专利名称：一种鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株的制作方法
一种鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株技术领域
本发明属于疫苗抗原筛选技术领域，具体涉及一种鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株。
背景技术：
鸡传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性高度接触性呼吸道疾病，以气管啰音、咳嗽、打喷嚏、幼鸡流鼻涕、产蛋鸡产蛋量减少和蛋的品质下降为特征；患病鸡常因为呼吸道、肾脏或消化道感染而引起死亡。本病于1931年首先由 Schalk等报道于美国，1936年由Beach和Hudson确定本病的病原为病毒。至今本病在世界范围内广泛流行，给养鸡业带来严重危害。在我国，邝荣禄(1972)在广东首次发现本病； 到上世纪70年代后期，郑福荣等在杭州、吴志达等在上海、艾国光等在北京、辛朝安等在广州分别自种用鸡群中分离出IBV。荣骏弓等(1997)在患有腺胃肿大的病鸡中分离到腺胃型鸡传染性支气管炎病毒D971株，用该毒株回归SPF雏鸡引起典型肾炎及腺胃炎病变，并从人工感染SPF雏鸡中回收到鸡传染性支气管炎病毒。王玉东、范根成等(1998)在山东省某患有腺胃肿大发病鸡群中采集病料，通过鸡胚连续传5 6代，经电镜观察、动物回归和免疫保护试验、用气管环组织培养进行理化特性测定、毒价测定、中和试验等，证明目前流行的以腺胃肿大为主要特征的传染病的病原是冠状病毒，将该毒株命名为腺胃型鸡传染性支管炎病毒QX株。
在欧洲，分别于2001年在俄罗斯东部及2002年在俄罗斯西部分离到IBV类QX 株(Bochkov et al，2006)，该毒株能引起鸡患腺胃炎、肾炎，与QX株相似。从2003年起许多欧洲国家相继分离到IBV类QX株，包括德国、荷兰、比利时、法国、意大利( Worthington et al, 2008 ；Monne et al, 2008)、波兰(Domanska-Blicharz et al, 2006)、英国(Gough et al，2008)和西班牙(Dolz et al，2009)。各种相关研究报道表明整个欧洲地区都有类QX 株病毒的存在。显然，IB类QX株对于禽养殖来说是很大的威胁，而目前尚无专门针对IB类 QX株的疫苗。国外学者将类QX毒株在鸡胚上连续传代80余代致弱的IB L1148毒株制成 IB类QX株的活疫苗，并进行相关的效力和安全性试验。表明对于SPF鸡亦或是携有母源抗体的鸡，经IB LI 148株制成的活苗免后对类QX株D388的攻毒都能提供有效保护。
免疫接种是防治鸡传染性支气管炎的最有效手段。目前，国内外用于预防腺胃型传染性支气管炎疫苗的研究较多，但均尚未商品化。同时由于IBV血清型众多，市场上一直未有交叉保护力好的弱毒株，腺胃型IB得不到有效控制。因此，筛选获得新的具有较好保护力的IB弱毒株就显得尤为重要。发明内容
本发明的目的是提供一种鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株，即一种新的腺胃型鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株，用该弱毒疫苗株所制备的疫苗对目前中国流行腺胃型鸡传染性支气管炎病毒的攻击能提供良好的免疫保护效力。
本发明的鸡传染性支气管炎病毒(Avianinfectious bronchitis virus)YB160, 该病毒株于2012年10月31日保藏在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 6752。
本发明筛选的弱毒疫苗株用来制备用于防治鸡传染性支气管炎的疫苗。
本发明筛选的鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株无论人工感染还是水平传播感染在鸡体连续传代，均未见毒力返强现象，遗传性稳定，符合鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准，制成的疫苗能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
一、本发明鸡传染性支气管炎弱毒YB160株的筛选
使用l(Tll日龄SPF鸡胚对传染性支气管炎强毒进行连续传代致弱，每代通过尿囊腔接种4枚SPF鸡胚，连传至160代，进行致弱评价。取10、20、30、40、50、60、70、80、90、 100、110、120、130、140、150、160传代接种的病毒株感染I日龄的SPF鸡。结果从第80代病毒株开始无死亡鸡，第90代毒株接种的鸡开始无眼观病变，第130代接种的鸡开始无组织学病变。说明IBV第130代已经完全致弱，对鸡只具有良好的安全性。同时用本发明毒株130、140、150160代分别免疫3日龄SPF鸡，于免疫后14日，用同源强毒攻击。免疫组分毒率0/10 1/10，保护率9/10 10/10，对照组分毒率10/10。结果说明本发明毒株具有良好的免疫保护性。为了便于同以前毒株区分，将传代160代弱化的鸡胚毒定为原始种子 El代，并将该致弱毒株命名为ΥΒ160株。选取IBV YB 160株作为疫苗研制的候选毒株，并于 2012年10月31日保藏于中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6752。
二、IBV ΥΒ160株的安全性检测
毒力返强试验将ΥΒ160株的El代在SPF鸡体上人工感染和同居感染分别连续传 5代，试验鸡均一切正常，接种后5天剖检气管、腺胃、肾脏等均未见肉眼病理变化；试验发现病毒分离气管棉拭子和腺胃第4代起分不到病毒，肾脏从第3代起分不到病毒，肝脏从第 2代起分不到病毒。试验鸡气管、腺胃、肾脏等组织匀浆中分毒不通器官病毒分离率不同，气管、腺胃病毒分离率较高，说明该毒株主要在气管、腺胃两个器官增殖。随着代次的增加病毒向外排泄也逐渐减少，分毒率逐渐降低。水平感染试验也出现人工感染同样的规律，只是同居感染同代次分毒率相对人工感染低。以上试验结果证明该毒株无论人工感染还是水平传播感染在鸡体连续传代，均未见毒力返强现象，遗传性稳定，符合鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准，可以作为疫苗毒株进行商品化开发。
IBV YB 160株毒种安全性试验取IBV YB 160株基础种子Ε2、Ε4、Ε7、Ε10, Ε13代毒种以IO5 ciEID5tl滴鼻I滴(约O. 03ml)，分别接种1、3日龄SPF鸡，连续观察10日。结果接种鸡只均健活，均 无任何异常反应。结果见表1、2。
表IIBV YB160株毒种的安全性试验结果
权利要求
1.一种鸡传染性支气管炎病毒，其保藏编号为=CGMCC No. 6752。
2.权利要求1所述的病毒在制备疫苗中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的疫苗用于预防鸡传染性支气管炎病。
全文摘要
本发明涉及一种鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株，该病毒株的保藏编号为CGMCC No.6752。本发明筛选的弱毒疫苗株用来制备用于防治鸡传染性支气管炎的疫苗。本发明筛选的鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株无论人工感染还是水平传播感染在鸡体连续传代，均未见毒力返强现象，其遗传性稳定，符合鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准，可以作为疫苗毒株进行商品化开发。
文档编号C12R1/93GK102994460SQ20121059477
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者范根成, 杜元钊, 宋新宇, 宫晓, 孙健, 王红, 徐保娟 申请人:青岛易邦生物工程有限公司