乙酰辅酶a羧化酶除草剂抗性植物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了产生对除草剂具有抗性的作物植物的组合物和方法。特别地，本发明提供了含有改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)基因和蛋白，并对除草剂的抑制作用具有抗性的小麦植物、植物组织和植物种子，所述除草剂通常抑制ACCase蛋白的活性。
【专利说明】乙酰辅酶A羧化酶除草剂抗性植物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年2月I日提交的美国临时申请N0.61/438，294和2011年10月31日提交的美国临时申请N0.61/553830的优先权，在此通过引用将上述申请以其全部并入本文之中。
【技术领域】
[0003]本发明提供了产生对除草剂具有抗性的作物植物的方法和组合物。特别地，本发明提供了含有修饰的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)基因和蛋白质，并对除草剂的抑制作用具有抗性的小麦植物、植物组织和植物种子，所述除草剂通常抑制ACCase蛋白的活性。
【背景技术】
[0004]小麦是全球种植和最具有广泛适应性的谷物。普通小麦用于各种食品中，例如面包、饼干、蛋糕、薄脆饼干和面条。一般来说，将硬质小麦碾磨成面粉用于制作面包，而软质小麦碾磨成面粉则用于糕点和饼干。小麦淀粉用于食品和造纸工业，如洗衣用淀粉，以及其他产品。
[0005]商业小麦生产的主要威胁是杂草竞争，这会导致谷物产量降低和质量低劣。虽然可以用耕作来消除杂草，但是经耕种的土地的土壤易受到风和水的侵蚀。由于便于应用和有效性，除草剂处理是控制杂草的首选方法。在减少耕地或设计在土壤表面留下高水平残留物以防止侵蚀的直播种植系统中，除草剂也可以进行杂草控制。小麦中最重要的杂草竞争来自于与其高度相关的草，例如野燕麦和具节山羊草，很难对这些与栽培作物相关的问题杂草种类设计有效的化学控制策略，这是因为它们往往具有相同的除草剂敏感性。为了解决这一问题，其中的一个方法是开发抗除草剂的品种。在这个系统中，在“作物中”施用除草剂以控制杂草，而不对除草剂耐受性的作物造成伤害。
[0006]植物中除草剂抗性的开发提供了重要的生产和经济优势；因此，使用除草剂来控制作物中的杂草或植物几乎成为普遍惯例。然而，此类除草剂的使用也会造成所需作物植物的死亡或生长的降低，这使得除草剂应用的时间和方法相当关键或者在某些情况下根本是不可行的。
[0007]对于农民而言,特别感兴趣的是使用具有更大效力、广杂草谱有效性和快速土壤降解的除草剂。通过允许使用除草剂来控制杂草生长并且没有损害作物的风险，对这些化合物具有抗性的植物、植物组织和种子提供了具有吸引力的解决方案。广谱除草剂的其中一类是那些能抑制植物中乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)活性的化合物。此类除草剂属于芳氧基苯氧基丙酸酯类(FOP)和环己二酮类(DM)化学家族。例如，小麦对于许多靶向单子叶植物的ACCase抑制性除草剂是易感的，这使得几乎不可能使用这些除草剂来控制禾本科杂草。
[0008]由于小麦在世界舞台上作为作物植物的重要性，需要对ACCase除草剂的抑制效果具有抗性的小麦杂种，从而当使用除草剂来控制禾本科杂草时允许更大的作物产量。[0009]发明概沭
[0010]本发明提供了产生对除草剂具有抗性的作物植物的方法和组合物。特别地，本发明提供了含有突变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)基因和蛋白质，并对除草剂的抑制作用具有抗性的小麦植物、品种、品系和杂种、以及植物组织和植物种子，所述除草剂通常抑制ACCase蛋白的活性。
[0011]栽培小麦对许多靶向单子叶或禾本科杂草的ACCase抑制性除草剂是易感的。然而，如本文所述，创建了对ACCase抑制性除草剂表现出耐受性的小麦基因型。遗传分析已经在突变体小麦种质中鉴定出了导致ACCase除草剂抗性表型的遗传差异。
[0012]在一个实施方式中，本发明提供了一种或多种小麦植物，其种质包含能够使植物对ACCase除草剂具有抗性的突变。此外，在进一步的实施方式中，本发明涉及所述植物杂交的后代(例如，Fl，F2，F3等)，其中所述后代的种质具有与亲本植物相同的突变。因此，本发明的实施方式提供了其种质中含有突变的小麦品种/杂种，因此该植物的表型是ACCase除草剂抗性的。在一些实施方式中，所述后代(例如，F1，F2，F3等)是良种小麦品系相互杂交的结果，其中所述良种小麦品系至少一种含有包含能使植物对ACCase除草剂具有耐受性的突变的种质。
[0013]在一个实施方式中，本发明提供了小麦植物，其中所述小麦植物种质赋予对如下水平的一种或多种乙酰辅酶A羧化酶除草剂所致抑制作用的抗性，所述一种或多种除草剂的水平通常会抑制小麦植物生长。在一些实施方式中，所述一种或多种乙酰辅酶A羧化酶除草剂来自于芳氧基苯氧基丙酸酯类(FOP)和环己二酮类(DM)化学品家族。在一些实施方式中，所述赋予对一种或多种乙酰辅酶A羧化酶除草剂所致抑制作用的抗性的小麦植物
种质包含在AF28-A、AF26-B和/或AF10-D(ATCC N0._)中所发现的乙酰辅酶A羧
化酶基因中的一个或多个突变。
`[0014]在另外的实施方式中，本发明提供了控制小麦植物或植物种群附近的杂草的方法，包括:提供一种或多种乙酰辅酶A羧化酶除草剂，将一种或多种乙酰辅酶A羧化酶除草剂施用到包含小麦植物或小麦植物种群的农田中，和控制所述小麦植物或植物种群附近的杂草，使得杂草的生长受到所述一种或多种乙酰辅酶A羧化酶除草剂的施用的不利影响，而所述小麦植物或其种群的生长没有受到不利影响。在一些实施方式中，所述一种或多种乙酰辅酶A羧化酶除草剂来自于芳氧基苯氧基丙酸酯类(FOP)和环己二酮类(DM)化学家族。在一些实施方式中，所述小麦植物或小麦植物种群包含在AF28-A，AF26-B和/或AFlO-D (ATCC N0._)中所发现的乙酰辅酶A羧化酶基因中的一个或多个突变。
[0015]在另外的实施方式中，本发明提供了小麦杂种、品系或品种，其中所述小麦杂种、品系或品种包含的种质包含乙酰辅酶A羧化酶基因中的一个或多个突变，以使得所述杂种、品系或品种被赋予对一种或多种乙酰辅酶A羧化酶除草剂的抗性。在一些实施方式中，通过包含所述一种或多种突变的小麦种质的渐渗来创建所述的小麦杂种、品系或品种，所述突变赋予对一种或多种乙酰辅酶A羧化酶除草剂的抗性。在一些实施方式中，通过掺入包含一个或多个突变的异源基因来创建所述的小麦杂种、品系或品种，所述突变赋予对一种或多种乙酰辅酶A羧化酶除草剂的抗性。
[0016]在另外的实施方式中，本发明提供了产生对一种或多种乙酰辅酶A羧化酶除草剂具有抗性的小麦杂种、品系或品种的方法，包括鉴定赋予所述除草剂抗性的种质，其中所述除草剂抗性种质衍生自除草剂抗性小麦植物，和将所述种质导入到良种小麦植物杂种、品系或品种中。在一些实施方式中，通过渐渗来将所述种质导入到所述良种小麦植物杂种、品系或品种中。在一些实施方式中，通过导入异源基因来将所述种质导入到所述良种小麦植物杂种、品系或品种中。
[0017]还是在另外的实施方式中，本发明提供了小麦杂种、品系或品种，其中所述杂种、品系或品种的种质包含被赋予的对一种或多种乙酰辅酶A羧化酶除草剂的抗性，以及对来自一个或多个非乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的除草剂组中的一种或多种化合物的抗性。
[0018]还是在另外的实施方式中，本发明提供了鉴定对乙酰辅酶A羧化酶除草剂具有抗性的小麦植物品系的方法，包括提供来自小麦植物的核酸样品，提供扩增引物，用于扩增存在于所述核酸样品中的对应于乙酰辅酶A羧化酶基因的小麦植物基因组区域，将所述扩增引物应用于所述核酸样品，使得发生所述乙酰辅酶A羧化酶基因的所述区域的扩增，并基于所述扩增的核酸样品中赋予乙酰辅酶A羧化酶除草剂抗性的一个或多个突变的存在来鉴定对乙酰辅酶A羧化酶除草剂具有抗性的小麦植物。
[0019]仍然在另外的实施方式中，本发明提供了小麦种子，其中所述种子的所述种质包含突变的乙酰辅酶A羧化酶基因，所述突变赋予对乙酰辅酶A羧化酶除草剂所致抑制作用的抗性。在一些实施方式中，所述小麦种子的种质包含在AF28-A，AF26-B和/或
AFlO-D(ATCC NO:_)中所发现的突变体乙酰辅酶A羧化酶基因。在一些实施方式中，
本发明提供了由所述种子生长得到的小麦植物，以及进一步的包含由所述种子生长得到的小麦植物的植物部分。在一些实施方式中，乙酰辅酶A羧化酶基因是AF28-A，AF26-B和/
或AF10-D(ATCC NO:_)中所发 现的基因的功能性片段，该基因片段编码的蛋白质片
段足以将对乙酰辅酶A羧化酶除草剂所致抑制作用的抗性赋予小麦植物。在一些实施方式中，本发明提供了由所述种子生长得到的小麦植物，以及进一步的包含由所述种子生长得到的小麦植物的植物部分。
[0020]在一些实施方式中，本发明提供了来自小麦的纯化和分离的核酸序列，其编码乙酰辅酶A羧化酶。根据本发明，从B、D和A基因组中鉴定出了编码乙酰辅酶A羧化酶的野生型序列(分别为SEQ ID N0:l、2和3)。另外，每个基因组的提供乙酰辅酶A羧化酶除草剂抗性的突变已经被鉴定出来，分别是SEQ ID N0:4、5和6。对于每个基因组，A基因组，(SEQ ID NO: 8)出基因组，(SEQ ID NO: 10)山基因组，(SEQ ID NO: 12)，该突变表示在氨基酸2004位置上的Ala向Val的改变(以标准黑草参考序列gi 1199600899 | emb | AM108429.1和 gi 1199600901 |emb|AM108430.1 为参考，SEQ ID No: 13、14、15 和 16，也见图 9)。本发明还包括由这些序列编码的氨基酸，包括SEQ ID N0:7、8、9、10、ll或12，以及保守性修饰的变体，和保留ACCase活性的片段及提供乙酰辅酶A羧化酶除草剂抗性的突变体。
[0021]因此，本发明的组合物包括分离的多肽，该多肽包含选自由以下组成的组中的氨基酸序列:(a)包含SEQ ID N0:7、9或11和SEQ ID N0:8、10或12的氨基酸序列和(b)与SEQ ID N0:7、9或11和SEQ ID NO:8、10或12具有至少90%、95%或99%序列相同性的氨基酸序列，其中所述多肽具有ACCase活性或提供对乙酰辅酶A羧化酶除草剂的抗性。
[0022]本发明还包括含有异源核苷酸序列的小麦植物，该核苷酸序列与SEQID N0:l、2、
3、4、5或6或者在4?28^?26-8和/或4?10-0(八了0: NO:_)中所发现的乙酰辅酶
A羧化酶序列具有至少70%同源性，至少80%同源性，至少85%同源性，至少90%同源性，至少95%同源性，至少97%同源性，或至少99%同源性。在一些实施方式中，所述乙酰辅酶A羧化酶序列编码或包含一个或多个氨基酸取代，例如，在SEQ ID N0:8中发现的Ala2004Val，在SEQ ID NO: 10中发现的_，在SEQ ID NO: 12中发现的_。
[0023]在一个实施方式中，本发明还提供了具有由所述种子生长得到的所述小麦植物的所有生理学和形态学特征的小麦杂交植物。在另外的实施方式中，本发明提供了来自于所述小麦种子或所述小麦植物部分的组织培养物和再生组织培养物，所述小麦种子或所述小
麦植物部分包含在AF28-A、AF26-B和/或AF10-D(ATCC NO:_)中所发现的乙酰辅酶
A羧化酶基因中的突变。
[0024]在一个实施方式中，本发明提供了产生小麦种子的方法，包括将包含突变体乙酰
辅酶A羧化酶基因(在AF28-A、AF26-B和/或AFlO-D (ATCCN0:_)中所发现)的植
物进行自交或与第二小麦植物进行杂交，从所述杂交中收集所述种子。在一些实施方式中，产生所述小麦种子的方法包括将亲本种子小麦品系与亲本授粉小麦品系一起种植，其中所述亲本种子品系包含赋予乙酰辅酶A羧化酶除草剂抗性的种质，其中所述授粉系和/或种子品系的种质包含赋予乙酰辅酶A羧化酶除草剂抗性的种质，使所述亲本种子和授粉小麦植物一起生长，使得所述亲本授粉植物向所述亲本种子植物授粉，并收集由所述授粉产生的种子。
[0025]在另一个实施方式中，本发明提供了掺入了异源核苷酸构建体的遗传修饰的小麦植物，该构建体包括可操作地连接到调控序列的SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6，例如表达盒，抑制构建体，植物，植物细胞和种子。本发明的遗传修饰的植物、植物细胞和种子可能会表现出表型的改变，例如经调控的ACCase或突变体ACCase水平。
[0026]提供了减少或消除·植物中ACCase多肽活性的方法，包括将选定的多核苷酸导入到所述植物中。在特定的方法中，提供所述多核苷酸降低植物中ACCase的水平。
[0027]还提供了在植物中组成型地或在具体调控的时间和组织中提高突变体ACCase多肽水平的方法，包括将选定的多核苷酸与合适的调控元件导入到植物中。在具体的方法中，突变体ACCase多核苷酸的表达提高植物对ACCase除草剂的耐受性。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是所发现的第一种除草剂耐受植物的图片。该植物在烯草酮除草剂的两次致死施用下存活。
[0029]图2是两株M2亲本的种子生长得到的M3植物的图片。用两个连续等级的致死剂量喹禾灵处理植物。左边的植物在除草剂的两个施用下存活，而右边的植物在除草剂的一次施用后死亡。
[0030]图3是剂量反应研究的图片，其显示，相比起未诱变的Hatcher冬小麦，M3代中所选择的突变体植物对喹禾灵除草剂耐受性提高。1、3和4栏是所针对增高的除草剂耐受性选择的植物；2栏是未诱变的Hatcher冬小麦。
[0031]图4是来自A、B和D基因组的ACCase基因以及突变体AF28-A的ACCase基因、突变体AF26-B和突变体AFlO-D基因的序列。
[0032]图5的图像描述了用喹禾灵筛选的源自M2的M3突变体的肉眼可见的损伤。水平线以下的数值与未诱变的Hatcher检查不同，由最左侧的标尺代表。[0033]图6的图像描述了用喹禾灵进行的剂量响应试验，其将未诱变的Hatcher对照(由最左侧的标尺代表)与M2-所选择的M3品系进行比较。
[0034]图7的图像展示了小麦A、B、D基因组中野生型和突变体ACCase序列的对比，包括每个突变体序列中新发现的一个非同义单核苷酸多态性(SNP)。
[0035]图8的图像显示了随着喹禾灵浓度的提高，ACCase酶耐受性的比较。
[0036]图9显示了将本发明的序列与黑草参考序列进行比对以及相互之间进行比对。
[0037]
[0038]为了提供对于说明书和权利要求书，包括此类术语的范围的明确和一致的理解，提供了下述定义。以SI接受的形式来表示单位、前缀和符号。除非另有说明，核酸的5’至3’方向在书写时是从左到右；氨基酸序列的氨基至羧基的方向在书写时是从左至右。数字范围包括定义该范围的数字，并且包括在所定义范围内的每个整数。本文中的氨基酸可以以它们公知的三个字母的符号或由IUPAC-1UB生化命名委员会所推荐的一个字母的符号来表示。同样的，核苷酸也可以以它们公知认可的单字母代码来表示。除非另有规定，本文所使用的软件、电学和电子术语如The New IEEE Standard Dictionary of Electricaland Electronics Terms (第5版，1993)所定义。下面所定义的术语是参照说明书整体来进行更充分的定义。
[0039]术语“保守性修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守性修饰变体是指那些编码相同氨基酸序列或氨基酸序列的保守性修饰变体的核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任意给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部都编码氨基酸丙氨酸。因此，在用密码子指定丙氨酸的每个位点，可将密码子改变为所描述的任意相应密码子，而不会改变编码的多肽。这种核酸变体是“无义变体”，代表着一种保守性修饰变体。通过参照遗传密码子，本文中编码多肽的每条核酸序列都描述了每种可能的核酸无义变体。本领域普通技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了 AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；以及UGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)都能被修饰以产生相同功能的分子。因此，编码本发明多肽的核酸序列的每个无义变体都隐含在每个所描述的多肽序列中，也在本发明的范围之内。
[0040]至于氨基酸序列，本领域普通技术人员将认识到，在编码序列中改变、添加或缺失了单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或插入改变是“保守性修饰变体”，这种改变导致氨基酸被化学性质相似的氨基酸所取代。因此，选自I至15中的任意整数个氨基酸残基都可以被如此改变。因此，例如，可以进行1、2、3、
4、5、7或10个氨基酸的改变。保守性修饰变体通常能够提供与衍生出该变体的未修饰多肽序列类似的生物活性。保守取代表格提供的功能类似的氨基酸在本领域都是公知的。
[0041]下面6组中每组含有的是相互之间为保守性取代的氨基酸。
[0042]1)丙氨酸(A)，丝氨酸(s)，苏氨酸(t)；
[0043]2)天冬氨酸⑶，谷氨酸(E)；
[0044]3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
[0045]4)精氨酸(R)，赖氨酸⑷；
[0046]5)异亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)以及
[0047]6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。[0048]同样参见 Creighton (1984)Proteins ff.H.Freeman and Company。本文所涉及到的任何序列都应当被解释为包括保守修饰变体。
[0049]对于具体的核酸，“编码(encoding) ”或“被编码(encoded) ”意为包括翻译成具体蛋白质的信息。编码蛋白的核酸可以在核酸的翻译区域包含非翻译序列(例如，内含子)，或者可以缺乏这种插入的非翻译序列(例如，在cDNA中)。使用密码子来表示编码蛋白质的信息。通常，核酸使用“通用”遗传密码子来编码氨基酸序列。然而，通用密码子的变体，例如存在于一些植物、动物和真菌的线粒体、细菌山羊衣原体、或纤毛虫大核中的通用密码子的变体，当核酸在它们之中表达时，可使用这些密码子变体。
[0050]当使用合成方法来制备或改变核酸时，可以利用在核酸要表达的预期宿主中已知的密码子偏好。例如，虽然本发明的核酸序列可以在单子叶植物和双子叶植物品种中表达，但是由于这些偏好已经显示出不同，因此要对序列进行修饰以考虑单子叶植物或双子叶植物的具体密码子偏好和GC含量偏好。
[0051 ] 如本文所使用的，当涉及核酸时的“异源”是来自于外源物种的核酸，或，如果是来自于相同的物种，则基本上是通过人为故意干预从其天然形式在组成上和/或对基因组基因座进行修饰得到的核酸。例如，可操作地连接到异源结构基因上的启动子所来自的物种与结构基因所来源的物种不同，或者，如果来自于相同的物种，其中一个或两个基本上由它们的原始形式修饰得到。异源蛋白可以来源于外源物种，或者，如果来自于相同的物种，则基本上是通过人为故意干预而由其原始形式修饰得到的。
[0052]“宿主细胞”是指包含载体，并支持该载体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物或双子叶 植物细胞。特别优选的单子叶植物宿主细胞是玉米宿主细胞。
[0053]在将核酸插入细胞的内容中，术语“导入”是指“转染”或“转化”或“转导”，包括涉及将核酸掺入到真核或原核细胞中，其中核酸可以掺入细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转变成自主复制子，或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
[0054]术语“分离的”指的是物质，例如核酸或蛋白，其⑴基本上或根本上是不含通常是伴随在一起的或发现在其天然存在的环境中是与其相接触的组分。分离的物质任选包括在其天然环境中没有发现与该物质在一起的物质；或者(2)如果该物质处于其天然环境中，则通过人为故意干预对该物质合成地(非天然地)改变其组成和/或将其置于对于在该环境中发现的物质是非天然的细胞位置中(例如，基因组或亚细胞器)。可以对处于其天然状态下或从其天然状态下移出的物质进行改变以产生合成的物质。例如，如果在核酸所来源的细胞中通过人为干预的方法对核酸进行改变，或者如果是由被改变的DNA转录，则天然存在的核酸就变为分离的核酸。见，例如Compounds and Methods for Site DirectedMutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiecj U.S.Pat.N0.5, 565, 350; In Vivo HomologousSequence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarling et al.，PCT/US93/03868。同样的，如果通过非天然存在的方法将核酸导入到对于该核酸是非天然的基因组基因座，则天然存在的核酸(例如，启动子)就变成分离的核酸。本文所定义的“分离的”核酸同样也被称为“异源的”核酸。
[0055]本文所用的“核酸”包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单链或双链形式的聚合物，除非另有限定，还包括具有天然核苷酸基本特征的已知类似物，即它们杂交到单链核酸上的方式与天然存在的核苷酸类似(例如，肽核酸)。
[0056]“核酸文库”是指分离的DNA或cDNA分子的集合，其包括并基本上代表了指定生物体基因组的整个转录部分。示例性核酸文库的构建，例如基因组和cDNA文库的构建在标准分子生物学参考文献中有所教导，例如Berger and Kimmel, Guide to Molecular CloningTechniques, Methods in EnzymologyjVol.152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.(Berger) ;Sambrook et al., Molecular Cloning—A Laboratory Manual,2nded., Vol.1-3(1989);以及 Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubelet al.，Eds.，Current Protocols,a joint venture between Greene PublishingAssociates, Inc.and John Wiley&Sons, Inc.(1994)。
[0057]本文所使用的“可操作地连接”包括启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始和介导第二序列对应的DNA序列的转录。一般来说，可操作地连接意味着所连接的核酸序列是连续的，并且如果要连接两个蛋白编码区，所连接的核酸序列是连续的并处于相同读码框中。
[0058]除非另有说明，术语“ACCase核酸”是指包含多核苷酸(“ACCase多核苷酸”)的核酸，该多核苷酸编码具有ACCase活性的ACCase多肽，并包括所有的保守性修饰变体，同源旁系等等。“ACCase基因”是本发明的基因，是指全长ACCase多核苷酸的异源基因组形式。
[0059]本文所使用的术语“植物”可以包括整个植物、植物部分或器官(例如，叶、莖、根等)、植物细胞、种子及后代。植物细胞，如本文所使用的，进一步包括而不限于获自种子、悬浮培养物、胚胎、分生组织、愈伤组织、叶、根、茎、配子体、孢子体、花粉、小孢子或从中发现的细胞。植物细胞也可以理解为包括修饰的细胞，例如，从上述组织中获得的原生质体。能够在本发明的方法中使用的植物的种类范围与适合于转化技术的高等植物范围相同，包括单子叶植物和双子叶植物。特别优选的植物包括玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦和小米。
`[0060]如本文中所使用的，“多核苷`酸”包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物，所述类似物具有天然核糖核苷酸的必要特征，在严格条件下与天然存在的核苷酸杂交至基本上相同的核苷酸序列上，和/或允许与天然存在的核苷酸一样翻译成相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源的结构基因或调苄基因的全长或亚序列。除非另有表示，该术语包括涉及具体的序列及其互补序列。因此，出于稳定性或其它原因而经过主链修饰的DNA或RNA与也是本文所指的术语“多核苷酸”。此外，包含不常见碱基(例如肌苷)或修饰的碱基(例如三苯甲基化的碱基)的DNA或RNA (仅仅举两个例子)也是本文所使用的术语“多核苷酸”。可以认识到，已经对DNA和RNA进行许多种的修饰以实现本领域技术人员所已知的多种有用目的。这里所采用的术语多核苷酸包括多核苷酸的化学、酶或代谢性修饰的形式，以及病毒和细胞(包括简单和复杂的细胞)的特征性DNA和RNA化学形式。
[0061 ] 本文所使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。天然存在氨基酸的此类类似物的基本特征是，当掺入到蛋白质中时，该蛋白对完全由天然存在氨基酸所组成的相同蛋白所激发的抗体也具有特异性反应性。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”还包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的Y-羧化、羟化和ADP-核糖基化。可以认识到，众所周知并如上所述，多肽并不是完全的线性。例如，由于泛素化，多肽可以是分支的，它们也可以是环状的，具有或不具有分支，通常是由于翻译后事件的结果，包括天然发生事件和人为操纵的非天然发生的事件。环状、分支和分支环状的多肽可以通过非翻译的天然过程和完全的合成方法来进行合成。此外，本发明涉及本发明蛋白质的氨基末端含甲硫氨酸和不含甲硫氨酸变体的用途。
[0062]本文所使用的“启动子”包括转录起始位点上游的，并且参与RNA聚合酶和其他蛋白质识别和结合以进行转录起始的DNA区域。“植物启动子”是能够在植物细胞中起始转录的启动子，无论其来源是否是植物细胞。示例性的植物启动子包括，但不限于获自植物、植物病毒和包含在植物中表达的基因的细菌(例如农杆菌或根瘤菌)的那些启动子。处于发育控制下的启动子的示例包括能优先在特定组织中(例如叶、根、或种子)起始转录的启动子。这种启动子被称为“组织优先性”。只在特定组织中起始转录的启动子被称为“组织特异性”。“细胞类型”特异性启动子主要是在一种或多种器官的特定细胞类型中驱动表达，例如，根和叶中的维管细胞。“诱导型”或“抑制型”启动子是处于环境控制之下的启动子。可能影响诱导型启动子驱动转录的环境条件的示例包括厌氧条件或存在光。组织特异性、组织优先性、细胞类型特异性和诱导性启动子构成了“非组成型”启动子类型。“组成型”启动子是在大多数环境条件下都具有活性的启动子。
[0063]本文所使用的“重组”或“基因修饰”包括通过导入异源核酸而被改变的细胞或载体，或者衍生自所述被修饰细胞的细胞。因此，例如，重组或基因修饰细胞表达并没有发现在细胞天然形式中(未重组)以相同形式存在的基因，或者表达由于人为的故意干预而异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。本文所使用的术语“重组”或“遗传修饰”并不包括由天然发生事件造成的细胞或载体的改变(例如，自发突变、自然转化/转导/转座)例如非人为故意干预而发生的那些事件。
[0064]本文所使用的“表达盒”是核酸构建体，由重组或合成所产生，具有能够允许特定核酸在宿主细胞中转录的一系列核酸元件。重组表达盒能够掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片·段中。通常，表达载体的重组表达盒部分除其他序列外，包括待转录的核酸和启动子。
[0065]术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，是指掺入蛋白质、多肽或肽(统称“蛋白质”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另有限定，也可包括天然氨基酸的非天然类似物，该类似物与天然存在的氨基酸功能类似。
[0066]术语“选择性杂交”包括在严格杂交条件下，核酸序列与指定的核酸靶序列的杂交的可检测性程度要大于(例如，至少是背景的2倍)其与非靶核酸序列的杂交，并基本上排除了非靶核酸。选择性杂交序列彼此之间通常具有约至少80%的序列相同性，优选90%序列相同性，最优选100%的序列相同性(例如，互补)。
[0067]术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括在该条件下，探针与其靶序列杂交的可检测性程度要大于与其他序列杂交的程度(例如，在背景之上至少2倍)。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与探针100%互补的靶序列(同源探测)。另外，可以调整严格条件以允许序列中有一些错配，以使得可以检测出较低程度的相似性(异源探测)。一般来说，探针的长度小于1000个核苷酸，优选其长度小于500个核苷酸。
[0068]通常，严格条件是盐浓度小于1.5M Na离子，通常约0.001至1.0M Na离子浓度(或其他盐类)，ρΗ7.0至8.3，对于短探针(例如，10至50个核苷酸)温度至少约为30°C，对于长探针(例如大于50个核苷酸)至少为约60°C的条件。也可以加入去稳定剂例如甲酰胺来达到严格条件。示例性的低严格条件包括在30-35%甲酰胺，IM NaCl, 1%SDS的溶液中，在37°C下杂交，以及在IX至2X SSC中(20X SSC=3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)，在50°C至55°C下洗涤。示例性的中等严格条件包括在40-45%甲酰胺，IM NaCl, 1%SDS的溶液中，在37°C下杂交，以及在0.5X至IX SSC中，在55°C至50°C下洗涤。示例性的高严格条件包括在50%甲酰胺，IM NaCl, 1%SDS的溶液中，在37°C下杂交，以及在0.1X SSC中，在60°C下洗涤20分钟。
[0069]特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素为离子强度和最终洗涤溶液温度。对于 DNA-DNA 杂交，可以从 Meinkoth and Wahl, Anal.Biochem.，138:267-284 (1984)的方程中估算 Tm:Tm=81.5°C.+16.6 (log Μ) +0.41 (%GC) -0.61 (%form) -500/L，其中 M 是一价阳离子的摩尔浓度，%GC是DNA中鸟苷酸和胞嘧啶核苷酸的比例，％form是甲酰胺在杂交溶液中的比例，L是杂交的碱基对的长度。Tm是这样的温度(在特定的离子强度和pH下)，在该温度下，有50%的互补序列与完美匹配的探针杂交。对于每1%的错配，Tm减少约1°C ;因此，可以调整Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交到具有所需相同性的序列上。举例而言，如果需要找寻具有.gtoreq.90%相同性的序列，则可Tm降低10°C。通常,对于在具体离子强度和PH下的特异性序列及其互补序列，所选择的严格条件要比热熔点(Tm)低约5°C。然而，非常严格条件可以利用在比热熔点(Tm)低1、2、3、4、5或6°C下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以 利用在比热熔点(Tm)低7、8、9或10°C下的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用在比热熔点(Tm)低11、12、13、14、15或20°C下的杂交和/或洗涤。使用该方程、杂交和洗涤组合物以及所需的Tm，本领域普通技术人员将会理解也隐含描述了杂交和/或洗涤溶液严格性的其他变化形式。如果所需的错配程度导致Tm小于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，则优选提高SSC的浓度以使得使用更高的温度。对于核酸杂交的外延指导提供在 Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Acids Probes,Part I, Chapter2, Ausubel, etal., Eds., Greene Publishing and ffiley-1nterscience, New York(1995)中。一般而言，高严格洗涤是在含有0.1%SDS的0.5XSSC中，在65°C下洗涤2X15分钟。
[0070]本文中所使用的“转基因植物”或“基因修饰植物”包括涉及在其基因组中包括异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸被稳定整合进基因组中，使得该多核苷酸能够传递给后代。异源多核苷酸可以单独或作为表达盒的部分而整合进基因组中。本文中所使用的“转基因”或“遗传修饰”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型是通过异源核酸的存在而被改变，包括那些最初被改变的转基因，以及通过有性杂交或无性繁殖从最初转基因中创建出来的。这里所使用的术语“转基因”或“遗传修饰”并不包括由常规植物育种方法或天然发生事件造成的基因组(染色体或染色体外)改变，例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转位或自发突变。
[0071]本文中使用的“载体”包括用于转染宿主细胞并将多核苷酸插入其中的核酸。载体往往是复制子。表达载体允许插入其中的核酸进行转录。[0072]用下列术语来描述两个或两个以上的核酸或多核苷酸序列之间的关系:(a) “参考序列”，(b) “比对窗口”，(C) “序列相同性”，(d) “序列相同性百分比”，和(e) “实质相同性”。
[0073]如本文中所使用的，“参考序列”是作为序列比对基础的确定序列。参考序列可能是特定序列的子集或全部；例如，是全长cDNA或基因序列的节段，或者是完整的cDNA或基因序列。
[0074]如本文中所使用的，“比对窗口 ”包括多核苷酸序列的连续和特定的节段，其中多核苷酸序列可以与参考序列进行比对，且其中与参考序列(其并不包含添加或缺失)相比，在比对窗口中的多核苷酸部分可以包括添加或缺失(例如，缺口)，以对两条序列进行最优比对。一般来说，对比窗口的长度为至少20个连续的核苷酸，优选可以是30、40、50、10020个连续的核苷酸或更长。本领域技术人员会理解，为了避免由于多核苷酸序列中包括缺口而使得与参考序列具有很高的相似性，通常导入缺口罚分，并从匹配数目中将其减去。
[0075]对序列进行对比的比对方法在本领域是已知的。对序列进行对比的最优比对可通过下述来实施:Smith和Waterman, Adv.App1.Math.2:482 (1981)的局部同源比对算法；Needleman and ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970)的同源比对算法；Pearsonand Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.85:2444 (1988)的搜索相似性方法；用计算机实现这些算法，包括，但不限于:1ntelligenetics, Mountain View, Calif.的 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL ;Genetics Computer Group (GCG), 575Science Dr., Madison, ffis., USA,Wisconsin Genetics Software Package 中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA ；Higgins and Sharp, Gene73:237-244(1988)Higgins and Sharp, CAB10S5:151-153(1989)
;Corpet, et al., Nucleic Acids Researchl6:10881-90(1988);Huang, et al., ComputerApplications in the Biosciences8:155-65 (1992)以及 Pearson,et al., Methodsin Molecular Biology24:307-331 (1994)中详细描述了 CLUSTAL 程序。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括:用于在核苷酸数据库序列中用核苷酸查询序列的BLASTN ;用于在蛋白质数据库序列中用核苷酸查询序列的BLASTX ;用于在蛋白质数据库序列中用蛋白质查询序列的BLASTP ;用于在核苷酸数据库序列中用蛋白质查询序列的TBLASTN ;以及在核苷酸数据库序列中用核苷酸查询序列的TBLASTX。见CurrentProtocolsin Molecular Biology,Chapterl9, Ausubel, et al., Eds.,GreenePublishing andffiley-1nterscience, New York(1995)。
[0076]除非另有说明，本文所提供的序列相同性/相似性数值是指使用BLAST2.0程序套件，利用默认参数所得到的数值。Altschul et al., Nucleic AcidsRes.25:3389-3402(1997)。实施BLAST分析的软件是公众可获得的，例如，通过NationalCenter for Biotechnology-1nformation www.hcb1.nlm.nih.gov/)。该算法包括首先通过在查询序列中确定长度为W的短字段来确定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字段比对时，其匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为相邻字串得分阈值(Altschul et al.，supra)。这些起始相邻字串命中作为种子发起搜索，以寻找含有它们的更长HSP。字串命中沿着每条序 列向两个方向延伸，直到累积比对得分不再增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对匹配残基对的奖励得分，总是>0)和N(对错配残基的罚分，总是〈O)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用打分矩阵来计算累积得分。当:累积比对得分从其达到的最大值下降了数值X时；由于一个或多个负分值残基比对使累积得分达到O及O以下时；或者到达任何一条序列的末端时，停止命中字段在各个方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的敏感度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用的默认值为字串长度(W)为11，期望值(E)为10，阈值100，M=5, N=-4,以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值为字串长度(W)为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62打分矩阵(see Henikoff&Henikoff (1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915)。
[0077]除了计算序列相同性百分比，BLAST算法还可以实现两条序列之间的相似性数据分析(see, e.g.，Karlin&Altschul, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5787 (1993))。BLAST算法提供的其中一种相似性测量方法是最小和概率(P(N))，其表示了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率。
[0078]BLAST搜索假定可以将蛋白质建模为随机序列。然而，许多真实的蛋白质包含非随机序列的区域，该序列可以是同聚束(homopolymeric tract)、短周期重复、或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂度区域可以在互不相关的蛋白质之间比对，即使这些蛋白的其他区域完全不相似。可以采用一些低复杂度过滤程序来减少这种低复杂度比对。例如，可以单独或组合米用 SEG (Wooten and Federhen, Comput.Chem., 17:149-163 (1993))和XNU(Claverie and States, Comput.Chem., 17:191-201 (1993))的低复杂度过滤。
[0079]在涉及两条核酸或多肽序列的内容中，本文所使用的“序列相同性”或“相同性”包括当以最大对应性进行比对时，在特定的比较窗口中两条序列相同的残基。当序列相同性百分比用于指蛋白质时，可以认为不相同残基位置的不同往往是由保守性氨基酸的取代所造成的，在该位置上的氨基酸残基被其他的具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基所代替，因此并不会改变分子的功能特性。当序列的不同是在于保守性取代时，可以向上校正序列相同性百分比以校准取代的保守性。由这种保守性的取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行校正的方法是本领域技术人员熟知的。通常涉及将保守性取代作为部分而不是完全的错配进行打分，因此增加了序列相同性百分比。因此，举个例子，相同的氨基酸所给的得分为1，而非保守性取代所给的得分为0，则保守性取代所给的得分为O至I之间。例如，根据Meyers and Miller, Computer Applic.Biol.Sc1., 4:11-17 (1988)的在程序 PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, Calif., USA)中所执行的算法来计算保守性取代的得分。
[0080]本文所使用的“序列相同性百分比”是指通过在一个比较窗口内比较两条最优比对的序列所确定的值，其中当与参考序列(其并不包含添加或缺失)进行比较时，多核苷酸序列在比较窗口中的部分可以包含添加或缺失(即间隙)，以实现两条序列的最优比对。通过以下来计算百分比:确定两条序列中出现相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置的数目，以产生匹配位置的数量，用比较窗口中位置的总数除匹配位置的数目，将结果乘以100，以产生序列相同性百分比。
[0081]本文所使用的术语“品种”和“栽培种”是指由给定基因型或基因型组合获得的特征表达所定义的植物，其通过表达至少一种所述特征而与其他的植物种群相区别，并且就其适合不变地进行繁殖而言可被认为是一个整体(unit)。
[0082]本文所使用的术语“杂种”是指在遗传学上不相似的植物亲本的后代或子代，或者是指与自然授粉所产生的非杂交种子相对的由控制交叉授粉而产生的原种(Stock)。[0083]本文所使用的术语“后代(progeny) ”是指植物的世代，其中该世代的祖先可以追溯到所述植物。本文所使用的术语除草剂抗性植物的“后代”包括除草剂抗性植物的后代以及该植物的任何突变体、重组或遗传修饰的衍生植物，无论是相同的物种或不同的物种，其中原始除草剂抗性植物的除草剂抗性特性已经转移到所述后代植物中。
[0084]本文所使用的术语“植物组织”包括分化和未分化的植物组织，包括那些存在于根、枝条、叶、花粉、种子和瘤中的组织，以及培养中的细胞(例如，单细胞、原生质体、胚、愈伤组织等)。植物组织可以在植株中，在器官培养物，组织培养物或细胞培养物中。
[0085]本文所使用的术语“植物部分”在本文中使用是指植物结构或植物组织，例如，花粉、胚珠、组织、豆荚、种子和细胞。在本发明的一些实施方式中，转基因植物是作物植物。本文所使用的术语“作物”和“作物植物”是以它们的广义来使用的。该术语包括但不限于，可被人类食用的、用作动物或鱼类或海洋动物饲料的、或被人类食用或使用或观赏的任何种类的植物，或者是用于工业或商业或教育的任何植物。
[0086]本文所使用，涉及植物的术语“良种种质”是指被证明具有遗传优势的遗传材料。
[0087]本文所使用的术语“良种植物”是指对优良的农艺性能进行选择和育种所得到的任何植物。
[0088]本文所使用的术语“性状”是指生物体的可被观察和测量的特性。例如，本发明描述了对FOP和DIM除草剂具有抗性的植物。
[0089]本文所使用的术语“标记”和“DNA标记”以及关于“选择标记”的“分子标记”是指生理学或形态学性状，被确定为用于其本身的选择的标记或用于选择其他的与该标记紧密连锁的性状的标记。例如，这样的标记可以是与除草剂耐受性相关的基因或性状，包括但不限于简单重复序列(SSR)、单核苷酸多态性(SNP)、基因插入和/或缺失等等。
[0090]本文所使用的术语·“渐渗(introgress) ”和“渐渗(introgressing) ”和“渐渗(intoogression)”是指将外源遗传物质掺入育种原种品系的常规(即经典)授粉育种技术。例如，本发明提供了通过杂交两个植物世代而渐渗入除草剂耐受的突变体ACCase基因的小麦作物植物。
[0091]当涉及基因时，本文所使用的术语“野生型”是指在植物种群中常见的功能性基因。功能性野生型基因是在群体中最常被观察到的基因，因此可任意地叫做基因的“正常”或“野生型”形式。
[0092]本文所使用的术语“突变体”或“功能性突变体”当涉及基因或基因产物时分别是指与野生型基因或基因产物相比，表现出序列和/或功能特性修饰(即改变的特征)的基因或基因产物。因此，当用于涉及核苷酸序列时，术语“修饰的”和“突变”是指与另外的，通常是相关的核苷酸序列有一个或多个核苷酸不同的核酸序列，当用于涉及由所述“修饰的”或“突变”核酸编码的多肽时，术语“功能性突变体”是指保持了活性的蛋白或多肽。在本申请中，ACCase突变体蛋白，或其“功能性突变体”是保持了其天然创造必需氨基酸的活性的ACCase基因。此外，“修饰的”核苷酸序列被解释为如在本领域技术人员已知的简并密码子中所发现的那样。例如，遗传密码子是简并的，因为有很多不同密码子代表相同氨基酸的例子；遗传密码子中有一些氨基酸可能每个都是由一个以上的密码子编码。可以预见的是，本发明可以包括这种简并，例如，其中小麦杂种包含与SEQ ID1、2、3、4、5或6，或与在AF28-A、AF26-B和/或AF10-D(ATCC N0._)中发现的序列具有至少70%同源性、至少80%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少97%同源性、或至少99%同源性的在例如小麦种质中所发现的ACCase。
[0093]发明详沭
[0094]乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是催化乙酰辅酶A的羧化以生成丙二酸单酰辅酶A的生物素化酶。这个羧化是一个两步可逆的反应，由如下组成:由生物素羧化酶活性对羧基载体结构域的生物素基团进行ATP-依赖性羧化，然后由羧基转移酶活性将羧基基团从生物素转移至乙酸辅酶 A(Nikolau et al.，2003，Arch.Biochem.Biophys.414:211-22)。乙酸辅酶A羧化酶不仅仅是植物体内脂肪酸合成的关键酶(合成过程发生在叶绿体和线粒体中)，ACCase还在长链脂肪酸和黄酮的形成过程中，以及发生在细胞质内的丙二酰化过程中发挥作用。ACCase有两种同工型，其中叶绿体ACCase占总ACCase活性的比例超过80%(Herbertet al.，1996，Biochem.J.318:997-1006)。芳氧基苯氧基(FOP)和环己二丽(DIM)是已知能选择性抑制杂草中叶绿体ACCase的两类化学物质(Rendina et al., 1990, J.Agric.FoodChem.38:1282-1287)。
[0095]将小麦品种的种子暴露在化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)下，种植并评估其对ACCase除草剂的耐受性。其中一种基因型，AF28_A(SEQ ID NO:4)对所测试的每种除草剂都表达出高水平的耐受性。本文进一步证实，将AF28-A、AF26-B和/或AFlO-D与良种亲本品系杂交会产生良好的种子组以及在后代植物中产生ACCase除草剂抗性。
[0096]因此，本发明的一个实施方式提供了含有改变的ACCase基因和蛋白质的植物种质。在一些实施方式中，本发明提供了 ACCase除草剂用于杂种植物的农田中以减少存在于所述作物农田中的单子叶杂草植物数量的用途，其中所述杂种种质包含改变的赋予ACCase除草剂抗性的ACCase酶，并且所述杂草植物是ACCase除草剂易感的。优选的植物包括小麦、稻和大麦或其它具有类似突变的单子叶谷物植物。
[0097]在一个实施方式中，本发明提供了具有对ACCase除草剂所致抑制作用的抗性的植物，所述对ACCase除草剂所致抑制作用的抗性是单独的或与与其它的抗性性状组合，所述其它抗性性状例如对禾草螟(Chilo partellus)的昆虫抗性(Girijashankar etal., 2005, Plant Cell R印.24:513-522，以其整体并入本文)。在一些实施方式中，例如，其种质包含来自于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的合成cryIAc基因的小麦杂种，被渐渗至其种质提供ACCase除草剂抗性的小麦品系中。同样，ACCase除草剂抗性和昆虫抗性的掺入是通过植物转基因至相同的小麦杂种中来完成的。本领域技术人员将知道本文所述的适合于将两种或更多种抗性属性并入到同一个植物中的各种技术。
[0098]在一个实施方式中，本发明提供了在植物中的ACCase除草剂抗性，包括，例如，通
过植物育种和选择将名为AF28-A、AF26-B和/或AF10-D，ATCC N0._的ACCase种质
整合进良种品种中，从而开发出对用于杂草控制的ACCase抑制性除草剂具有耐受性的除草剂耐受性植物。在上述植物中开发该除草剂耐受性性状允许使用这些除草剂来控制在这些作物存在时生长的单子叶杂草。在一些实施方式中，通过渐渗或经典的育种方法来将ACCase抗性性状导入良种品系的。在一些实施方式中，是通过异源基因转基因利用表达或抑制构建体将ACCase抗性基因导入到良种品系中。在一些实施方式中，本发明提供了植
物，优选小麦，其中该小麦植物的至少一个祖先包含来自于保藏在ATCC登录号:_
下的名为AF28-A的种质的ACCase抗性基因。在一些实施方式中，ACCase抗性除草剂基因包括与SEQ ID NO: 4，或者与保藏在ATCC登录号:_下的AF28-A中所发现的ACCase
抗性除草剂基因具有至少70%同源性、至少80%同源性、至少85%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少97%同源性、或至少99%同源性的核酸序列。在一些实施方式中，
ACCase抗性除草剂基因与SEQ ID NO: 4，或者与保藏在ATCC登录号:_下的AF28-A
中所发现的包含Ala2004Val氨基酸取代的ACCase抗性除草剂基因具有至少70%同源性、至少80%同源性、至少85%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少97%同源性、或至少99%同源性。
[0099]在一些实施方式中，使用经典的育种技术将ACCase除草剂抗性种质渗入到良种植物品系中。用于小麦，大麦，稻和其他单子叶谷类作物的经典育种方法的示例可以在，例如 Sleper and Poehlman, 2006, Breeding Field Crops, Fifth Edition, BlackwellPublishing中找到，并以其全部并入本文之中。
[0100]在一个实施方式中，将ACCase除草剂抗性种质渗入到提供食物供人类消耗的植物中，优选小麦。在一些实施方式中，将ACCase除草剂抗性种质渗入到为牲畜(例如，家禽，牛，猪，羊等)提供食物的小麦植物中。在一些实施方式中，将ACCase除草剂抗性种质渗入到用于诸如乙醇产生等工业工艺的小麦植物中。在一个实施方式中，利用载体和本领域已知技术通过转基因将ACCase除草剂抗性基因导入植物基因组中。
[0101]在一些实施方式中，本发明提供了保藏在ATCC登录号:_下的AF28-A品
系中的小麦植物部分的ACCase抗性种质，所述小麦植物部分是花粉、胚珠、组织、豆荚和细胞中的一种或多种。在一个实施方式中，本发明提供了 Fl杂种，其种质包含如本文所述的ACCase抗性基因。在一些实施方式中，Fl杂种是两个良种小麦品系的杂交品种，其中至少一个品系含有的种质包含如本文所述的ACCase抗性基因。
`[0102]在一个实施方式中，本发明提供了在植物群体中控制杂草的方法。在一些实施方式中，控制杂草包括向所述植物群体施用ACCase除草剂，这样使杂草的生长受到抑制而不会对植物的生长带来不利影响。在一些实施方式中，所施用的ACCase除草剂来自于芳氧基苯氧基丙酸酯类(FOP)除草剂家族，包括但不限于，炔草酯(clodinafop-propargyl)、氰氟草酯(cyhalofop-butyl)、禾草灵(diclofop-methyl)、精恶唑禾草灵(fenoxaprop-p-ethyl)、批氟禾草灵(fluazifop-b-butyl)、氟吡乙禾灵(haloxyfop-ethoxyethyl)、吡氟甲禾灵(haloxyfop-etotyl)、氟吡甲禾灵(haloxyfop-R-methyl)、恶草酸(propaquizafop)、精喹禾灵(quizalofop-p-ethyl)和quizalo-p-refuryl化合物。在一些实施方式中，所应用的ACCase除草剂来自于环己二酮类(DIM)除草剂家族，包括但不限于:禾草灭(alloxydim)、丁苯草酮(butroxydim)、clefoxydim、烯草酮(clethodim)、噻草酮(cycloxydim)、环苯草酮(profoxydim)、烯禾唳(sethoxydim)、吡喃草酮(teproloxydim)和三甲苯草酮(tralkoxydim)化合物。在一些实施方式中，所应用的ACCase除草剂包括来自于如本文所公开的FOP和DM ACCase除草剂家族的化合物的组合。然而，本发明并不局限于所使用的ACCase除草剂，本领域技术人员将领会到，在任何给定的时间内将会发现新的能抑制ACCase酶的ACCase除草剂。
[0103]在一个实施方式中，本发明提供了植物(例如Fl，F2，F3，F4等)，其种质赋予对ACCase除草剂以及来自于一个或多个不同除草剂组的一种或多种额外除草剂的抗性。例如，用于抑制杂草生长的另外的除草剂组包括但不限于，脂质合成抑制剂(例如，芳氧基苯氧基丙酸酯、环己二酮、苯并呋喃、氯甲酸、二硫代磷酸酯、硫代氨基甲酸酯)，光合系统II中光合作用抑制剂(例如，苯基氨基甲酸酯、咕嗪酮、三嗪、三嗪酮(triazinone)、三唑啉酮(triazolinone)、尿嘧唳、酰胺、尿素、苯并噻二嗪酮(benzothiadiazinone)、腈、苯基吡啶)，光合系统I中光合作用抑制剂(例如，双吡啶)，卟啉原氧化酶抑制剂(例如，二苯醚，N-苯基邻苯二甲酸亚胺(N-phenyl phthalimide),噁二唑，oyzolidinedione,苯批唑，嘧啶二酮，噻二唑)，类胡萝卜素生物合成抑制剂(例如，哒嗪酮，吡啶羧基酰胺，异噁唑酮(isoxazolidinone),三唑(tirazole)), 4-轻苯基丙酮酸双氧化酶抑制剂(例如，红千层(callistemone),异恶唑,批唑，三酮)，EPSP合酶抑制剂(例如，甘氨酸)，谷氨酰胺合成酶抑制剂(例如，次膦酸)，二氢蝶酸合酶抑制剂(例如，氨基甲酸酯)，微管组装抑制剂(例如，苯甲酰胺、苯甲酸、二硝基苯胺、磷酸酰胺化物(phosphoroamidate)、吡唳),细胞分裂抑制剂(例如，乙酰胺，氯乙酰胺，氧乙酰胺(oxyacetamides)),细胞壁合成抑制剂(例如，腈，三唑羧基酰胺(triazolocarboxamides))以及生长素运输抑制剂(例如，phthalamates,缩氨基脲)。在一些实施方式中,本发明提供了来自于良种植物品系的Fl杂种，其包含对一种或多种ACCase除草剂的抗性，单独地或与对上述除草剂组中一种或多种除草剂的抗性组合。
[0104]在一个实施方式中，本发明提供了包含SEQ ID N0:l、2、3、4、5或6(编码野生型或突变体ACCase蛋白质(SEQ ID N07、8、9、10、11或12))的异源核苷酸序列的用途，其用于提供选定的ACCase除草剂抗性农艺性状。在一个实施方式中，核苷酸序列包含在保藏于ATCC
登录号:_下的名为AF28-A、AF26-B和/或AFlO-D的种质中所发现的突变体ACCase
基因。在一些实施方式中，核苷酸序列与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有至少70%同源性、至少80%同源性、至少85%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少97%同源性、或至少99%同源性。在一些实施方式中，ACCase核苷酸序列可操作地连接至启动子序列，并形成表达或抑制构建体的组成部分，并且在一些实施方式中，ACCase核苷酸序列与在AF28_A、AF26_B和/或AF10-D中所发现的ACCase抗性除草剂基因，或与在A、`B、D基因组中包含氨基酸取代Ala2004Val的SEQID NO:4,SEQ ID N0:5和/或SEQ ID NO:6具有至少70%同源性、至少80%同源性、至少85%同源性、至少90%同源性、至少95%同源性、至少97%同源性、或至少99%同源性。
[0105]经典小麦育种
[0106]通过利用植物授粉方法的技术，已经对农田作物进行了经典育种。如果花粉可以从一朵花转移到同一株植物的同一朵或另外一朵花上，则认为该植物是“自花授粉”，而如果来自于另一株植物的花朵的花粉发生授粉时，则认为该植物是“异花授粉”。经过多代而被挑选出来的自花授粉植物会在其如果不是全部也是大多数的基因位点上变为纯合的，从而产生均一的(uniform)真正育种后代群体。将来自于不同背景的两种纯合植物，或者将两个不同的纯合品系进行杂交，将会产生均一的杂种植物群体，该杂种植物在很多基因位点上更可能是杂合的。将两种在很多基因位点上都是杂合的植物进行杂交，将会产生遗传学上不相同且不均一的杂种植物子代。
[0107]小麦植物是自花授粉植物，但是它们也可以通过异花授粉繁殖。开发小麦杂种需要开发授粉亲本(育性恢复)和使用细胞质雄性不育恢复系统的种子亲本自交系，将种子亲本和授粉亲本进行杂交，对杂交进行评估。也可以使用用于提供杂种母本雄性不育性的化学杂交制剂来开发小麦杂种。谱系育种程序组合了理想的性状；在本发明中，理想性状是植物对ACCase除草剂的抗性。将这个性状放进来自于一个或多个品系的育种池中，使得通过杂交创建新的自交系，然后挑选具有理想性状的植物，接着进行更多的杂交，等等。将新的自交系与其他的自交系进行杂交(例如，如本文所描述的那些良种植物品系)。
[0108]谱系育种起始于将两种基因型杂交，例如AF28-A、AF26-B和/或AFlO-D与良种小麦品系。如果原始的两个亲本不能提供全部的理想特性，则可以在育种群体中包括其他的来源。例如，如果需要杂种同时得到ACCase除草剂抗性和对本文所述的其他除草剂组的抗性，则可以利用经典育种技术将具有这些特性的植物进行杂交。在谱系方法中，优势植物自花授粉并且选择连续几代。在随后的几代中，由于自花授粉和选择，杂合状态让步于纯合植物的纯合品系。通常，在谱系方法中，可进行五代或更多代的自花授粉和选择(例如，SI，
S2,S3, S4, S5 等)。
[0109]回交育种被用于改良植物品系。回交育种将一个或多个特定的理想性状从一个来源转移到缺少该性状的另一个来源。这可以通过，例如，将供体(例如，AF28-A)与良种自交系(例如，良种品系)进行杂交来完成。该杂交的后代再回过来与良种自交系进行杂交(即回交)，接着在所产生的后代中选择所需要的性状(例如，对ACCase除草剂的抗性)。在五个或更多个世代并且对所需性状进行选择之后，该后代在控制所需表型的位置(位点)上通常是杂合的，但是在其他遗传性状上将会与良种亲本很相像。最后的回交则是典型的自花授粉以给出所转移的基因的纯的育种后代。
[0110]在目前的杂交小麦育种程序中，新亲本系开发为种子亲本系还是花粉亲本系取决于它们是否含有育性恢复基因；种子亲本系不含有育性恢复基因且在某些的胞质中是雄性不育的(也被称为“A”品 系植物)，而在其他的胞质中则是雄性可育的(也被称为“B”系植物)，然而，花粉亲本品系不是雄性不育的，并含有雄性恢复基因(也被称为“R”系植物)。通常将种子亲本品系创建成胞质雄性不育，使得这些植物中的花药极小至不存在，因此需要异花授粉。种子亲本品系只产生种子，胞质的传递仅通过卵来完成。含有在Fl杂种中完全恢复育性所必需的基因的亲本品系提供用于异花授粉的花粉，该杂交与雄性不育种子亲本联合产生具有良好籽粒品质的高产单交种。
[0111]通常,通过种植成行成片的雄性不育植物(种子亲本)和成行成片的育性恢复植物(花粉亲本)，使花粉亲本植物的花粉对种子亲本进行风媒授粉来实施该胞质雄性不育育性恢复系统以产生杂交种子。该过程产生了被消费者收获和种植的茁壮的单交种。也可以通过将隐性核不育基因遗传育种至特定的种群中来创建雄性不育的种子亲本植物，然而胞质雄性不育育性恢复系统仍然是用于育种杂交小麦的经典系统，不过化学诱导雄性不育也已经被广泛使用。Sleper and Poehlman, 2006, Breeding Field Crops, FifthEd.，Blackwell Publishing提供了关于当前小麦育种程序的很好的综述，以其全部并入本文。
[0112]本发明并不局限于所列举的小麦品系，本领域技术人员将认识到，任何良种小麦品系同样都适合于本发明描述的组合物和方法。
[0113]植物转基因
[0114]本发明的组合物包括被鉴定为ACCase编码序列(其参与植物对ACCase除草剂的响应)的小麦核苷酸序列。具体地，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码SEQ ID NO:5、6、7、8和9所示氨基酸序列的核苷酸序列。进一步提供了具有由本文所述核酸分子编码的氨基酸序列的多肽，例如，SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6所示的那些核苷酸序列。
[0115]本发明的组合物可以用于各种方法中，通过这些方法蛋白产物可以在作物植物中表达，作为除草剂抗性蛋白行使功能。这种表达导致表达的水平、组织或时间发生改变或调整以实现ACCase除草剂抗性的改良。本发明的组合物可以在与特定ACCase的来源相同的物种中表达，或者，也可以在任何感兴趣的物种中表达。用这种方式，ACCase的编码序列可以与导入到作物植物中的启动子组合使用。在一个实施方式中，可使用高水平表达组成型启动子，导致ACC的高水平表达。在其他的实施方式中，将编码序列可操作地连接至组织特异性启动子上，以指导其在已知对ACCase除草剂易感的植物组织中表达，例如叶子。同样的，可以操控表达的时间。例如，通过合适地选择启动子，可以在植物生长早期增强表达，以使引发(prime)植物对除草剂处理的响应。
[0116]在具体的实施方式中，提高植物除草剂耐受性的方法包括，用包含本发明核苷酸序列的DNA构建体稳定转化植物，该核苷酸序列可操作地连接到能在植物中驱动表达的启动子上。
[0117]此外还提供了转化的植物、植物细胞、植物组织及其种子。
[0118]本发明的方法可以与本领域中可提供的其他方法一起使用以增强植物中的其他性状。可以认识到，这样的第二核苷酸序列可以以正向或反向使用，这取决于所期望的结
果O
[0119]突变体ACCase核苷酸序列(SEQ ID N0:4、5和/或6)的这种过表达将会是使用所述突变体核苷酸序列的优选方法。使用不同启动子来驱动这种过表达的各种优点和缺点对本领域技术人员而言都是已知的。然而，通过举例的方式，组成型启动子能够驱动表达，但是更理想的启动子是能靶向组织，例如叶子。
[0120]本发明的序列，在 下面将进行更详细的讨论，包括编码序列、反义序列及其片段和变体。本发明的序列的表达可以用于调节或调控相应的ACCase蛋白的表达。本发明包括分离的或基本上纯化的核酸或蛋白组合物。
[0121]所公开的核苷酸序列和由其编码的蛋白质的片段和变体同样包括在本发明中。“片段”是指核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分，以及因此由其编码的蛋白。核苷酸片段可以编码保留了天然蛋白生物学活性的蛋白质片段，因此具有ACC样活性，从而影响除草剂响应。另外，用作杂交探针的核苷酸序列片段通常并不编码保留生物学活性的蛋白片段。因此，核苷酸序列片段的范围是从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸到编码本发明蛋白质的全长核苷酸序列。
[0122]编码本发明ACCase蛋白生物学活性部分的ACCase核苷酸序列片段编码至少15、25、30、50、100、150、200，或250个连续氨基酸，或直到本发明全长蛋白质中存在的全部数
量的氨基酸。
[0123]可以使用本发明的核苷酸序列从其他生物体中特别是其他植物中，更特别是其他单子叶植物，分离相应的序列。用这种方式，可利用诸如聚合酶链式反应(PCR)、杂交等方法，基于这些序列与本文所示序列的同源性来鉴定这样的序列。基于这些序列与本文所示的完整ACCase序列或其片段的同源性而分离出来的序列也包括在本发明中。这样的序列包括所公开序列的直系同源序列。“直系同源”是指来自于一个共同祖先基因并由于物种形成而在不同物种中发现的基因。当它们的核苷酸序列和/或它们编码的蛋白质序列享有如本文中其他地方所定义的实质相同性时，在不同物种中发现的基因被认为是直系同源的。直系同源基因的功能在物种间往往是高度保守的。
[0124]在PCR方法中，可设计用于PCR反应的寡核苷酸引物以从提取自任何感兴趣的植物的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域中通常是已知的，并公开于，例如Sambrook.See also Innis et al., eds.(1990)PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press, New York);Innisand Gelfand, eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press, New York);和 Innis andGelfand, eds.(1999)PCR Methods Manual (Academic Press, New York)中。已知的 PCR 方法包括，但不限于，使用配对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
[0125]在杂交技术中，将已知核苷酸序列的全部或部分用作探针，选择性地与来自于所选择生物体的克隆基因组DNA片段或cDNA片段群体中(即基因组或cDNA文库)所存在的相应核苷酸序列杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其它寡核苷酸，并且可以用可检测基团例如32P或其它任何可检测标记进行标记。因此，例如，可以基于本发明的ACCase序列，通过标记合成寡核苷酸来制备用于杂交的探针。制备杂交探针和构建cDNA和基因组文库的方法，在本领域是公知的并公开在Sambrook中。
[0126]可通过本领域已知的和本文公开的任何方法来测定ACCase多肽的生物学活性(即影响ACCase除草剂响应)。
[0127]本发明的核苷酸序列可以在宿主细胞中表达，例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞，或优选植物细胞。预计本领域技术人员知晓很多可用于表达编码本发明蛋白质的核酸的表达系统。不会试图详细描述已知的用于在原核或真核细胞中表达蛋白的各种方法。
[0128]在用于在感兴趣·植物中表达的表达盒或DNA构建体中提供本发明的序列。表达盒包括可操作地连接至本发明ACCase序列的5’和3’调控序列。该表达盒还可以包括至少一个额外的待共转化进所述生物体中的基因。此外，额外的基因可以在多个表达盒中提供。
[0129]所提供的此类表达盒具有多个限制性位点使得插入的ACCase序列可处于调控区域的转录调控之下。表达盒还可以额外含有选择性标记基因。
[0130]表达盒可包括，以转录的5’_3’方向，转录起始区域(即，启动子)、翻译起始区域、本发明的多核苷酸、翻译终止区域，以及任选存在的，在宿主生物体内行使功能的转录终止区域。调控区域(启动子、转录调控区域以及翻译终止区域)和/或本发明的多核苷酸对于宿主细胞或相互之间可以是天然/类似的。此外，调控区域和/或本发明的多核苷酸对于宿主细胞或相互之间是异源的。
[0131]虽然优选使用异源启动子来表达所述序列，但可以使用天然启动子序列。此类构建体将改变宿主细胞(即，植物或植物细胞)内ACCase的表达水平。因此改变了宿主细胞(即植物或植物细胞)的表型。
[0132]终止区域可以是天然与转录起始区域一起的，可以是天然与可操作地连接的感兴趣的DNA序列一起的，或可以来自于另外的来源。农杆菌Ti质粒中可以提供合适的终止区域，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区域。也见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144;Proudfoot(1991)Ce1164:671-674;Sanfacon et al.(1991)GenesDev.5:141-149;Mogen et al.(1990)Plant Cell2:1261-1272;Munroe et al.(1990)Gene91:151-158;Balias et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903;and Joshi etal.(1987) Nucleic Acid Res.15:9627-9639 中。
[0133]在合适的情况下，对基因进行优化以提高其在转化植物中的表达。即，可使用植物偏好的密码子来合成基因以改良表达。本领域中可获得用于合成植物偏好基因的方法。见，例如U.S.Pat.Nos.5，380，831，and5, 436，391，and Murray et al.(1989) Nucleic AcidsRes.17:477-498，其通过引用并入本文。
[0134]已知可对序列进行额外的修饰以增强细胞宿主中基因的表达。这包括清除编码假多聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复以及其他可能对基因表达有害的熟知序列的序列。序列的G-C含量可以被调整至指定细胞宿主的平均水平，其参考宿主细胞中表达的已知基因计算。如果可能的话，对序列进行修饰以避免预测的发夹二级mRNA结构。
[0135]表达盒还可以在表达盒构建体中含有5 ’前导序列。这种前导序列可以用于增强翻译。翻译前导序列在本领域是已知的，包括:小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎病毒的 5’ 非编码区)(Elroy-Stein et al.(1989)PNAS USA86:6126-6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀刻病毒)(Allison et al.(1986)Virologyl54:9-20);以及人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP) (Macejak et al.(1991)Nature353:90-94)，来自于苜蓿花叶病毒衣壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA4)(Jobling et al.(1987) Nature325:622-625);烟草花叶病毒(TMV)前导序列(Gallie etal.(1989) in Molecular Biology of RNA, ed.Cech (Liss, New York), pp.237-256);以及玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)前导序列(Lommel et al.(1991) Virology81:382-385)。同样见于Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84:965-968 中。也可以利用其它已知的方法来增强转录。
[0136]在制备表达盒时，可以对各种DNA片段进行操作，以便提供处于正确方向以及视情况而定处于适当读码框中的DNA序列。为此,可以采用接头(adapter)或连接子(linker)连接DNA片段，或可以包括其它的操作以提供便于使用的限制性位点、除去多余的DNA、除去限制性位点等。为了这个目的，可以包括体外诱变、引物修复、限制性、退火、重取代例如转换和颠换。
[0137]—般来说，表达盒将包含用于选择转化细胞的可选择性标记基因。利用可选择性标记基因来选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如那些编码新霉素磷酸转移酶II (NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草剂化合物抗性的基因，所述除草剂化合物例如草铵磷(glufosinate)、草甘膦、铵类、溴苯腈、咪唑啉酮以及 2，4-二氯苯氧基乙酸(2, 4-D) ο 一般见于:Yarranton(1992)Curr.0pin.Biotech.3:506-511;Christopherson et al.(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:6314-6318;Yaoet al.(1992)Cell71:63-72;Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422;Barkleyet al.(1980)in The Operon, pp.177-220;Hu et al.(1987)Ce1148:555-566;Brownet al.(1987)Cell49:603-61 2;Figge et al.(1988) Cel152:713-722;Deuschle etal.(1989) Proc.Natl.Acad.Ac1.USA86: 5400-5404; Fuerst et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2549-2553;Deuschle et al.(1990)Science248:480-483;Gossen (1993)Ph.D.Thesis, University of Heidelberg;Reines et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:1917-1921;Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356;Zambretti etal.(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:3952-3956 ; Baim et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:5072-5076;Wyborski et al.(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653;Hillenand-ffissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10:143-162;Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591-1595;Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry27:1094-1104;Bonin(1993)Ph.D.Thesis, University of Heidelberg;Gossen etal.(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:5547-5551; 01 iva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36:913-919;Hlavka et al.(1985)Handbook of Experimental Pharmacology, Vol.78(Springer-Verlag, Berlin);Gill et al.(1988)Nature334:721_724;和WO
【发明者】M·奥斯特里, S·黑利, P·韦斯特拉, V·A·瓦尔德斯 申请人:科罗拉多小麦研究基金会公司