降低dna含量的内源性dna酶活性的制作方法
【专利摘要】本专利申请提供使用内源性丝状真菌宿主DNA酶活性来降低来自丝状真菌宿主细胞的蛋白质制剂或培养液的DNA含量的方法。
【专利说明】降低DNA含量的内源性DNA酶活性
[0001]相关专利申请的交叉引用
[0002]本专利申请要求2011年9月22日提交的美国临时申请N0.61/537，837的权益，该申请据此全文以引用方式并入。
【背景技术】
[0003]近年来，丝状真菌(如，木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、白乔史密斯霉属(Geosmithia)、毁丝霉属(Myceliophthora)、青霉属(Penicillium)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)等)日益成为受欢迎的蛋白质产生宿主菌株。由真菌菌种，例如里氏木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉(Aspergillus niger)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、埃默森白乔史密斯霉(Geosmithia emersonii)、嗜热毁丝霉(Mycellophthora thermophila)、绳状青霉(Pencillium funiclosum)、键抱霉(Fusarium venenatum)和特异腐质霉(Humicolainsolens)产生的酶制剂已开发为商业产品。丝状真菌，例如木霉属、曲霉属、毁丝霉属、青霉属、镰孢属等也工程化为通常在诱导型启动子的控制下表达异源蛋白，如酶和治疗性蛋白(参见例如England等人，PCT专利公布W02004/035070)。多种这样制备的真菌(如里氏木霉、黑曲霉、塔宾曲霉、米曲霉、埃默森白乔史密斯霉、嗜热毁丝霉、绳状青霉、镰孢霉和特异腐质霉)蛋白被用作食物或饲料添加剂(参见例如Dunn-Coleman等人,PCT专利公布W02003/038035)或用于其他工业应用。因为真菌中蛋白质的产生通常以大规模进行，所以产量和加工效率的提高可具有重大经济意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0004]图1:从表达来自布丘氏菌的植酸酶的里氏木霉的发酵液超滤浓缩物中，观察到的pH或温度的升高对DNA降解的影响。
[0005]图2:从表达来自布丘氏菌的植酸酶的里氏木霉的发酵液的与上述相同的超滤浓缩物中，观察到的温育时间对DNA降解的影响。
[0006]图3:从表达来自布丘氏菌的植酸酶的里氏木霉的发酵液的与上述相同的超滤浓缩物中，观察到的温度升高和温育时间对DNA降解的影响。
[0007]图4A至4B:从表达来自塔宾曲霉的脂肪酶的里氏木霉的发酵液超滤浓缩物中，在
5.2,6.3和7.6的pH水平下观察到的pH升高对DNA降解的影响。
【发明内容】
[0008]本发明提供降低已在其中培养丝状真菌宿主细胞的培养液的DNA含量的方法。此类方法包括将其中丝状真菌宿主细胞已培养至少24小时的培养液的pH和/或温度调整为高于培养所用的PH和/或温度；并且在提高的pH和/或温度下温育培养液足够时间段，以可检测地降低制剂中丝状真菌宿主DNA。在此类方法中，DNA的降低并非主要是由于在培养液中存在外源性DNA酶。一些方法还包括执行固液分离步骤，以在调整步骤之前，将培养液与丝状真菌宿主细胞分离。一些方法还包括执行超滤步骤，其中在调整步骤之前将培养液中的大分子浓缩。在一些方法中，培养液在超滤步骤之后处于室温下。在一些方法中，培养液的温度在调整步骤之前为25°C至34°C。在一些方法中，培养液的pH在调整步骤之前在4和5之间。一些方法还包括在培养液中培养丝状真菌宿主细胞，直到在调整步骤之前获得培养液中所关注的分泌蛋白的所需浓度。优选地，在施加宿主细胞产生的酶以处理或作用于预期基质之前，执行PH和/或温度调整步骤。
[0009]在一些方法中，在调整步骤期间，将pH提高到pH6-8。在一些方法中，在调整步骤期间，将温度提高到35°C-47°C。一些方法还包括评估培养液的DNA含量。在一些方法中，可在温育步骤之前和之后评估DNA含量。在一些方法中，DNA含量降至不可检测的水平，如通过PCR和/或采用溴化乙锭染色的凝胶电泳来评估。一些方法还包括在温育步骤之后允许培养液冷却至室温。一些方法还包括从培养液纯化一种或多种蛋白质。在一些方法中，培养液中的一种或多种蛋白质由丝状真菌宿主细胞重组表达。在一些方法中，丝状真菌宿主细胞缺少外源性DNA酶。在一些方法中，未将DNA酶添加到培养液。在一些方法中，丝状真菌宿主细胞重组表达纤维素酶。在一些方法中，丝状真菌宿主细胞重组表达植酸酶。在一些方法中，丝状真菌宿主细胞重组表达脂肪酶。
[0010]本发明还提供降低由丝状真菌宿主细胞制成的蛋白质制剂(包括，如培养液)的DNA含量的方法。这些方法包括测量来自丝状真菌宿主细胞的蛋白质制剂中的真菌宿主细胞DNA水平的步骤；将蛋白质制剂的pH和/或温度调整为调整后的pH和/或温度；在调整后的PH和/或温度下，温育蛋白质制剂足够时间段，以可检测地降低蛋白质制剂中丝状真菌宿主细胞DNA的水平；并且测定蛋白质制剂中丝状真菌宿主细胞DNA的量的降低。此类方法中的降低并非主要是由于蛋白质制剂中存在外源性DNA酶。在一些方法中，DNA的量已降至不可检测的水平。
[0011]本发明还提供降低已在其中培养丝状真菌宿主细胞的培养液的DNA含量的方法。这些方法包括提高培养液的PH和/或温度的步骤，其中丝状真菌宿主细胞已在所述培养液中培养至少24小时，并且已对其执行了固液分离步骤，已将培养液与丝状真菌宿主细胞分离；并且在提高的PH和/或温度下温育培养液足够时间段，以可检测地降低培养液中的丝状真菌宿主DNA。在此类方法中，降低并非主要是由于培养液中存在外源性DNA酶。
[0012]本发明还提供内源性丝状真菌宿主细胞DNA酶活性在降低由真菌宿主细胞制成的蛋白质制剂中丝状真菌宿主DNA中的用途。
[0013]本发明还提供内源性丝状真菌宿主细胞DNA酶活性在降低已在其中培养真菌宿主细胞的培养液中的真菌宿主DNA中的用途。
[0014]在任何上述方法或用途中，真菌宿主细胞可以是里氏木霉(T.reesei)、黑曲霉(A.niger)、塔宾曲霉(A.tubingensis)、米曲霉(A.0ryzae)、埃默森白乔史密斯霉(G.emersonii)、嗜热毁丝霉(M.thermophila)、绳状青霉(P.funiclosum)、镰孢霉(F.venenatum)或特异腐质霉(H.1nsolens)的细胞。
[0015]定义
[0016]“DNA酶 ”是能够降解DNA的酶，通常通过裂解磷酸二酯键来实现。DNA酶包括裂解内部位点的核酸内切酶以及从DNA分子的末端裂解单核苷酸的核酸外切酶。DNA酶通常是蛋白质，但也可以是非蛋白质DNA酶。DNA酶可以或可以不具有RNA酶活性以及DNA酶活性。
[0017]“外源性”蛋白(如外源性DNA酶)是指通过重组表达引入宿主菌株或从蛋白质的外部来源加入宿主菌株提取物的蛋白质。外源性蛋白可与宿主菌株异源(即，由不同的宿主菌株天然产生)或同源(即，由一种宿主菌株天然产生)。
[0018]术语“重组”是指非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或多肽。重组分子可包含两个或更多个天然存在的序列，它们以非天然存在的方式连接在一起。
[0019]术语“异源”是指通常非彼此相关的元件。例如，如果宿主细胞产生异源蛋白，则该蛋白通常不通过该宿主细胞产生。同样，可操作地连接至异源编码序列的启动子为可操作地连接至编码序列，使得通常在野生型宿主细胞中不会可操作地连接的启动子。结合多核苷酸(如，DNA)或蛋白质的术语“同源”是指天然存在于宿主细胞中的核酸(如，DNA)或蛋白质。
[0020]“基因”是指参与产生多肽的DNA片段，包括编码片段之前和之后的区域(外显子)，以及在一些基因中单个编码片段之间的插入片段(内含子)。
[0021]核酸包括DNA、RNA、单链或双链及其化学改性型式。 [0022]“载体”是设计用来将核酸引入一种或多种细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等。
[0023]“植酸酶”是一种酶，其催化肌醇六磷酸盐的水解，使之成为(I)肌醇和/或(2)其单、二、三、四和/或五磷酸盐以及(3)无机磷酸盐。例如，植酸酶包括EC编号3.1.3.8或EC编号3.1.3.26定义的酶。
[0024]“纤维素酶”包括直接作用于纤维素的酶以及有利于其他酶对纤维素直接作用的辅助酶。纤维素酶包括细菌或真菌外切葡聚糖酶或外切纤维二糖水解酶，和/或内切葡聚糖酶，和/或葡萄糖苷酶。这三种不同类型的纤维素酶协同作用，将纤维素及其衍生物转化成葡萄糖。纤维素酶还包括辅助酶，包括GH61成员，例如EG4、扩张蛋白、松弛蛋白、CIPl等等。
[0025]“脂肪酶”是催化脂质的水解或形成的酶。例如，脂肪酶催化三酰基甘油的水解，产生二酰基甘油和羧酸。脂肪酶包括EC编号3.1.1.3定义的酶。
[0026]“分离的”是指将对象物质从至少一个与其天然相关联的组分中移出。
[0027]“纯化的”是指对象物质至少50% (重量/重量)，有时至少75、90、95或99% (重量/重量)不含用于其制备或纯化的大分子污染物，但不排除存在赋形剂，所述赋形剂的添加有利于对象物质的使用。
[0028]蛋白质制剂包括一种或多种任何纯度状态的丝状真菌宿主(如，里氏木霉、黑曲霉、塔宾曲霉、米曲霉、埃默森白乔史密斯霉、嗜热毁丝霉、绳状青霉、镰孢霉、特异腐质霉等等)分泌的所需蛋白质，并且还可包括来自所需蛋白质或添加赋形剂的制备或纯化的污染物。因此，蛋白质制剂可以是培养液或由培养液纯化的蛋白质。
[0029]培养液或“发酵液”是指培养基，用于培养丝状真菌宿主细胞(如，里氏木霉、黑曲霉、塔宾曲霉、米曲霉、埃默森白乔史密斯霉、嗜热毁丝霉、绳状青霉、镰孢霉和特异腐质霉)，在发酵之后需要或不需要移除细胞和细胞碎片，并且需要或不需要通过超滤或类似的技术浓缩培养液中的蛋白质和其他大分子，但不包括纯化蛋白质的制备，其中已从培养液中分离出所需的蛋白质，手段是通过例如蛋白质沉淀并且重悬于新鲜培养基中，或柱层析并且用新鲜培养基洗脱等技术。
[0030]术语“丝状真菌”是指真菌亚门的所有丝状形式(参见AleXOpOUlOS，C.J.(1962)，INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley, New York(Alexopoulos, C.J.，1962 年，《真菌学概论》，威利出版社，纽约)和AINSWORTH AND BISBY DICTIONARY OF THE FUNGI,9.sup.th Ed.(2001)Kirk et al.,Eds.,CAB International University Press,Cambridge UK(《AINSWORTH 与BISBY真菌词典》，第9版增补，2001年，Kirk等人编辑，CAB国际大学出版社，英国剑桥))。这些真菌的特征是其营养菌丝体的细胞壁由几丁质、纤维素和其他复合多糖组成。本发明的丝状真菌在形态学上、生理学上和遗传学上与酵母不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长来进行，并且碳分解代谢是专性好氧的。
[0031]术语“木霉属”是指过去或现在分类为“Trichoderma”的任何真菌属以及此类菌株的杂交体，及其经基因修饰的形式(如，通过突变或转基因或基因敲除修饰)。
[0032]“饲料”是指用于或适于被非人类动物摄入、吸收、消化的任何天然或人工饮食、膳食等或此类膳食的组分。
[0033]“食物”是指用于或适于被人类摄入、吸收、消化的任何天然或人工饮食、膳食等或此类膳食的组分。
[0034]“食物或饲料添加剂”是用于或适于添加到食物或饲料的纯化的化合物或多组分组合物。其可以包括一种或多种化合物，例如维生素、矿物质、酶和合适的载体和/或赋形剂。
[0035]术语例如“评估”、“测量”或“测定”涵盖被分析物特别是内源性DNA的定性或定量检测。因此，此类评估或测定可表示被分析物的存在或不存在或被分析物的量。
[0036]术语“包含”及其同源词以其包括在内的含义使用；也就是说，与术语“包括”及其相应的同源词等同。
[0037]除非语境中另外指明，否则提及的具体数值涵盖其测量中固有的指定值和此类变量(即，+/-SEM)。
[0038]除非语境中另外指明，否则“约”表示+/-10%的公差。
[0039]数值范围包括限定该范围的数值。还列出了一些优选的子范围，但在任何情况下，提及的范围包括范围中包括的整数定义的所有子范围。
【具体实施方式】
[0040]1.概沭
[0041]本发明提供降低来自丝状真菌的蛋白质制剂的DNA含量的方法，该方法无需使用外源性DNA酶。本专利申请在部分上基于对培养液中内源性丝状真菌DNA酶活性连同具有商业价值的蛋白质的观察。例如，DNA酶活性可见于以下各种霉的培养液中:里氏木霉、黑曲霉、塔宾曲霉、米曲霉、埃默森白乔史密斯霉、嗜热毁丝霉、绳状青霉、镰孢霉、特异腐质霉，或表达和/或产生某些所关注的工业酶的另一种菌株。虽然对于机制的理解对于本发明的实施不是必需的，但据信内源性DNA酶活性可以是丝状真菌(如，里氏木霉、黑曲霉、塔宾曲霉、米曲霉、埃默森白乔史密斯霉、嗜热毁丝霉、绳状青霉、镰孢霉、特异腐质霉等等)内源性的一种或多种分泌DNA酶或由于细胞裂解而释放的此类丝状真菌的一种或多种细胞内DNA酶的结果。[0042]此类内源性DNA酶活性可用于降低或消除来自丝状真菌培养液，例如里氏木霉、黑曲霉、塔宾曲霉、米曲霉、埃默森白乔史密斯霉、嗜热毁丝霉、绳状青霉、镰孢霉或特异腐质霉培养液中的DNA分子。此类DNA分子的移除对于许多应用是有用的，例如，用于提供作为食物或饲料添加剂或补充剂的酶制剂。一些商业酶制剂，特别是用于食物或饲料制备的那些需要达到监管部门的要求，不含可检测的宿主DNA或至少具有低于限定限值的宿主DNA。虽然培养液中的真菌DNA(如，来自里氏木霉、黑曲霉、塔宾曲霉、米曲霉、埃默森白乔史密斯霉、嗜热毁丝霉、绳状青霉、镰孢霉、特异腐质霉等的DNA)可用外源性DNA酶来移除，但重组表达此类DNA酶或将其供应给培养液涉及附加步骤、增加的成本以及可能降低的效率。本发明的方法提供移除蛋白质制剂中的宿主遗传物质的简单步骤，无需从遗传学上操纵宿主细胞或向制剂中添加DNA酶。
[0043]I1.丝状直菌宿丰菌株
[0044]能够表达异源性或内源性种类蛋白质的任何合适真菌宿主菌株可用于实施本发明。例如，真菌宿主菌株可以是丝状真菌菌种宿主菌株，例如子囊菌门和盘菌亚门的那些菌株。此类生物体包括用于生产具有商业价值的工业和药用蛋白质的丝状真菌细胞，包括但不限于:木霉属、曲霉属、镰孢属、青霉属、金孢子菌属、篮状菌属、白乔史密斯霉属、毁丝霉属和脉孢菌属。可衍生合适宿主菌株的特定生物体可包括但不限于:里氏木霉(过去分类为长梗木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)和红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、黑曲霉、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、解乌头酸曲霉(Aspergillus itaconicus)、米曲霉、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、塔宾曲霉、特异腐质霉、灰腐质霉(Humicola grisea)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces Ianuginosus)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、埃默森篮状菌(白乔史密斯霉)、镰孢霉、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、嗜热毁丝霉和勒克瑙金孢子菌(Chrysosporium Iucknow ense)。真菌宿主菌株也可为丝状真菌菌种宿主菌株,例如来自担子菌门或毛霉亚门的那些。此类生物体包括用于生产具有商业价值的工业和药用蛋白质的丝状真菌细胞，包括但不限于:伞菌属(Agaricus spp.)、平革菌属(Phanerochaetespp.)、裂裙菌属(Schizophyllum spp.)、根毛霉属(Rhizomucor spp.)和毛霉属(Mucorspp.)。可衍生合适宿主菌株的特定生物体可包括但不限于:双孢蘑菇(Agaricusbisporus)、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、裂裙菌(Schizophyllumcommune)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)和卷枝毛霉(Mucor circinelloides)。
[0045]可以预期，一定水平的内源性DNA酶活性存在于衍生自上述列出的生物体和其他丝状真菌菌种的发酵产物(如，蛋白质制剂，包括例如培养液)中。DNA酶活性的水平和DNA酶的最适PH或温度可在菌种之间或之中不同。但根据本发明，可测试如本文所述对pH、温度和温育时间作出的调整，以确定DNA移除的要求。
[0046]在本发明方法中任何一者的具体实施例中，宿主细胞为熟知的丝状真菌里氏木霉的细胞。里氏木霉菌株的例子包括 ATCC N0.13631、ATCC N0.26921、ATCC N0.56764、ATCCN0.56765,ATCC N0.56767和NRRL N0.15709。宿主细胞的一个例子衍生自RL-P37里氏木霉菌株(在 Sheir-Neiss et al.(1984) Appl.Microbiol.Biotechnology20:46-53 (Sheir-Neiss等人，1984年，《应用微生物学和生物技术》，第20卷，第46-53页)中有所描述)。另一个宿主细胞为四重缺失的RL-P37里氏木霉菌株的自发pyr4回复突变体Morphl.1 (pyr+)里氏木霉菌株(在PCT专利公布W005/001036中有所描述)。类似于RL-P37的其他宿主菌株包括里氏木霉(长梗木霉)菌株RUT-C30(ATCC N0.56765)和菌株QM9414 (ATCC N0.26921)。
[0047]在某些实施例中，宿主菌株可通过基因工程、经典诱变，或通过形成现有菌株的杂交体进行遗传学操纵。基因工程可用于引入外源性基因或敲除或敲低内源性基因。诱变可用于抑制或敲除内源性基因，或在一些宿主细胞中，改变或增强内源性基因的功能。例子包括如Bower等人在PCT专利公布W02008/153903中描述的过表达突变体。例子还包括其中真菌宿主细胞的各种天然基因已失活的宿主菌株。可通过完全或部分缺失、通过插入失活或者通过任何其他能使基因对其预定目的而言无功能的手段(使得防止该基因表达功能蛋白)，来实现基因失活。基因失活方法的例子可见于如美国专利N0.5，246，853和5，475，101，以及PCT专利公布W092/06209。在一些宿主中，可将一个或多个编码纤维素酶，例如内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)(如，cbhl、cbh2、egll或egl2)的基因去活。例如，美国专利N0.5，650，322公开了 cbhl基因和cbh2基因同时缺失的RL-P37衍生菌株。在具体例子中，cbhl、cbh2、egll和egl2的“四重”缺失在美国专利N0.5，847，276和PCT专利公布W005/001036中有所描述。在又一个例子中，可操纵某些宿主细胞，使它们成为蛋白酶缺陷株或蛋白酶欠缺株，使得此类菌株表达的所关注蛋白质降解的风险减少或减弱。
[0048]如所指出的那样，本发明的方法不需要为宿主细胞培养补充外源性DNA酶，例如EP658621或PCT专利公布W02008065200描述的步骤。然而，其中一个或多个外源性DNA酶重组表达的宿主细胞虽然不是必需的，但可使用，前提条件是方法中利用的DNA酶活性主要不是外源性DNA酶的活性。在一些此类宿主细胞中，外源性DNA酶在活性形式中不表达(如，其在包涵体中表达)，或仅少量表达。在一些此类宿主细胞中，外源性DNA酶不分泌到胞外(如，缺少信号肽)。如果任何外源性DNA酶存在于培养液或其他蛋白质制剂中，则此类外源性DNA酶对宿主DNA降解的贡献不超过总DNA酶活性的49% (如，不超过49%、不超过45%、不超过40%、不超过35%、不超过30%、不超过25%、不超过20%、不超过15%、不超过10%或不超过5%)。这可通过如下展示,在测定温度和pH条件下(如，pH7.0,40°C的温度下)，内源性DNA降低至不可检测水平所需的时间增加不超过49% (如，不超过49%、不超过45%、不超过40%、不超过35%、不超过30%、不超过25%、不超过20%、不超过15%、不超过10%或不超过5% )，并且优选地与存在外源性DNA酶的情况相比，不存在的情况下增加小于25 %或10 %。换句话讲，在培养液或其他蛋白质制剂中，内源性DNA酶活性主要负责宿主细胞(如，里氏木霉、黑曲霉、塔宾曲霉、米曲霉、埃默森白乔史密斯霉、嗜热毁丝霉、绳状青霉、镰孢霉、特异腐质霉等)的DNA降解。
[0049]宿主菌株可用于表达，以及优选地分泌一种或多种内源性或外源性酶或内源性和外源性酶的共混物。可内源性或外源性表达的酶类型的一些例子包括淀粉分解酶、蛋白分解酶、纤维素酶、氧化还原酶和植物细胞壁降解酶。更具体地讲，此类酶包括淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角质酶、纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、果胶酶、葡萄糖苷酶、异构酶、转移酶、半乳糖苷酶和几丁质酶。
[0050]作为另外一种选择或除此之外，宿主菌株可工程化为表达并且优选地分泌激素、酶、生长因子、细胞因子、抗体等。可表达的激素的一些例子包括促卵泡激素、促黄体生成激素、促肾上腺皮质激素释放因子、生长激素释放抑制因子、促性腺激素、加压素、催产素、促红细胞生成素、胰岛素等。
[0051]生长因子是结合到细胞表面上的受体的蛋白质，主要结果是激活细胞增殖和/或分化。要表达的生长因子的一些例子包括血小板衍生生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子等。
[0052]细胞因子是独特的生长因子家族。主要从白细胞分泌的细胞因子刺激体液免疫应答和细胞免疫应答二者，以及吞噬细胞的活化。要表达的细胞因子的一些例子包括集落刺激因子、白介素(IL-1 α和β、IL-2至IL-13)和干扰素(α、β和gamma )。
[0053]宿主细胞也可工程化以表达抗体。人、人源化、嵌合或贴面化抗体是优选的。抗体可来自任何类别和同 种型，即Gl、2、3和4，以及A、M、E或D。
[0054]在某些实施例中，将编码外源性蛋白的核酸片段克隆到表达载体。编码外源性蛋白的核酸片段可与赋予分泌的信号肽可操作连接设置，或可与用于适当表达的启动子以及有时其他调控序列可操作连接设置。可使用如Sambrook et al.(1989)MolecularCloning:A Laboratory Manual，2nd Edition， Cold Spring Harbor LaboratoryPress(Sambrook等人，1989年，《分子克隆:实验室手册》，第二版，Cold Spring HarborLaboratory出版社)描述的标准技术将编码多肽的表达载体转染或转化到宿主细胞。也可通过以下方式将核酸转移到细胞:逆转录病毒载体(参见例如Ferry et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA,88:8377-8381 (Ferry 等人，1991 年，《美国国家科学院院刊》，第 88卷，第 8377-8381 页)JPKay et al.(1992) Human Gene Therapy3:641-647 (Kay 等人，1992年，《人类基因治疗》，第3卷，第641-647页))、腺病毒载体(参见例如Rosenfeld(1992)Cell68:143-155 (Rosenfeld, 1992 年，《细胞》，第 68 卷，第 143-155 页)；和 Herz andGerard (1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA, 90:2812-2816 (Herz 和 Gerard, 1993 年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第2812-2816页))、受体介导的DNA摄入(参见例如Wu，andWu (1988) J.Biol.Chem.263:14621 (Wu 和 Wu, 1988 年，《生物化学杂志》，第 263 卷，第 14621页)；ffilson et al.(1992) J.Biol.Chem.267:963-967 (Wilson 等人，1992 年，《生物化学杂志》，第267卷，第963-967页);和美国专利N0.5，166，320)、DNA的直接注射(参见例如 Acsadi et al.(1991) Nature332:815-818 (Acsadi 等人，1991 年，《自然》，第 332 卷，第815-818 页)JPWolff et al.(1990) Science247:1465-1468 (Wolff 等人，1990 年，《科学》，第247卷，第1465-1468页))或粒子轰击(生物弹道技术)(参见例如Cheng et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA, 90:4455-4459 (Cheng 等人，1993 年，《美国国家科学院院刊》，第 90 卷，第 4455-4459 页)；Zelenin et al.(1993) FEBS Letts.315:29-32 (Zelenin 等人，1993年，《欧洲生物化学学会联盟通讯》，第315卷，第29-32页))。
[0055]附加型和整合型表达载体二者均可使用。为了识别来自整合型载体的整合体，将包含选择性标记(如，药物抗性)的基因随所关注的核酸引入宿主细胞。选择性标记的例子包括赋予某些药物抗性，例如G418和潮霉素抗性的那些标记。可在与所关注的核酸分开的载体上或在同一载体上引入选择性标记。然后可通过选择使用选择性标记的细胞来识别转染的宿主细胞。例如，如果选择性标记编码赋予新霉素抗性的基因，则摄入核酸的宿主细胞可通过其在存在G418的情况下的生长来识别。掺入选择性标记基因的细胞将存活，而其他细胞则死亡。
[0056]一旦经过表达，即可根据常规步骤来纯化多肽，包括亲和纯化、硫酸铵沉淀、离子交换色谱，或凝胶电泳(通常参见R.Scopes (1982) Protein Purification,Springer-Verlag, N.Y.(R.Scopes, 1982 年，《蛋白质纯化》，Springer-Verlag 出版社，纽约)；Deutscher(1990)Methods in Enzymology Vol.182:Guide to ProteinPurification,Academic Press, Inc.N.Y.(Deutscher, 1990 年，《酶学方法》,第 182 卷,“蛋白质纯化指导”，学术出版社公司，纽约))。或者，多肽可经受尽可能小或无表达后操纵，使其用于基本上类似于表达它的宿主细胞的培养液的组合物。
[0057]II1.培养丝状真菌宿主细胞
[0058]所需的蛋白质例如纤维素酶、饲用酶或其他酶可在丝状真菌宿主(如，里氏木霉、黑曲霉、塔宾曲霉、米曲霉、埃默森白乔史密斯霉、嗜热毁丝霉、绳状青霉、镰孢霉、特异腐质霉等)的细胞中通过固体或深层培养，包括分批、分批补料和连续流动工艺来制备。分批补料由于其易于控制、制备产物的量一致、以及所有设备的使用最经济而广泛使用。
[0059]培养(有时称为发酵)可在液体(如，水性)培养基或固体培养基中进行，本发明的方法适用于其中任一种。在某些典型的实施例中，在包括水性矿物盐培养基、有机生长因子、碳或能源物质、可同化的氮、分子氧，以及待利用的真菌宿主菌种的起始种菌的培养液中进行培养。矿物质培养基适当包括可溶解可同化的离子和组合形式的某些量的磷、镁、钙、钾、硫和/或钠，以及优选地合适的可溶解可同化形式的某些痕量元素例如铜、锰、钥、锌、铁、硼和/或碘等。矿物质营养物质可有助于适当的微生物生长，通过微生物转化工艺中的细胞使碳和能源 的同化最大化，并且实现细胞产量的最大化。
[0060]可同化的氮源可以是任何一种或多种能够释放适于被微生物代谢利用的形式的氮的含氮化合物。虽然可利用多种有机氮源化合物，例如蛋白质水解产物，但通常可利用廉价的含氮化合物，例如氨气、氢氧化铵、尿素或各种铵盐如磷酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、氯化铵或各种其他铵化合物。氨气本身易于大规模操作，并且可通过水性发酵物(发酵培养基)适量发泡。氨气也可有助于pH控制。
[0061]培养是有氧过程，通常涉及由含分子氧的气体例如空气、富氧空气或甚至基本上纯分子氧提供的分子氧，所述分子氧的提供用于保持发酵罐内容物的合适氧分压，以有效帮助微生物物种以较快的方式生长。实际上，通过使用含氧烃基质，减少了微生物生长的需氧量。然而，因为基质的同化和微生物的相应生长部分地是燃烧过程，所以要为生长提供分子氧。
[0062]虽然通气速率可在相当大的范围内变化,但是通气通常在发酵罐中以每分钟每液体体积约0.5至10,优选地约0.5至7体积(在所用的压力和25°C下)含氧气体的范围内的速率进行。该量为基于提供给反应器的正常氧含量的空气，而就纯氧而言，相应的范围为发酵罐中每分钟每液体体积约0.1至1.7，或优选地约0.1至1.3体积(在所用的压力和25°C下)氧气。
[0063]发酵的压力也可广泛变化。压力通常在约O至50psig,优选地约O至30psig的范围内，更优选地在至少稍微超过大气压的水平下，从而可实现设备和运行成本与氧溶解度的平衡。大于大气压对于增加溶解氧浓度是有利的，继而可有助于增加细胞生长速率。然而，较高的压力增加了设备和运行成本。[0064]发酵温度可一定程度地变化。例如，对于里氏木霉，温度通常在约20°C至约40°C的范围内，通常优选地在约25°C至约34°C的范围内。里氏木霉的优选发酵温度在约27°C至约30°C的范围内。
[0065]水性微生物发酵物(发酵混合物)中的pH范围可以例如在约2.0至约8.0的范围内。对于丝状真菌，pH通常在约2.5至约8.0的范围内；例如，对于里氏木霉，pH通常在约3.0至约7.0的范围内。里氏木霉的优选pH范围在约3.5至约5.0的范围内。
[0066]虽然发酵罐中发酵混合物的平均保留时间可显著变化，但部分地取决于发酵温度和所用的培养物，其通常在约24至约500小时，优选地24至400小时的范围内。在某些实施例中，真菌宿主细胞已培养至少24小时，例如至少48小时，至少72小时，或至少96小时。例如，里氏木霉优选地已培养至少24小时，例如至少48小时，至少72小时，或至少96小时。发酵优选地继续进行，直到细胞密度和/或一种或多种所关注的分泌蛋白的浓度接近预定所需水平。是否达到该所需水平可通过从发酵罐的周期性取样确定。细胞密度和/或一种或多种所关注的分泌蛋白的浓度的特定所需水平可不同，并且可通过考虑多个因素来设定。在某些实施例中，特定所需水平可设定在宿主细胞产量开始下降的点处。在某些其他实施例中，特定所需水平可设定在发酵罐太满以致于不能允许有效发酵继续的点处。在又一个实施例中，特定所需水平可灵活地设定在为开始另一轮发酵而需要发酵罐的点处。细胞密度的特定所需水平可通过上述因素的任何一个、两个或所有来设定。[0067]在DNA酶降解的一些方法中，相对于发酵期间的pH和温度来评估发酵后pH和/或温度的任何升高。如果PH或温度在发酵期间显著变化(即，超过2°C或0.5个pH单位)，发酵期内PH或温度的平均值用作比较的基线。或者，特别是如果pH或温度无显著变化，则可使用单一测量，例如，在发酵期的开始或结束时测量。
[0068]优选地，发酵以将含碳基质控制为限制因素的方式进行，从而提供含碳基质向细胞的良好转化，并且避免大量未转化的基质来污染细胞。不过，如果未转化的基质是水溶性的，因为此类基质的任何残迹都易于洗掉，所以此类基质没有问题。但是，添加产物处理步骤，例如适当洗涤步骤，对于非水溶性基质则可能是必需的。
[0069]部分或所有碳和能源物质，和/或部分可同化的氮源例如氨气，可在此类培养基送入发酵罐之前添加到水性矿物培养基中。
[0070]引入反应器的每个流优选地控制在预定速率，或者响应可通过监测例如来自发酵罐的废气中碳和能源基质、pH、溶解氧、氧气或二氧化碳的浓度确定的需要，响应可通过透光率测量的细胞密度等。各种物质的进料速率可变化，以获得尽可能快的细胞生长速率，与碳和能源的有效利用一致，以获得相对于基质进料量尽可能高的微生物细胞产量。
[0071 ] 在分批操作中或在优选的分批补料操作中，所有设备、反应器或发酵装置、罐或容器、管道、伴随的循环或冷却装置等被初始消毒，其可通过以下方式实现:例如利用蒸汽，在约121°C下延长一段时间，如至少15分钟。然后，消毒的反应器在存在所有所需营养物质，包括氧和含碳基质的情况下接种所选微生物的培养物。
[0072]发酵液通常包含细胞碎片，包括细胞、各种悬浮固体和其他生物质污染物，所述生物质污染物包括真菌宿主DNA，以及所需蛋白质或所关注的蛋白质。优选地，每个所需蛋白质总表达量的至少约40 %，如至少约50 %、至少约75 %或至少约90 %在发酵结束时被分泌到培养液中。[0073]IV.真菌蛋白质制剂DNA含暈的降低
[0074]一旦发酵产生了所需的细胞密度或蛋白质浓度，则可对培养中使用的培养液或其衍生的蛋白质制剂进行处理，以降低其DNA含量。据信，典型真菌宿主生物体或宿主细胞(如，里氏木霉、黑曲霉、塔宾曲霉、米曲霉、埃默森白乔史密斯霉、嗜热毁丝霉、绳状青霉、镰孢霉或特异腐质霉)可产生一种或多种DNA酶，这种酶可在分泌后或由于细胞裂解而存在于细胞培养液中，从而得到DNA降解活性。这样制备的真菌蛋白质制剂的DNA含量可通过此类内源性DNA酶活性专门地或至少主要地予以降低，而蛋白质制剂中外源性DNA酶的含量为无或极少。
[0075]可在发酵完成后从培养液中移除DNA，无需进一步加工培养液。或者，可执行至少一个固液分离步骤，以在移除DNA之前从培养液移除细胞和细胞碎片(即，至少降低其含量)。在一些方法中，在细胞和固体移除后，浓缩培养液中的蛋白质，有时在DNA移除之前进一步纯化。然而，在温育之前进行的移除DNA的任何纯化步骤优选地不应将所需的蛋白质与DNA酶活性分离，无论如何不移除超过10 % (如，不超过20 %、不超过30 %、不超过40 %或不超过50% )的DNA酶活性。相似地，在温育之前进行的移除DNA的任何步骤优选地不应使DNA酶活性失活，无论如何不使DNA酶活性失活超过10% (如，不超过20%、不超过30%、不超过40%或不超过50% )。
[0076]细胞和细胞碎片可通过常规固液分离技术，例如离心、过滤、渗析、微量过滤、旋转式真空过滤或其他已知工艺进行移除，以生成无细胞滤液。可使用例如超滤、蒸发或沉淀的技术对发酵液或无细胞滤液进行进一步浓缩。上清液或滤液的蛋白质组分可使用盐，如硫酸铵沉淀，然后通过多种常规纯化步骤，例如离子交换层析、亲合层析或类似的常规步骤进行纯化。
[0077]为降低真菌蛋白质制剂(如，里氏木霉、黑曲霉、塔宾曲霉、米曲霉、埃默森白乔史密斯霉、嗜热毁丝霉、绳状青霉、镰孢霉或特异腐质霉蛋白质制剂)的DNA含量，则要调整蛋白质制剂的PH和/或温度，通常是提高，以提高制剂中的真菌DNA酶活性。调整步骤之前的PH与发酵期间相比通常无变化。调整步骤之前的温度通常在培养温度至室温的范围内，取决于(如果有的话)温度调整之前培养液冷却了多久。然后将蛋白质制剂在调整PH和/或温度下温育足够时间段，以可检测地降低DNA含量，优选地使DNA含量降至不可检测的水平。在一些方法中，调整PH或温度是将pH和/或温度升至高于发酵中所用pH和/或温度(通常PH4.0-5.0，温度27-30°C )。pH和温度值升高的组合是有效的，但不总是必需。例如，DNA的完全降解可通过单独提高pH来实现，而蛋白质制剂的温度保持在低水平(如，10°C或4°C )，或保持不变或在室温下(如，在4°C-27°C的范围内的温度)。DNA也可在单独高温下降解，而蛋白质制剂的PH保持低水平(如，pH4-5)或保持在发酵时所用的pH水平。真菌蛋白质制剂中内源性DNA酶活性可使用以下文献中公开的测定法进行检测，例如Sinicropi, D., et al., (1994) Anal.Biochem.222:351-358 (Sinicropi, D.等人，1994 年，《分析生物化学》，第 222 卷，第 351-358 页)或 Tolun，G.and Myers, R.S.(2003)NucleicAcids Research31: el 11 (Tolun, G.和 Myers, R.S.，2003 年，《核酸研究》，第 31 卷，第 el 11页)。此类测定法可用于确定内源性DNA酶活性的最佳pH和/或温度。
[0078]用于DNA移除的升高的pH可在5.0至9.0的范围内，并且优选地在6.0至8.0的范围内。用于DNA移除的pH范围的一些例子包括5.0至6.0,5.2至7.8,5.5至7.5,6.0至 7.0、6.5 至 7.5、7.0 至 8.0，以及 8.0 至 9.0。
[0079]用于DNA移除的升高的温度可在30°C至70°C的范围内，并且优选地在35 V至47°C的范围内。用于DNA移除的温度范围的一些例子包括30°C至40°C、40°C至50°C、50°C至60°C和60°C至70°C。对于在丝状真菌宿主(如，里氏木霉、黑曲霉、塔宾曲霉、米曲霉、埃默森白乔史密斯霉、嗜热毁丝霉、绳状青霉、镰孢霉或特异腐质霉)中重组表达的嗜热或热稳定蛋白，可使用更高的温度。特定真菌宿主的DNA酶的热稳定性也决定了要使用此类更高的温度。例如，此类更高的温度可以不高于约66°C，例如不高于约60°C、58°C、55°C或52。。。
[0080]蛋白质制剂可在升高的pH与各种温度范围的组合下温育。例如，pH可升至5.2至
7.8,5.5至7.5,5.5至6.5,6.5至7.5或7.5至8.5的范围，温度保持在(TC至5°C、5°C至15°C、15°C至25°C、25°C至35°C、35°C至45°C或45°C至55°C的范围内。同样，蛋白质制剂可在更高的温度与各种PH范围的组合下温育。例如，温度可升至25 °C至35 °C、35 °C至45 °C或45°C至 55°C 的范围，pH 保持在 3.5 至 4.5,4.5 至 5.5,5.5 至 6.5,6.5 至 7.5 或 7.5 至 8.5的范围内。
[0081]如果通过DNA酶来移除DNA是在蛋白质的超滤浓缩物上进行，则在超滤后浓缩物通常处于室温。在这种情况下，温度可升至高于室温和/或PH升至高于真菌宿主发酵所用的pH。
[0082]在调整步骤期间，DNA移除的温育时间可显著变化，部分取决于所需DNA含量的降低程度，以及所需蛋白质对用于DNA移除的温度和pH的敏感度。将DNA移除至不可检测的水平是优选的。所需蛋白质活性损失很小或无损失也是优选的。优选地，最佳温育条件使蛋白质稳定性或活性无损失或无显著损失，如，所需蛋白活性损失小于11215110115%或20%。任选地，蛋白质稳定性或活性可在温育之前和/或之后评估。用于DNA移除的温育的时间段还依赖于DNA移除期间的pH和/或温度，较长时间对于pH移至小于7、温度移至小于40°C是必需的。时间段通常为至少10、20、30、60、120、180、240分钟，最多4、6、
12、24或48小时，包括下限和上限的所有排列。温育时间也可长于48小时。优选的温育时间为2-8小时。优选地，pH和/或温度调整步骤在宿主细胞产生的酶用于处理或作用于预期基质之前进行。
[0083]蛋白质制剂(如，培养液)的DNA含量也可在调整步骤的温育之前和之后评估。真菌宿主DNA的任何片段可用作制剂的总DNA含量的标记。优选地，使用基因组片段。任选地，可检测不止一个片段。
[0084]PCR扩增是分析核酸(如，DNA)含量的合适和优选的方法。引物可设计为在任何合适基因组DNA片段的侧面(例如，里氏木霉的整个基因组序列可得自美国能源部联合基因组研究所(U.S.Department of Energy, Joint Genome Institute)网站，曲霉属的整个基因组序列可得自托管于马里兰大学医学院(University of Maryland Schoolof Medicine)和斯坦福大学医 学院遗传学系(Department of Genetics at the Schoolof Medicine, Stanford University)的曲霉属基因组数据库，以及布洛德研究所(BroadInstitute)的真菌基因组创始网站)。PCR检测可以是定性的或定量的。进行扩增以及随后通过凝胶的溴化乙锭染色检测扩增产物(如果有的话)可指示基础标记的存在或不存在，但不提供此类标记含量的准确测量。DNA的存在也可通过凝胶电泳和溴化乙锭染色检测，无需PCR扩增。DNA是通过特征性斑迹或梯状条带示出的。
[0085]在定量扩增中，扩增产物的量与原始样品中模板的量成比例，并且检测实时进行。与适当对照物的比较提供了待扩增DNA片段的拷贝数量度。定量PCR的详细规程在Inniset al.(1990)PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications，Academic Press，Inc.N.Y.(Innis等人，1990年，《PCR方案:方法和应用指导》，学术出版社公司，纽约)中提供。
[0086]用于检测的其他合适扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)(参见Wu andWallace (1989) Genomics4:560 (Wu 和 Wallace, 1989 年，《基因组学》，第 4 卷，第 560 页)、Landegren et al.(1988) Science241:1077 (Landegren 等人，1988 年，《科学》，第 241 卷，第1077 页)和 Barringer et al.(1990) Gene89:117 (Barringer 等人，1990 年，《基因》，第 89卷，第 117 页))、转录扩增(Kwoh et al.(1989) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:1173 (Kwoh 等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第1173页))、自动维持序列扩增(Guatelliet al.(1990) Proc.Nat.Acad.Sc1.USA87:1874 (Guatelli 等人，1990 年，《美国国家科学院院刊》，第87卷，第1874页))、点PCR和连接子接头PCR。
[0087]也可通过例如基于杂交的测定法来评估蛋白质制剂(如，培养液)中DNA的存在或水平。诸如南方墨点法等方法在以下文献中有所描述:例如Sambrook et al.，(1989)Molecular Cloning:A L aboratory Manual(2d Ed., volsl-3,Cold Spring Harbor Press,New York) (Sambrook等人，1989年，《分子克隆:实验室手册》，第二版，第1-3卷,ColdSpring Harbor Press,纽约)。商业化DNA测定试剂盒也可商购获得,例如加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(InVitrogen Corporation (Carlsbad, CA))供应的 Quant_iT?DNA 测定试剂盒。
[0088]使用本发明的方法来处理培养液或其他蛋白质制剂，将产生可检测的DNA降低，优选地，DNA含量降至不可检测的水平。如果基因组DNA的任何片段的PCR扩增存在于单倍体基因组的单一拷贝中，然后通过溴化乙锭染色未得到可见条带，则视为不可检测水平(使用与本发明实例相同的PCR条件)。在典型监管要求的例子中，“最终产物中无可检测DNA”可使用基于PCR的测定来确定，检测限值为例如I至5ng总丝状真菌DNA/mL酶制剂。在另一个例子中，取决于制剂和/或最终产物的使用，可利用20pg/mL或2ng/mL或10ng/mL的总丝状真菌DNA检测限值。在某些其他例子中，即使约500飞克总丝状真菌DNA/g冻干产物(如，小于约450fg DNA/g冻干产物、小于约400fg/g、小于约350fg/g、小于约300fg/g、小于约250fg/g或甚至小于约200fg/g)的下限也可使用本发明的方法实现,例如通过在升高的温度和/或升高的PH下延长温育时间。此外，还设想了使用本发明的方法并结合从培养液或其他蛋白质制剂中移除DNA的常规方法。例如，本文所述的方法可用于降低培养液中的DNA水平，然后添加少量外源性DNA酶，以便从此类培养液进一步移除残余DNA，前提条件是此类外源性DNA酶对降解的贡献不超过总DNA酶活性的49% (如，不超过49%、不超过45%、不超过40%、不超过35%、不超过30%、不超过25%、不超过20%、不超过15%、不超过10%或不超过5% )。
[0089]在从蛋白质制剂(包括，如培养液)移除DNA之后，如果在DNA移除期间温度升高，则可允许降至较低的温度，如室温，或冷却至4°C的低温或适于制剂储存的其他温度。通常不必将制剂的pH重新调整至不同的值。然而，如果下游制剂或其他步骤需要特定的pH，则可将制剂的PH调整至所需值。
[0090]因为可以预期其他重组丝状宿主细胞的发酵产物或培养液包含某种水平的内源性DNA酶活性，正如在里氏木霉培养液中一样，所以本文所述的方法可结合用于相同设备，以从此类培养液或其他蛋白质制剂中移除DNA。可以预期的是，DNA酶活性水平和内源性DNA酶的最佳pH或温度可根据物种变化，并且技术人员可确定pH调整和/或温度调整，以及使用本文提供的教导而无需进一步实验即可移除DNA分子所需的温育期。
[0091]V.配制
[0092]在蛋白质制剂(包括，如培养液)的真菌宿主DNA降解后，该制剂可以包装出售，或基本上按原样使用，即使需要进一步处理，也极微，或者该蛋白质制剂可进一步纯化，或者加工和/或配制，以用于下游应用。蛋白质或蛋白质制剂可配制为例如液体、浆液、粉末、喷剂、悬浮液、冻干组合物/制剂、固体、颗粒、明胶片(geltab)、丸剂、植入物、凝胶；或药物制剂、食物、饲料、食物补充剂、饲料补充剂、食物添加剂、饲料添加剂、营养补充剂或其饮食补充剂。
[0093]V1.蛋白质的用途
[0094]本发明方法生成的蛋白质或蛋白质制剂(如，培养液)具有农业、工业、医药和营养用途。例如，纤维素酶可用于从谷物生成葡萄糖，或作为动物饲料的补充剂，通过增加饲料的消化率而减少粪便 的产生。纤维素酶也可用于通过将木质纤维素生物质转化为可发酵糖，而提高醇发酵(如，在啤酒酿造中)的效率。植酸酶制剂可用于谷物湿磨、动物饲料和清洁产品。植酸酶、肌醇六磷酸和低磷酸盐肌醇六磷酸衍生物也有多个其他用途，用于个人护理产品、医药产品和食品和营养产品，以及各种工业应用，特别是清洁、纺织物、平版印刷和化学领域。脂肪酶可用于各种食物/饲料、烘培、清洁和/或生物燃料应用。蛋白质例如激素、生长因子、细胞因子和抗体可用于疾病的治疗和预防。
[0095]SM
[0096]实例 I
[0097]A 部分:
[0098]在生物反应器中培养表达来自布丘氏菌的植酸酶的重组里氏木霉菌株。根据美国专利公布US2009/0098249中描述的方案制备生成植酸酶的表达盒。然后将表达盒插入来源于里氏木霉菌株RL-P37的“四重缺失”型式(其中四个主要分泌纤维素酶CBHI (cel7a)、CBHII (cel6a)、EGI (cel7b)、EGII (cel5a)已被去除)的宿主菌株(Sheir-Neissand Montenecourt,1984, Appl.Microbiol.Biotechno1.20:46-53(Sheir-Neiss 和Montenecourt, 1984年,《应用微生物学和生物技术》,第20卷,第46-53页))。如专利公布US20040121446 (其相关公开内容据此以引用方式并入)中所述操作生物反应器。
[0099]在生物反应器中生长后，通过过滤以移除里氏木霉细胞，获得培养上清液。通过超滤浓缩上清液大约四倍。加入苯甲酸钠和山梨酸钾，二者均达到0.3%的最终浓度，将pH调整到5.5，从而得到用于以下实验的超滤浓缩物(UFC)。
[0100]通过聚合酶链式反应(PCR)获得1，526bp的DNA片段(峰值DNA)，并且使用加利福尼亚州瓦伦西亚凯杰公司(Qiagen(Valencia,CA))的PCR纯化试剂盒根据厂商的说明进行纯化。将该峰值DNA加入UFC样品，最终浓度为I μ g/mL。用于PCR的寡核苷酸引物可用于生成相同的DNA片段，将该DNA片段用作生物反应器中生长的里氏木霉菌株的基因组DNA模板，或包含相同模板DNA序列的纯化质粒DNA。峰值DNA的DNA序列不重要。里氏木霉基因组DNA的任何区域可用作常规步骤设计的模板和引物。
[0101]测试UFC样品中宿主DNA的步骤:使用威斯康辛州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega(Madison, WI))的 Wizard SV 凝胶及 PCR 纯化系统(Wizard SV Gel and PCRClean-Up System)根据厂商的说明从50 μ L UFC样品(如果需要，将峰值DNA制剂添加到其中)中纯化DNA。简言之，将50 μ L UFC样品与450 μ L Promega膜结合溶液混合，并且将该混合物加载到Wizard SV微型柱。在用膜洗涤溶液洗涤微型柱之后，结合到微型柱膜的任何DNA最终洗脱于无核酸酶的水中。通过如下方法进行洗脱样品中DNA的检测:使用用于生成峰值DNA的相同弓丨物进行PCR，然后通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色使DNA片段显影。在PCR产物中，通常观察到两条DNA带，推测是由于引物的一些非特异性结合。
[0102]B 部分:
[0103]通过PCR分析来选择包含可检测DNA的UFC样品，无需加入峰值DNA(图1，第I道)。将峰值DNA加入该UFC中，至最终浓度为I μ g/mL,发现所获得的PCR产物的量有增加(图1，第2道)。将UFC(无峰值DNA)调整到ρΗ3.0、ρΗ4.5或ρΗ7.0,并且在10°C下温育I小时。在pH3.0和pH4.5下温育后，通过PCR分析仍然可检测到DNA，但在pH7.0下温育后，则检测不到。将UFC(无峰值DNA)调整到pH4.5或pH7.0,并且在40°C下温育24小时，然后通过PCR分析检测不到DNA。
[0104]C 部分:
[0105]将峰值DNA以I μ g/mL的最终浓度在pH5.5下添加到UFC样品中。将样品在40°C下温育0、4、8、12、24或48小时。在不温育时，可通过PCR分析检测到峰值DNA (图2，第I道)。然而，温育4小时后，峰值DNA不再可检测(图2，第2道)。在最多24小时的温育期间，观察到植酸酶活性无损失。具有峰值DNA的相同UFC样品在4°C或室温下温育7天，其后通过PCR分析检测不到DNA (图2，第7和8道)。
[0106]P 部分:
[0107]将峰值DNA以1.45 μ g/mL的最终浓度在pH5.5下添加到UFC样品。样品在10°C或22°C或37°C下温育O、4、8、12或24小时，然后通过PCR分析检测峰值DNA。
[0108]在10°C下温育8小时后，可通过PCR检测到DNA (图3，第4道)，甚至在10°C下温育24小时后，也可观察到痕量PCR产物(图3，第5道)。在22°C下温育8小时后，可通过PCR检测到DNA(图3，第9道)，但在22°C下温育24小时后，观察不到PCR产物(图3，第10道)。在37°C下温育2或4小时后，观察到痕量PCR产物(图3，第12和13道)，但在37°C下温育8小时后，检测不到DNA(图3，第14道)。由溶于水的峰值DNA构成的对照实验在37°C下温育24小时后，清晰显示出可检测DNA，确定DNA的损失是由于UFC中的组分(图3，第16道)。
[0109]实例2
[0110]在生物反应器中培养表达来自塔宾曲霉的脂肪酶的重组里氏木霉菌株。根据PCT专利公布W02010/122531中描述的方案制备生成脂肪酶的表达盒。然后将表达盒插入来源于里氏木霉菌株RL-P37的“四重缺失”型式(其中四个主要分泌纤维素酶CBHI(cel7a)、CBHII(cel6a)、EGI(cel7b)、EGII(cel5a)已缺失)的宿主菌株(Sheir-Neissand Montenecourt,1984, Appl.Microbiol.Biotechno1.20:46-53(Sheir-Neiss 和Montenecourt, 1984年,《应用微生物学和生物技术》,第20卷,第46-53页))。如专利公布US20040121446 (其相关公开内容据此以引用方式并入)中所述来操作生物反应器。
[0111]在生物反应器中生长后，通过过滤以移除里氏木霉细胞，获得培养上清液。通过超滤浓缩上清液大约四倍，生成超滤浓缩物(UFC)，以用于进一步实验。
[0112]使用威斯康辛州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega(Madison,WI))的Wizard SV凝胶及PCR纯化系统(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System)根据供应商的说明从UFC样品提取DNA。简言之，将100 μ L UFC样品与450 μ L Promega膜结合溶液混合，并且将该混合物加载到Wizard SV微型柱。在用膜洗涤溶液洗涤微型柱之后，结合到微型柱膜的任何DNA最终洗脱于无核酸酶的水中。通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色进行洗脱样品中DNA的检测。通常在UFC样品中观察到低分子量DNA片段的斑迹(大约300bp以及更小)，据推测其来源于片段化里氏木霉基因组DNA。
[0113]测试UFC的各种处理，并且观察其对从UFC回收的DNA丰度的影响。UFC的起始pH约为4.0 (对照UFC)。将UFC样品调整到ρΗ5.2,6.3或7.6。对照UFC和调整的UFC在pH调整后立即冷冻，或在4°C或室温下温育24小时，然后冷冻直到进一步分析。然后通过琼脂糖凝胶电泳来分析所有样品。结果显示在图4A和4B中。温育对照UFC或调整到pH5.2的UFC对DNA的存在无显著影响。温育调整到pH6.3的UFC使DNA稍微降低。温育调整到PH7.6的UFC使DNA显著降低，使得在室温下24小时后，通过琼脂糖凝胶电泳检测不到DNA斑迹。
[0114]本文提及的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的所有序列，出于所有目的明确地全 文以引用方式并入。虽然描述的是优选的方法和材料，但任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料均可用于实施或测试本发明。除非语境中另外指明，否则任何实施例、方面、步骤、特征、元素或限制均可与任何其他结合使用。
【权利要求】
1.一种降低已在其中培养丝状真菌宿主细胞的培养液的DNA含量的方法，所述方法包括如下步骤: 调整其中已培养所述真菌宿主细胞至少24小时的培养液的pH和/或温度，以提高培养所用的PH和/或温度；并且 在所述提高的PH和/或温度下温育所述培养液足够时间段，以可检测地降低所述制剂中的真菌宿主DNA; 前提条件是DNA的降低并非主要是由于在所述培养液中存在外源性DNA酶。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括执行固液分离步骤，以在所述调整步骤之前将所述培养液与丝状真菌宿主细胞分离。
3.根据权利要求1或2所述的方法，还包括超滤步骤，其中在所述调整步骤之前通过执行超滤而将所述培养液中的大分子浓缩。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述培养液在所述超滤步骤之后处于室温下。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在所述调整步骤之前所述培养液的温度为25°C至34°C。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在所述调整步骤之前所述培养液的pH在4和5之间。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括在所述培养液中培养所述丝状真菌宿主细胞，直到在所述调整步骤之前获得所述培养液中所关注的分泌蛋白的所需浓度。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在所述调整步骤期间将所述pH提高到PH6-8。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在所述调整步骤期间将所述温度提高到 35 ℃-47℃ 所述培养液的DNA含量。
10.权利要求书10缺失
11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在所述温育步骤之前或之后评估所述DNA含量。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中将所述DNA含量降至不可检测的水平，所述水平通过PCR和/或采用溴化乙锭染色的凝胶电泳来评估。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，还包括在所述温育步骤之后允许所述培养液冷却至室温。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，还包括从所述培养液中纯化一种或多种蛋白质。
15.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述培养液中的一种或多种蛋白质由所述丝状真菌宿主细胞来重组表达。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞缺少外源性DNA酶。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中未将DNA酶添加到所述培养液。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞重组表达纤维素酶。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞重组表达植酸酶。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞重组表达脂肪酶。
21.一种降低来自丝状真菌宿主细胞的蛋白质制剂的DNA含量的方法，所述方法包括如下步骤: 评估来自所述真菌宿主细胞的蛋白质制剂中丝状真菌宿主细胞DNA的水平； PH和/或温度； 在所述调整后的PH和/或温度下温育所述蛋白质制剂足够时间段，以可检测地降低所述蛋白质制剂中丝状真菌宿主细胞DNA的水平；并且 测定所述蛋白质制剂中丝状真菌宿主细胞DNA的量的降低； 前提条件是所述降低并非主要是由于所述蛋白质制剂中存在外源性DNA酶。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述DNA的量已降至不可检测的水平。
23.一种降低已在其中培养丝状真菌宿主细胞的培养液的DNA含量的方法，所述方法包括如下步骤: 提高培养液的PH和/或温度，其中所述丝状真菌宿主细胞已在所述培养液中培养至少24小时，并且已对其执行了固液分离步骤，已将所述培养液与丝状真菌宿主细胞分离；并且 在所述提高的PH和/或温度下温育所述培养液足够时间段，以可检测地降低所述培养液中丝状真菌宿主DNA ； 前提条件是所述降低并非主要是由于所述培养液中存在外源性DNA酶。
24.内源性丝状真菌宿主细胞DNA酶活性在降低来自所述丝状真菌宿主细胞的蛋白质制剂中的丝状真菌宿主DNA中的用途。
25.内源性丝状真菌宿主细胞DNA酶活性在降低其中已培养所述丝状真菌宿主细胞的培养液中的丝状真菌宿主DNA中的用途。
26.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞是里氏木霉(T.reesei)、黑曲霉(A.niger)、塔宾曲霉(A.tubingensis)、米曲霉(A.0ryzae)、埃默森白乔史密斯霉(G.emersonii)、嗜热毁丝霉(M.thermophila)、绳状青霉(P.funiclosum)、镰孢霉(F.venenatum)或特异腐质霉(H.1nsolens)的细胞。
27.权利要求24或25的用途，其中所述丝状真菌宿主细胞是里氏木霉、黑曲霉、塔宾曲霉、米曲霉、埃默森白乔史密斯霉、嗜热毁丝霉、绳状青霉、镰孢霉或特异腐质霉的细胞。
【文档编号】C12P21/02GK103946369SQ201280045775
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年9月20日 优先权日:2011年9月22日
【发明者】K·霍夫曼, D·考, M·华德 申请人:丹尼斯科美国公司