50%。二、将麦芽根汁 与工业淀粉废水按照质量比20:100的添加混合一浸溃(38 40°C，30min) — Pr 休止 I (45°C，30min) — Pr 休止 II (55°C，30min)—第一段糖化(63°C，40min)—第二段糖化(68°C，至碘液反应为无色一升温(76 78°C )—过滤一洗槽一调节pH至5.8，添加2g/L的NaCl、0.2g/L的MgS04、3g/L的K2HPO4经灭菌成为培养基。三、将CGMCCN0.7055活化，即将其从蔗糖琼脂培养基斜面上转接到500ml的挡板瓶中，挡板瓶装液量为80ml，在恒温28°C转速180r/min，培养30h。三、以4%体积比将种子菌液转接到500ml的挡板瓶中，挡板瓶装液量为100ml，在恒温28°C转速200r/min，培养84h后，取发酵液离心去除菌丝体。四、在上层清液中加入三倍体积的无水乙醇，搅拌，4°C放置过夜，使普鲁兰多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min离心30min得普鲁兰多糖沉淀,沉淀用无水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或浅黄色多糖粗品，产量98g/L。实施例2一、将麦芽根粉碎，过20目筛，制备麦芽根汁浓度30%。二、将麦芽根汁与工业淀粉废水按照质量比30:100添加混合一浸溃(38 40°C，30min) — Pr 休止 I (45 °C, 30min) — Pr 休止 II (55 °C, 30min)—第一段糖化(63 °C,40min)—第二段糖化(68°C，至碘液反应为无色)一升温(76 78°C )—过滤一洗槽一调节pH至6.6，添加3g/L的NaCl、0.3g/L的MgS04、4g/L的K2HPO4经灭菌成为培养基。三、将CGMCCN0.7055活化，即将其从蔗糖琼脂培养基斜面上转接到500ml装有上述培养基的挡板瓶中，挡板瓶装液量为80ml，在恒温28°C转速180r/min，培养30h。三、以4%体积比将种子菌液转接到500ml装有上述培养基的挡板瓶中，挡板瓶装液量为100ml，在恒温28°C转速200r/min，培养96h后，取发酵液离心去除菌丝体。
四、在上层清液中加入三倍体积的无水乙醇，搅拌，4°C放置过夜，使普鲁兰多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min离心30min得普鲁兰多糖沉淀,沉淀用无水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或浅黄色多糖粗品，产量105g/L。实施例3一、将麦芽根粉碎，过20目筛，制备麦芽根汁浓度20%。二、将麦芽根汁与工业淀粉废水按照质量比40:100添加混合一浸溃(38 40°C，30min) — Pr 休止 I (45 °C, 30min) — Pr 休止 II (55 °C, 30min)—第一段糖化(63 °C,40min)—第二段糖化(68°C，至碘液反应为无色)一升温(76 78°C )—过滤一洗槽一调节pH至7.1，添加2g/L的NaCl、0.4g/L的MgS04、5g/L的K2HPO4经灭菌成为培养液。三、将CGMCCN0.7055活化，即·将其从蔗糖琼脂培养基斜面上转接到500ml的挡板瓶中，挡板瓶装液量为80ml，在恒温28°C转速180r/min，培养30h。三、以4%体积比将种子菌液转接到500ml的挡板瓶中，挡板瓶装液量为100ml，在恒温28°C转速200r/min，培养104h后，取发酵液离心去除菌丝体。四、在上层清液中加入三倍体积的无水乙醇，搅拌，4°C放置过夜，使普鲁兰多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min离心30min得普鲁兰多糖沉淀,沉淀用无水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或浅黄色多糖粗品，产量102g/L。一株出芽短梗霉(Aureobsidium pullulans),该菌株已经于2012年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，(邮编100101)，保藏编号为CGMCCN0.70551.诱变菌株的获得(I)选择生长良好的出芽短梗霉菌株TKPM10017斜面菌种，用无菌生理盐水洗下孢子，制做106个/mL的孢子悬浮液，于30W紫外灯下,30cm处，分别照射0.5min、lmin、
1.5min、2min、2.5min3min、3.5min、4min将孢子悬液梯度稀释涂平板,避光28°C培养,计算致死率；(2)选择0.5min、2min、4min三个不同剂量的照射时间分别对菌株TKPM10017的孢
子悬浮液进行紫外照射处理；(3)然后把三个不同照射时间的孢子悬液混合均匀，进行10-1 10-6梯度稀释，取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6三个稀释度的孢子悬浮液涂布平板，28°C避光培养3d ；(4)将(3)中的诱变菌株接种到含有10mg/L寡霉素的种子培养基中培养；将种子液置于28°C恒温摇床，200r/min，振荡培养3d ；(5)将(4)中的种子液进行梯度稀释，取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6三个稀释度的孢子悬浮液涂布斜面培养基平板，28°C培养3d，筛选培养基中颜色乳白色、菌落大而粘稠、湿润的菌株。(6)再将(5)中筛选的菌株分别接种到种子培养基中，在28°C，200r/min下，振荡培养36h，以5%的接种量接入发酵培养基中，28°C、200r/min下发酵3d，离心，蒽酮硫酸法测定上清液中普鲁兰多糖的含量，复筛出普鲁兰多糖高产菌株BCSWGHPL101。2.诱变菌株BCSWGHPL101的特性(I)菌落形态:发酵液中主要呈现酵母样形态，椭圆形且大小均一，菌株的繁殖方式类似于酵母的出芽生殖方式。
(2)菌落形态:菌落呈圆形，中心隆起，表面光滑，湿润，不易挑取，生长后期有菌丝体产生。(3)培养特征:28°C，200rpm下震荡培养3d，发酵液颜色乳白到乳黄色。(4)可以利用的碳源:葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、可溶性淀粉、糊精其中之一。(5)可以利用的氮源:牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、硝酸钠、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵等，上述氮源可以混合使用，也可单一使用。(6)可以在10mg/L寡霉素存在的情况下生长良好。1.培养基的配置:(I)菌种活化培养基:土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA):去皮马铃薯200g/L，加葡萄糖 20g/L，琼脂 20g/L，，pH 自然。121。。20min 灭菌。(2)种子培养基:蛋白胨 3g/L，蔗糖 50g/L，K2HPO4.7Η202.0g/L，MgSO4.7Η200.4g/L, NaC12.5g/L，调节 pH 至 7.0，121 °C 高压灭菌 20min，备用。(3)发酵培养基:蛋白胨 3g/L，蔗糖 100g/L，K2HPO4.7H203.0g/L,MgSO4.7Η20 0.4g/L, NaC12.5g/L, FeSO40.0lg/L 调节 pH 至 7.0，121 °C 高压灭菌 20min,备用。
(4)选择培养基:寡霉素5mg/L(单独灭菌)，蛋白胨3g/L,鹿糖50g/L,K2HPO4.7Η202.0g/L, MgSO4.7Η200.4g/L，NaC12.5g/L，调节 pH 至 7.0，121 °C 高压灭菌 20min,备用。(5)初筛培养基即PDA培养基:去皮马铃薯200g/L，加葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH 自然。121 °C 20min 灭菌。
权利要求
1.粉废水及麦芽根制备培养基的制备方法，包括如下步骤: (1)将麦芽根粉碎，过20目筛，制备麦芽根汁，质量浓度控制20-50%; (2)将麦芽根汁与工业淀粉废水按照质量比20 40:100添加混合，在38 40°C浸溃25-40min ;控制温度为45°C进行蛋白质休止，保持20_40min，控制温度为55°C进行第二次蛋白质休止保持30分钟，控制温度在63°C进行第一段糖化，保持时间40min，第二段糖化温度为68°C，至碘液反应至无色，升温到76 78°C，过滤，洗槽，调pH到5.6-7.4，添加2 3g/L的NaCU0.2 0.4g/L的MgS04、3 5g/L的K2HP04,灭菌成为培养基。
2.根据权利要求1所述淀粉废水及麦芽根制备培养基的制备方法，所述PH为5.8。
3.根据权利要求1所述淀粉废水及麦芽根制备培养基的制备方法，所述PH为6.6。
4.一种利用如权利要求1所述淀粉废水及麦芽根制备培养基发酵的方法，包括如下步骤: (1)将普鲁兰多糖高产菌株(Aureobsidiumpullulans) CGMCCN0.7055菌株活化； (2)以4%体积比将种子菌液转接到500ml培养基的挡板瓶中，挡板瓶装液量为100ml，在恒温28°C转速200r/min，培养84 104h后，取发酵液离心去除菌丝体； (3)在上层清液中加入三倍体积的无水乙醇，搅拌，4°C放置过夜，使普鲁兰多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min离心30min得普鲁兰多糖沉淀,沉淀用无水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或浅黄色多糖粗品 。
全文摘要
本发明涉及一种以淀粉废水及麦芽根制备培养基来发酵普鲁兰多糖的方法。所述以淀粉废水及麦芽根制备培养基来发酵普鲁兰多糖的方法，培养基的制备制备包括以下步骤培养基的制备、菌株活化、发酵培养、乙醇处理干燥即得到白色或浅黄色多糖粗品。其中所述培养基制备方法包括(1)麦芽根粉碎，过筛，制备麦芽根汁；(2)将麦芽根汁与工业淀粉废水混合，浸渍；控温进行蛋白质(Pr)休止；控温进行糖化；升温，过滤，洗糟，调pH，添加无机盐，灭菌。本发明利用工业废弃物—淀粉工业废水进行普鲁兰多糖的制备，不仅能变废为宝，大大降低普鲁兰多糖的生产成本，还会减少淀粉工业废水对环境所造成的污染，起到了资源和环境双赢的效果。
文档编号C12P19/10GK103088085SQ201210594838
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者乔长晟, 宋亚琼, 郝华璇, 李振海, 李政, 盖丽丰 申请人:天津北洋百川生物技术有限公司