专利名称：一种核苷酸切除修复交叉互补组1基因表达检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测试剂盒，尤其是涉及一种核苷酸切除修复交叉互补组I基因表达检测试剂盒。
背景技术：
核苷酸切除修复交叉互补组I (excision repair cross complementing 1，ERCC1)是核苷酸剪切修复家族中的一个重要成员，定位于19号染色体上，基因全长
15X 103bp，含10个外显子，编码297个氨基酸的蛋白，ERCCl基因的表达产物与DNA修复酶缺乏互补基因F(XPF)形成紧密的异二聚体(ERCC1-XPF)，该二聚体是一个特异性的连结5'端的核酸内切酶，具有损伤识别和切除5'端的双重作用，ERCCl在NER中起到限速或调 节作用。核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)是细胞内最重要的修复方式，能修复外因导致的DNA损伤，在维持基因组功能完整性、抗癌过程中起到极为重要的作用。NER的修复通过切除药物或者紫外线等损伤的DNA而形成的DNA加合物，以互补链为模板复制并修复损伤DNA来维护基因组的完整性。而DNA损伤修复能力增强有时是引起肿瘤细胞耐药的一个重要因素。ERCCl修复作用呈现单核苷酸多态性，单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism, SNP)指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，ERCCl基因在118位密码子有一个C — T的突变，从而影响ERCCl蛋白的表达水平。许多研究指出118C/T单核苷酸多态可能与钼类化疗药耐药相关，抑制ERCCl的表达可克服钼类耐药性，提高治疗效果。钼类药物是最常用的肿瘤化疗药物之一，包括顺钼、卡钼和奥沙利钼等。其药理学机制主要是通过引起肿瘤细胞内DNA的交联，阻碍DNA合成与复制，从而抑制肿瘤细胞的生长。DNA修复是钼类药物耐药性产生的主要原因。ERCCl在所有的肿瘤细胞中都存在表达，而且表达水平差异很大。临床研究已证实ERCCl参与钼类药物耐药的发生，其表达水平与多种肿瘤钼类药物化疗的疗效和生存期呈负相关，即表达水平低的患者对钼类药物敏感，反之表达水平高的患者则耐药。美国国家综合癌症网络(NCCN)(第二版，2010)中明确指出在接受钼类药物化疗前进行ERCCl基因水平的表达检测。因此，化学致癌物代谢酶，即药物代谢酶基因表达检测尤其是ERCCl基因表达的检测对于肿瘤病人的个体化用药及肿瘤发病机制研究至关重要。但目前临床检测ERCCl基因表达的检测试剂原料需多方配备，实验过程分布进行，耗时较长，容易污染，所以探索一种检测ERCCl基因表达快速可靠的方法已经成为临床试验研究的热点问题。
实用新型内容为了解决上述技术问题，本实用新型提供一种核苷酸切除修复交叉互补组I基因表达检测试剂盒，包括盒体I、盒盖2、固定座3、引物试剂瓶4、SYBR premix Ex Taq(含ROX)试剂瓶5、去离子水试剂瓶6、固定座3上设置有Eppendorf管7、加样器吸头8。进一步地，所述固定座3还设置有孔9和空格10。孔9设置用来分别将Eppendorf管7、加样器吸头8固定，以防止遗撒。孔9的形状依据不同Eppendorf管7、加样器吸头8的形状和大小而设置。空格10设置用来将引物试剂瓶4、SYBR premix Ex Taq试剂瓶5、去离子水试剂瓶6固定。所述引物包括扩增引物和白蛋白内参。其中，扩增引物为特异性扩增 ERCCl 的引物，上游引物序列为 5 ' -GAAGTCAGTCAACAAAACGGACAGT-3 '；下游引物序列为5 ' -TGGGCATAAGGCCAGATCTT-3 '，白蛋白内参上游引物序列为5' -TTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3，下游引物序列为5' -CAGCCTGGATAGCAACGTACA-3。引物浓度为10uM。 所述SYBR premix Ex Taq(含 ROX) (2*Conc.)含有 0. 4mmol/L 的 dNTPs, 4mmol/L的 Mg2+，2xBuffer，lU/20ii I 的 Ex Taq HS, 1U/20 u I Tli RnaseH, lmmol/L SYBR Green 1，0. lmmol/L ROX Reference Dye。本实用新型与现有产品相比，具有如下积极有益的效果本试剂盒结构简单、设计合理、使用方便、制造容易、检测过程不易受污染；本试剂盒在检测核苷酸切除修复交叉互补组I基因表达时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。
图I为本实用新型的整体结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本实用新型进行进一步说明。表I为本实用新型PCR反应体系。如图I所示，本实用新型的一个实施例为核苷酸切除修复交叉互补组I基因表达检测试剂盒，包括盒体I、盒盖2、固定座3、引物试剂瓶4、SYBR premixEx Taq(含R0X)试剂瓶5、去离子水试剂瓶6、固定座3上设置有Eppendorf管7、加样器吸头8。固定座3还设置有孔9和空格10。孔9设置用来分别将Eppendorf管7、加样器吸头8固定，以防止遗撒。孔9的形状依据不同Eppendorf管7、加样器吸头8的形状和大小而设置。空格10设置用来将引物试剂瓶4、SYBR premix Ex Taq试剂瓶5、去离子水试剂瓶6固定。所述引物包括扩增引物和白蛋白内参。其中，扩增引物为特异性扩增 ERCCl 的引物，上游引物序列为 5 ' -GAAGTCAGTCAACAAAACGGACAGT-3 '；下游引物序列为5 ' -TGGGCATAAGGCCAGATCTT-3 '，白蛋白内参上游引物序列为5 ' -TTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3 '，下游引物序列为5 ' -CAGCCTGGATAGCAACGTACA-3 '。引物浓度为10uM。所述SYBR premix Ex Taq(含 ROX) (2*Conc.)含有 0. 4mmol/L 的 dNTPs, 4mmol/L的 Mg2+，2xBuffer，lU/20ii I 的 Ex Taq HS, 1U/20 u I Tli RnaseH, lmmol/L SYBR Green 1，0. lmmol/L ROX Reference Dye。[0020]操作方法I)制备模板新鲜组织或石蜡组织，常规提取RNA，并及时反转录成cDNA。2)反应体系将各反应物质按照如下表I中反应体系进行配比表I
权利要求1.一种核苷酸切除修复交叉互补组I基因表达检测试剂盒，其特征在于，包括盒体(I)、盒盖⑵、固定座(3)、引物试剂瓶(4),SYBR premix Ex Taq(ROX)试剂瓶(5)、去离子水试剂瓶(6)、固定座(3)上设置有Eppendorf管(7)、加样器吸头(8)。
2.根据权利要求I所述的一种核苷酸切除修复交叉互补组I基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述固定座(3)还设置有孔(9)和空格(10)。
专利摘要本实用新型公开一种核苷酸切除修复交叉互补组1基因表达检测试剂盒，包括盒体1、盒盖2、固定座3、引物试剂瓶4、SYBR premix Ex Taq(含ROX)试剂瓶5、去离子水试剂瓶6、Eppendorf管7、加样器吸头8、孔9、空格10。本试剂盒结构简单、设计合理、使用方便、制造容易、检测过程不易受污染；本试剂盒在检测核苷酸切除修复交叉互补组1基因表达时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。
文档编号C12Q1/68GK202519262SQ201220162900
公开日2012年11月7日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者冯继锋, 吴建中, 唐金海, 路平, 马蓉 申请人:冯继锋, 吴建中, 唐金海, 路平, 马蓉