用于植入的中脑多巴胺(da)神经元的制作方法
【专利摘要】本发明涉及干细胞生物学领域，具体地，涉及多能或多潜能干细胞的谱系特异性分化，上述多能或多潜能干细胞可以包括，但不限于，除了非胚胎人诱导的多能干细胞(hiPSC)以外还有的人胚胎干细胞(hESC)、成体干细胞、来自患有疾病的患者的干细胞或者任何能够进行谱系特异性分化的其它干细胞。具体描述了以下方法：引导hESC和/或hiPSC谱系特异性分化成底板中脑祖细胞，然后使用新的培养条件进一步分化成大量的中脑结局FOXA2+LMX1A+TH+多巴胺(DA)神经元。使用本发明的方法产生的中脑结局FOXA2+LMX1A+TH+多巴胺(DA)神经元进一步预期用于多种用途，其包括，但不限于，在体外药物发现检测中的用途、神经学研究、以及作为患者多巴胺神经元的疾病逆转或损伤或缺乏的治疗剂。而且，提供了从人多能干细胞分化中脑结局FOXA2+LMX1A+TH+多巴胺(DA)神经元用于疾病建模特别是帕金森氏病的组合物和方法。此外，真正的DA神经元富含标记物，例如CD142和A9型神经元细胞。
【专利说明】用于植入的中脑多己胺（DA)神经元
[0001] 政府许巧权利
[0002] 本发明部分地在来自美国国立卫生研究所OJnitedStates化tionalInstitute ofHealth,NIH)和国立神经病学和中风研究所（^tionalInstituteofNeurological disordersandStroke,NIND巧的NIH/NINDS资助金NS052671 和NIH/NINDS资助金 P50NS047085政府资助下作出。因此，美国政府对于本发明具有某些权利。 发明领域
[0003] 本发明涉及干细胞生物学领域，具体地，涉及多能或多潜能干细胞的谱系特异 性分化，上述多能或多潜能干细胞可W包括，但不限于，除了非胚胎人诱导的多能干细胞 化iPSC)W外还有的人胚胎干细胞化ESC)、成体干细胞、来自患有疾病的患者的干细胞 或者任何能够进行谱系特异性分化的其它干细胞。具体描述了W下方法：引导hESC和/ 或hiPSC谱系特异性分化成底板中脑祖细胞，然后使用新的培养条件进一步分化成大量 的中脑结局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神经元。使用本发明的方法产生的中脑结局 FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神经元进一步预期用于多种用途，其包括，但不限于，在体外 药物发现检测中的用途、神经学研究、W及作为患者多己胺神经元的疾病逆转或损伤或缺 乏的治疗剂。而且，提供了从人多能干细胞分化中脑结局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神 经元用于疾病建模特别是帕金森氏病的组合物和方法。此外，真正的DA神经元富含标记 物，例如CD142和A9型神经元细胞。
【背景技术】
[0004] 保留分化成许多种特化细胞类型的能力的细胞群体可用于形成大量的谱系特异 性分化细胞群体。该些保留进一步分化成特化细胞的能力的细胞群体含有多能细胞。多能 细胞可W来源自胚胎和/或非胚胎成体干细胞。
[0005] 该些谱系特异性分化的细胞群体预期应用于具有导致特定细胞群体功能丧失的 疾病的患者的细胞置换疗法中。除其直接治疗价值W外，谱系特异性分化细胞还是许多种 用途的有价值的研究工具，其包括筛选检测，W鉴定、确认和测试功能特异性，或用于测试 治疗分子的输送，W治疗细胞谱系特异性疾病。
[0006] 之前使用胚胎干细胞和成体干细胞作为神经退行性疾病的治疗剂和模型系统。有 关胚胎干细胞和成体干细胞定向分化的研究和技术发展已经在中枢神经系统（CN巧疾病 领域中进行，例如，用于亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和多发性硬化。但 是，该些研究的结果表明，该些细胞用于体内使患者恢复神经功能的能力几乎没有，而且常 常导致患者中不期望的肿瘤生长。
[0007] 因此，对于获得能够既用于研究且用作治疗导致具有特定功能的细胞丧失的疾病 的治疗剂的细胞群体的组合物和方法存在有需求。
【发明内容】
[0008] 本发明涉及干细胞生物学领域，具体地，涉及多能或多潜能干细胞的谱系特异 性分化，上述多能或多潜能干细胞可W包括，但不限于，除了非胚胎人诱导的多能干细胞 化iPSC)W外还有的人胚胎干细胞化ESC)、成体干细胞、来自患有疾病的患者的干细胞或 者任何能够进行谱系特异性分化的其它干细胞。
[0009] 具体描述了W下方法：引导hESC和/或hiPSC谱系特异性分化成底板中脑祖细 胞，然后使用新的培养条件进一步分化成中脑结局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神经元的 大群体。使用本发明的方法产生的中脑结局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神经元进一步 预期用于多种用途，其包括，但不限于，在体外药物发现检测中的用途、神经学研究、W及作 为患者多己胺神经元的疾病逆转或损伤或缺乏的治疗剂。而且，提供了从人多能干细胞分 化中脑结局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神经元用于疾病建模特别是帕金森氏病的组合 物和方法。此外，真正的DA神经元富含标记物，例如CD142和A9型神经元细胞。
[0010] 一种试剂盒，其包括第一信号传导抑制剂、第二信号传导抑制剂和第H信号传 导抑制剂，其中所述第一抑制剂能够降低转化生长因子目（TGF目VActivin-Nodal(活 化素-结节蛋白）信号传导，所述第二抑制剂能够降低SMAD(SmallMothersAgainst Decapentaplegic)信号传导，并且所述第H抑制剂能够降低用于活化wingless(Wnt)信号 传导的糖原合成酶激酶3目佑SK3目）。在一实施方式中，所述第一抑制剂是LDN-193189。 在其他实施方式中，所述第一抑制剂选自LDN-193189、其衍生物及其混合物。在一实施方 式中，所述第二抑制剂是SB431542。在其他实施方式中，所述第二抑制剂选自SB431542、其 衍生物及其混合物。在一实施方式中，所述第H抑制剂是CHIR99021。在其他实施方式中， 所述第H抑制剂选自CHIR99021、其衍生物及其混合物。在一实施方式中，所述试剂盒进一 步包括音酒因子（Sonichedgehog,SHH)信号传导的激活剂和成纤维细胞生长因子（FGF)S 受体家族信号传导的激活剂。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括脑源性神经营养因 子伽NF)、抗坏血酸（AA)、胶质细胞系源性神经营养因子、二下醜CAMP和目3型转化生长 因子。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括选自抗酪氨酸轻化酶（TH)、抗叉头框蛋白 A2(anti-forldieadboxproteinA2,F0XA2)和抗LIM同源盒转录因子Ia(LMXlA)的抗 体。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括选自干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞 和工程细胞的细胞。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括用于分化祖细胞和中脑结局 F0XA2/LMX1A+多己胺（DA)神经元的说明书。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括从患 有帕金森氏病（PD)的患者获取细胞的说明书。
[0011] 一种组合物，其包括与第一信号传导抑制剂和第二信号传导抑制剂接触的细胞 群体，其中大于40%的所述细胞群体对于叉头框蛋白A2(F0XA2)是阳性的，其中所述细 胞群体预先与第一信号传导抑制剂、第H信号传导抑制剂和音酒因子（SHH)信号传导激 活剂接触，其中所述第一抑制剂能够降低转化生长因子目（TGFe)Activin-Nodal信 号传导，所述第二抑制剂能够降低用于活化wingless(Wnt)信号传导的糖原合成酶激 酶3目（GSK3目）信号传导，并且所述第H抑制剂能够降低SMAD(SmallMothersAgainst Decapentaplegic)信号传导。在一实施方式中，所述第一抑制剂是选自LDN-193189、其衍 生物及其混合物的小分子。在一实施方式中，所述第二抑制剂选自CHIR99021及其衍生物。 在一实施方式中，所述第H抑制剂选自SB431542、其衍生物及其混合物。在一实施方式中， 所述音酒因子（SHH)信号传导激活剂选自音酒因子（SHH)C25II和平滑（SMO)受体小分子 激动剂，其中所述激动剂是purmo巧hamine。在一些实施方式中，所述细胞群体进一步预先 与成纤维细胞生长因子8(FGF8)接触。在一实施方式中，包括所述细胞群体的所述大多数 细胞是叉头框蛋白A2 (F0XA2)+LIM+同源盒转录因子1+，a(LMXlA)，+NG肥+和DDC+底板中 脑祖细胞。在一实施方式中，所述细胞群体选自晒齿类动物细胞、灵长类动物细胞和人细 胞。在一实施方式中，所述细胞源自帕金森氏病（PD)患者细胞。在一实施方式中，所述细 胞群体对于叉头框蛋白A2(F0XA2)是至少50%阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对 于叉头框蛋白A2是至少60%阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白A2 是至少70%阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白A2是至少80%阳性 的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白A2是至少90%阳性的。在一实施方式 中，所述细胞群体对于叉头框蛋白A2是至少95%至多100%阳性的。
[0012] 一种组合物，其包括体外细胞群体，其中包括所述细胞群体的大多数细胞是酪氨 酸轻化酶（TH) +叉头框蛋白A2(F0XA。+LIM同源盒转录因子1+，a(LMXlA) +底板中脑多己胺 (DA)神经元。在一实施方式中，所述大于40%的所述底板中脑多己胺（DA)神经元是酪氨酸 轻化酶阳性的Cffl+)。在一实施方式中，所述细胞群体是至少50%酪氨酸轻化酶阳性的。在 一实施方式中，所述细胞群体是至少60 %酪氨酸轻化酶阳性的。在一实施方式中，所述细胞 群体是至少70 %酪氨酸轻化酶阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体是至少80 %酪氨酸 轻化酶阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体是至少90%酪氨酸轻化酶阳性的。在一实 施方式中，所述细胞群体是至少95%至多100%酪氨酸轻化酶阳性的。在一些实施方式中， 所述细胞群体包括大多数中脑结局F0XA2/LMX1A+多己胺（DA)神经元。在一实施方式中， 所述底板中脑多己胺（DA)神经元对于选自W下的标记物是阳性的；核受体NURRl(NR4A2)、 神经元特异性III类目-微管蛋白（Tujl)、TTF3、配对样同源域3 (P]；TX3)、achaete-s州te 复合物（AS化)、早期B细胞因子UEBF-1)、早期B细胞因子3 (邸F-3)和转甲状腺素蛋白 (TTR)D在一实施方式中，所述中脑结局F0XA2/LMX1A+多己胺（DA)神经元群体对于选自 DA、3, 4-二轻基-苯己酸值OPAC)和高香草酸化VA)的分子是阳性的。在一实施方式中，所 述标记物选自蛋白质和核酸。在一些实施方式中，所述中脑结局F0XA2/LMX1A+多己胺（DA) 神经元群体能够在选自帕金森病（PD)患者的患者中体内植入。在一实施方式中，所述中脑 结局F0XA2/LMX1A+多己胺（DA)神经元能够体内植入，并提供多己胺（DA)神经元功能。
[0013] 在一些实施方式中，本发明提供一种组合物，其包括与LDN-193189和CHIR99021 接触的细胞群体，其中大于40%的所述细胞群体对于叉头框蛋白A2(F0XA2)是阳性的， 并且其中所述细胞群体预先与LDN-193189、SB431542、音酒因子（SHH)信号传导激活剂 和CHIR99021接触。在一实施方式中，所述音酒因子（SHH)信号传导激活剂选自音酒因子 (SHH)C25II和purmo巧hamine。在一实施方式中，所述大于10%的所述细胞群体对于叉头 框蛋白A2(F0XA2)和LIM同源盒转录因子1，a(LMXlA)是双阳性的。在一实施方式中，所 述大多数的所述细胞群体是底板中脑祖细胞群体。在一实施方式中，所述细胞群体预先与 成纤维细胞生长因子8(FGF8)接触。在一实施方式中，所述细胞群体选自晒齿类动物细胞、 灵长类动物细胞和人细胞。在一实施方式中，所述人细胞是来自具有帕金森氏病（PD)神经 系统症状的患者的细胞。在一实施方式中，所述细胞群体源自诱导的多能干细胞（iPSC)。 在一实施方式中，大于10 %的所述细胞群体选自对于叉头框蛋白A2 (F0XA2)/LIM同源盒转 录因子1，a(LMXlA)是双阳性的，W及对于叉头框蛋白A2(F0XA2)/cxrthodenticle同源盒 2(0TX2)是双阳性的。
[0014] 在一实施方式中，本发明提供一种诱导细胞定向分化成底板中脑祖细胞群体的方 法，其包括，a)提供；i)细胞群体，其中所述细胞群体选自非胚胎干细胞、胚胎干细胞、诱 导的非胚胎多能细胞和工程多能细胞；和ii)第一信号传导抑制剂、第二信号传导抑制剂、 音酒因子（SHH)信号传导激活剂和第H信号传导抑制剂，其中所述第一抑制剂能够降低转 化生长因子目（TGF目VActivin-Nodal信号传导，所述第二抑制剂能够降低SMAD(Small MothersAgainstDecapentaplegic)信号传导，并且所述第H抑制剂能够降低用于活化 Wingless(Wnt)信号传导的糖原合成酶激酶3目（GSK3目）信号传导；b)使所述细胞群体与 所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触，C)在使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第 二抑制剂接触之后，在使底板中脑祖细胞群体分化的条件下，进一步使所述细胞与所述音 酒因子（SHH)信号传导激活剂接触；和d)在使所述细胞群体与所述音酒因子（SHH)信号传 导激活剂接触之后，进一步使所述细胞与所述第H抑制剂接触，W使所述细胞群体分化成 底板中脑祖细胞群体。在一实施方式中，与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触 在能够产生分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行。在一实施方式中，与所述第一抑制 剂和所述第二抑制剂的所述接触在将细胞体外铺布的1小时内发生。在一实施方式中，与 所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触在将细胞体外铺布的48小时内发生。在一 实施方式中，与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触在将细胞体外铺布的62小 时内发生。在一实施方式中，所述细胞与所述音酒因子（SHH)信号传导激活剂的所述接触 在能够产生分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行。在一实施方式中，在使所述细胞群 体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，所述细胞与所述音酒因子（SHH)信号传 导激活剂的所述接触为至少24小时且至多36小时。在一实施方式中，所述细胞与所述音 酒因子（SHH)信号传导激活剂的所述接触为至多144小时。在一实施方式中，所述细胞与 所述第H抑制剂的所述接触在能够产生分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行。在一实 施方式中，在使所述细胞群体与所述音酒因子（SHH)信号传导激活剂接触之后，所述细胞 与所述第H抑制剂的所述接触为至少24小时，至多36小时。在一实施方式中，所述细胞与 所述第H抑制剂的所述接触为至多192小时。在一实施方式中，在使所述细胞与所述第一 抑制剂和所述第二抑制剂接触之后至少第11天，所述细胞群体分化成所述底板中脑祖细 胞。在一实施方式中，所述第一抑制剂是SB431542。在一实施方式中，所述第二抑制剂是 LDN-193189。在一实施方式中，所述第H抑制剂是CHIR99021。在一实施方式中，所述音酒 因子（SHH)信号传导激活剂选自音酒因子（SHH)C25II和purmo巧hamine。在一实施方式 中，所述方法进一步提供成纤维细胞生长因子8 (FGF8)，并在能够产生分化的底板中脑祖细 胞群体的条件下使细胞群体与所述FGW接触。在一实施方式中，在使所述细胞群体与所述 第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，所述细胞与所述FGW的所述接触为至少24小时， 至多36小时。在一实施方式中，所述细胞与所述FGF8的所述接触为至多144小时。在一 实施方式中，所述底板中脑祖细胞群体包括大于40 %的叉头框蛋白A2 (F0XA2) +细胞。在一 实施方式中，所述底板中脑祖细胞群体包括大于40%的叉头框蛋白A2 (F0XA2)+LIM同源盒 转录因子1，a(LMXlA)+细胞。在一实施方式中，所述方法进一步包括步骤e)使所述底板 中脑祖细胞群体与神经元成熟培养基接触，所述培养基包括N2培养基、脑源性神经营养因 子炬DNF)、抗坏血酸（AA)、胶质细胞系源性神经营养因子、二了醜cAMP(dbcAMP)和目3型 转化生长因子，用于使底板中脑祖细胞分化成底板中脑多己胺（DA)神经元。在一实施方式 中，所述方法进一步包括步骤e)使所述底板中脑祖细胞群体与具有B27补充物的神经元成 熟培养基接触，用于使底板中脑祖细胞分化成底板中脑多己胺（DA)神经元。在一实施方式 中，使与具有B27补充物的神经基础（neurobasal)培养基接触的所述细胞与脑源性神经营 养因子伽NF)、抗坏血酸（AA)、胶质细胞系源性神经营养因子、二了醜cAMP(dbcAMP)和目3 型转化生长因子接触，用于使底板中脑祖细胞分化成底板中脑多己胺（DA)神经元。在一实 施方式中，所述底板中脑多己胺（DA)神经元为叉头框蛋白A2(F0XA2)+LIM同源盒转录因子 1，a(LMXlA)+、核受体相关1蛋白（NURRl)+W及酪氨酸轻化酶（TH)+。在一实施方式中，大 于40%的所述底板中脑多己胺（DA)神经元为酪氨酸轻化酶（TH)+。在一实施方式中，在使 所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后至少第25天，分化出所述底 板中脑多己胺（DA)神经元群体。在一实施方式中，所述底板中脑多己胺（DA)神经元对于 鉴定一种分子的标记物是阳性的。在一实施方式中，所述标记物选自酪氨酸轻化酶（TH)、 叉头框蛋白42(。0《42)^加同源盒转录因子1、多己胺、3,4-二轻基-苯己酸值0口4〇和高 香草酸（HVA)，a，核受体NURRl(NR4A2)、神经元特异性III类目-微管蛋白（Tujl)、TTF3、 配对样同源域3 (PITX3)、achaete-scute复合物（ASCL)、早期B细胞因子1巧BF-1)、早期B 细胞因子3巧BF-3)、转甲状腺素蛋白（TTR)、突触蛋白、多己胺转运蛋白（DAT)和G蛋白偶 联的内向整流钟通道化ir3.2/GI服2)。在一实施方式中，所述分子选自蛋白质和核酸。在 一实施方式中，所述分子使用选自抗体、PCR引物、核酸序列的标记物和酶检测来鉴定。在 一实施方式中，所述底板中脑多己胺（DA)神经元能够体内植入到具有帕金森氏病（PD)的 患者中，用于提供多己胺（DA)神经元功能。在一实施方式中，所述方法进一步包括，提供对 产生多己胺的神经元有需求的患者，其中所述患者表现出至少一种神经系统症状，W及将 底板中脑多己胺（DA)神经元移植到所述患者中用于提供多己胺（DA)神经元功能的步骤。 在一实施方式中，所述神经系统症状选自震颤、运动徐缓（活动极为缓慢）、屈曲位、姿势不 稳和僵直。在一实施方式中，所述患者表现出至少一种所述神经系统症状的减少。在一实 施方式中，所述细胞选自晒齿类动物细胞、灵长类动物细胞和人细胞。在一实施方式中，所 述人细胞是来自具有帕金森氏病（PD)神经系统症状的患者的细胞。
[0015] 在一实施方式中，本发明提供一种用于治疗性处理的体内植入方法，其包括，a) 提供；i)底板中脑多己胺（DA)神经元群体，其中大于40%的所述群体表达酪氨酸轻化 酶（TH);和ii)受试者，其中所述受试者表现出至少一种神经系统症状；和b)在允许体 内植入的条件下将所述底板中脑多己胺（DA)神经元移植到所述受试者中，用于提供多己 胺（DA)神经元功能。在一实施方式中，所述神经系统症状选自震颤、运动徐缓（活动极为 缓慢）、屈曲位、姿势不稳和僵直。在一实施方式中，所述受试者表现出至少一种所述神经 系统症状的减少。在一实施方式中，所述底板中脑多己胺（DA)神经元群体源自根据本发 明的方法处理的底板中脑祖细胞群体。在一实施方式中，所述底板中脑多己胺（DA)神经 元群体源自根据进一步包括使底板中脑祖细胞群体与神经元成熟培养基接触的步骤的方 法处理的底板中脑祖细胞群体，所述培养基包括N2培养基、脑源性神经营养因子任DNF)、 抗坏血酸（AA)、胶质细胞系源性神经营养因子、二下醜CAMP和目3型转化生长因子，用于 使底板中脑祖细胞分化成底板中脑多己胺（DA)神经元。在一实施方式中，所述底板中脑 祖细胞群体源自根据本发明的方法处理的细胞群体。在一实施方式中，所述底板中脑祖细 胞群体源自根据诱导细胞定向分化成底板中脑祖细胞群体的方法处理的细胞群体，所述 方法包括；提供；i)细胞群体，其中所述细胞群体选自非胚胎干细胞、胚胎干细胞、诱导的 非胚胎多能细胞和工程多能细胞；和ii)第一信号传导抑制剂、第二信号传导抑制剂、音 酒因子（SHH)信号传导激活剂和第H信号传导抑制剂，其中所述第一抑制剂能够降低转 化生长因子目（TGF目）/Activin-Nodal信号传导，所述第二抑制剂能够降低SMAD(Small MothersAgainstDecapentaplegic)信号传导，并且所述第H抑制剂能够降低用于活化 Wingless(Wnt)信号传导的糖原合成酶激酶3目（GSK3目）信号传导；b)使所述细胞群体与 所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触，C)在使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第 二抑制剂接触之后，在使底板中脑祖细胞群体分化的条件下，进一步使所述细胞与所述音 酒因子（SHH)信号传导激活剂接触；和d)在使所述细胞群体与所述音酒因子（SHH)信号传 导激活剂接触之后，进一步使所述细胞与所述第H抑制剂接触，W使所述细胞群体分化成 底板中脑祖细胞群体。在一实施方式中，所述底板中脑多己胺（DA)神经元群体源自选自动 物、灵长类动物和人的细胞群体。在一实施方式中，所述人细胞是来自具有帕金森氏病（PD) 症状的患者的细胞。
[0016] 在一实施方式中，本发明提供一种组合物，其包括与LDN-193189和CHIR99021接 触的细胞群体，其中大于40%的所述细胞群体对于叉头框蛋白A2(F0XA2)是阳性的，并 且其中所述细胞群体预先与LDN-193189、SB431542、音酒因子（SHH)信号传导激活剂和 CHIR99021接触，其中所述音酒因子（SHH)信号传导激活剂选自音酒因子（SHH)C25II和 purmo巧hamine。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白A2(F0XA2)是至少50% 阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白A2是至少60%阳性的。在一实 施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白A2是至少70%阳性的。在一实施方式中，所述 细胞群体对于叉头框蛋白A2是至少80%阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉 头框蛋白A2是至少90%阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体对于叉头框蛋白A2是 至少95%至多100%阳性的。在一实施方式中，大于10%的所述细胞群体选自对于叉头 框蛋白A2(F0XA2)/LIM同源盒转录因子1，a(LMXlA)是双阳性的，W及对于叉头框蛋白 A2(F0XA2)/odhodenticle同源盒2(0TX2)是双阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体是 至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、至少95%至多100%阳性的。在一实 施方式中，至少20%的所述细胞群体对于选自伽口'1+、〔0142、0〔5]?1、〔063和〔099的标记 物是阳性的。在一些实施方式中，所述细胞群体是至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%、至少95%至多100%阳性的。在一些实施方式中，所述细胞群体是至少50%、60%、 70%、80%、90%、至少95%至多100%阳性的。在一实施方式中，所述细胞群体选自晒齿类 动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞和来自具有帕金森氏病（PD)神经系统症状的患者的人 细胞。
[0017] 在一实施方式中，本发明提供一种诱导细胞定向分化成底板中脑祖细胞群体的方 法，其包括，a)提供：i)细胞群体，其中所述细胞群体选自非胚胎干细胞、胚胎干细胞、诱导 的非胚胎多能细胞和工程多能细胞；和ii)第一信号传导抑制剂、第二信号传导抑制剂、音 酒因子（SHH)信号传导激活剂和第H信号传导抑制剂，其中所述第一抑制剂是SB431542， 所述第二抑制剂是LDN-193189,所述音酒因子（SHH)信号传导激活剂选自音酒因子（SHH) C25II和purmo巧hamine，并且所述第H抑制剂是CHIR99021 ;b)使所述细胞群体与所述第 一抑制剂和所述第二抑制剂接触，其中与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触在 能够产生分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行，使得与所述第一抑制剂和所述第二抑 制剂的所述接触在将细胞体外铺布的48小时内发生，C)在使所述细胞群体与所述第一抑 制剂和所述第二抑制剂接触之后，在使底板中脑祖细胞群体分化的条件下，进一步使所述 细胞与所述音酒因子（SHH)信号传导激活剂接触；和d)在使所述细胞群体与所述音酒因子 (SHH)信号传导激活剂接触之后，进一步使所述细胞与所述第H抑制剂接触，W使所述细胞 群体分化成底板中脑祖细胞群体。在一实施方式中，所述细胞与所述音酒因子（SHH)信号 传导激活剂的接触在能够产生分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行，使得在使所述细 胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，所述细胞与所述音酒因子（SHH)信 号传导激活剂的所述接触为至少24小时且至多36小时。在一实施方式中，所述细胞与所述 第H抑制剂的接触在能够产生分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行，使得在使所述细 胞群体与所述音酒因子（SHH)信号传导激活剂接触之后，所述细胞与所述第H抑制剂的接 触为至少24小时且至多36小时。在一实施方式中，底板中脑祖细胞群体包括大于40%的叉 头框蛋白A2(FOXA2)+LIM同源盒转录因子1+，a(LMXlA) +细胞。在一实施方式中，该方法进 一步包括步骤e)使所述底板中脑祖细胞群体与神经元成熟培养基接触，所述培养基包括 N2培养基、脑源性神经营养因子炬DNF)、抗坏血酸（AA)、胶质细胞系源性神经营养因子、二 了醜cAMP和目3型转化生长因子，用于使底板中脑祖细胞分化成底板中脑多己胺（DA)神 经元。在一实施方式中，所述底板中脑多己胺（DA)神经元对于选自叉头框蛋白A2(FOXA2)/ LIM同源盒转录因子1a(LMXlA) /酪氨酸轻化酶（TH);叉头框蛋白A2/LIM同源盒转录因子 1a/酪氨酸轻化酶/CD142 ;叉头框蛋白A2/LIM同源盒转录因子1a/酪氨酸轻化酶/核 受体相关1蛋白（NURRl);叉头框蛋白A2/LIM同源盒转录因子Ia/酪氨酸轻化酶/CD142/ 核受体相关1蛋白和酪氨酸轻化酶/a-突触核蛋白的标记物组是阳性的。在一实施方式 中，所述方法进一步包括步骤f)将用于CD142表达的所述底板中脑多己胺（DA)神经元分 选成对于CD142至少80%阳性的细胞群体。在一实施方式中，所述底板中脑多己胺（DA)神 经元对于鉴定一种分子的标记物是阳性的，所述标记物选自；酪氨酸轻化酶（TH)、叉头框 蛋白42(。0《42)^加同源盒转录因子1、多己胺、3,4-二轻基-苯己酸值0口4〇和高香草酸 (HVA)，a，核受体NURRl(NR4A2)、神经元特异性III类目-微管蛋白（Tujl)、TTF3、配对样 同源域3 (PITX3)、achaete-scute复合物（ASCL)、早期B细胞因子1巧8。-1)、早期B细胞因 子3巧BF-3)、转甲状腺素蛋白（TTR)、突触蛋白、多己胺转运蛋白（DAT)和G蛋白偶联的内 向整流钟通道化ir3. 2/GI服2)、CD142、DCSM1、CD63和CD99。在一实施方式中，该方法进一 步包括，提供对产生多己胺的神经元有需求的患者，W及在e)之后的步骤，通过移植用于 提供多己胺（DA)神经元功能的所述底板中脑多己胺（DA)神经元治疗所述患者。在一实施 方式中，所述患者包括至少一种选自震颤、运动徐缓（活动极为缓慢）、屈曲位、姿势不稳和 僵直的神经系统症状。在一实施方式中，观察到所述患者具有至少一种选自震颤、运动徐缓 (活动极为缓慢）、屈曲位、姿势不稳和僵直的神经系统症状。在一实施方式中，所述患者表 现出至少一种所述神经系统症状的减少。
[0018] 在一实施方式中，本发明提供一种用于治疗性处理的体内植入方法，其包括，a) 提供；i)底板中脑多己胺（DA)神经元群体，其中大于40%的所述群体表达酪氨酸轻化酶 (TH);和1〇受试者，其中所述受试者表现出至少一种神经系统症状，其中所述神经系统症 状选自震颤、运动徐缓（活动极为缓慢）、屈曲位、姿势不稳和僵直；和b)在允许体内植入 的条件下将所述底板中脑多己胺（DA)神经元移植到所述受试者中，用于提供多己胺（DA) 神经元功能。在一实施方式中，所述受试者表现出至少一种所述神经系统症状的减少。在一 实施方式中，所述底板中脑多己胺（DA)神经元群体源自进一步包括W下步骤的细胞群体： 将用于CD142表达的所述底板中脑多己胺（DA)神经元分选成对于CD142为至少80%阳性 的细胞群体。在一实施方式中，所述底板中脑多己胺值A)神经元群体源自在W下步骤之后 的底板中脑祖细胞群体；将用于CD142表达的所述底板中脑多己胺（DA)神经元分选成对于 CD142为至少80%阳性的细胞群体。在一实施方式中，所述底板中脑多己胺（DA)神经元群 体源自选自动物、灵长类动物、人和具有帕金森氏病（PD)症状的患者的细胞群体。在一实 施方式中，所述底板中脑多己胺（DA)神经元群体源自分离自动物、灵长类动物、人和具有 帕金森氏病（PD)症状的患者的细胞群体。
[001引 定父
[0020] 如本文所用，术语"疾病建模"是指使用实验有机体或体外细胞培养物来模拟由于 疾病的原因在人体中观察到的特定病征或症状的过程。在一实施方式中，可W将源自具有 导致神经系统疾病例如帕金森氏病（PD)的基因突变的动物模型的多能干细胞培养并分化 成神经细胞，用于鉴定与PD有关的神经元的新的特征。在一实施方式中，可W将源自具有 导致神经系统疾病例如帕金森氏病（PD)的基因突变的人的人多能干细胞培养并分化成携 带有在人类观察到的类似缺陷的神经细胞。
[0021] 如本文所用，术语"帕金森病（parkinsonism)"是指一组均与基底神经节（其 是大脑中控制运动的部分）中多己胺不足有关的疾病。症状包括震颤、运动徐缓（活动 极为缓慢）、屈曲位、姿势不稳和僵直。帕金森病的诊断要求存在有该些症状中的至少两 种，其中之一必须为震颤或运动徐缓。帕金森病最常见的形式是特发性或典型帕金森氏病 (PD),但是对显著少数的诊断来说，大约为总数的15%，可W存在有帕金森氏叠加综合症 (Parkinson's plus syn化omes，PP巧之一。该些综合症也称作非典型帕金森病，其包括皮 质基底核退化症（corticobasal degeneration)、路易体痴呆症（Lewy body dementia)、多 系统萎缩症（multiple systematro地y)和进行性核上性麻瘍。通常，帕金森氏病牵涉到主 要在称作黑质（substantia nigra)的大脑区域中在脑中的重要神经细胞的功能障碍和死 亡。许多该些重要神经细胞产生多己胺，当该些神经元相继死亡时，脑中由分化产生的多己 胺的量下降，使人不能正常控制运动。肠也具有在帕金森氏病患者中退化的多己胺细胞，该 可W是作为疾病一部分的胃肠道症状中的重要致病因素。个体经历的症状群因人而异。帕 金森氏病的主要运动病征包括W下：手、臂、腿、下颁和面部的震颤、运动徐缓或运动缓慢、 肢体和躯干的僵直或僵硬W及姿势不稳或者平衡和协调受损。
[0022] 如本文所用，术语"受试者"是指要成为特定治疗包括任何类型对照的受者的哺乳 动物（人和动物（即非人的动物））。通常，术语"受试者"和"患者"在本文中指代人受试 者时可互换使用。
[0023] 如本文所用，术语"非人动物"是指所有非人的动物，其包括，但不限于，脊椎动物， 例如晒齿类动物、非人灵长类动物、绵羊、牛、反白动物、兔类动物、猪、山羊、马、犬、猫、鸟类 等。
[0024] 如本文所用，术语"多己胺"是指由传递信息至含有控制运动和协调的神经元的大 脑部分的多己胺神经元所制造的化合物。
[002引如本文所用，术语"LSB"是指两种化合物LDN-193189和雄431542的组合，其能 够降低或阻断由细胞中转化生长因子目（TGF目VActivin-Nodal信号传导和SMAD(Small MothersAgainstDecapentaplegic)信号传导组成的信号传导。
[0026] 如本文所用，术语"SB431542"是指能够降低或阻断转化生长因子目（TGFP)/ Activin-Nodal信号传导的分子，其编号为CAS301836-41-9,分子式为C22H18N4O3,名称为 4- [4- (1，3-苯并二氧戊环-5-基）-5- (2-化巧基）-IH-咪哇-2-基]-苯醜胺，例如，参见 W下结构式：
[0027]
【权利要求】
1. 一种组合物，其包括与LDN-193189和CHIR99021接触的细胞群体，其中大于40% 的所述细胞群体对于叉头框蛋白A2(FOXA2)是阳性的，并且其中所述细胞群体预先与 LDN-193189、SB431542、音猬因子（SHH)信号传导激活剂和CHIR99021接触，其中所述音猬 因子（SHH)信号传导激活剂选自音猬因子（SHH)C25II和purmorphamine。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其中大于10%的所述细胞群体选自对于叉头框 蛋白A2(F0XA2)/LIM同源盒转录因子1，a(LMX1A)是双阳性的，以及对于叉头框蛋白 A2(F0XA2)/orthodenticle同源盒 2 (0TX2)是双阳性的。
3. 根据权利要求1所述的组合物，其中至少20%的所述细胞群体对于选自Nurrl+、 CD142、DCSM1、CD63和CD99的标记物是阳性的。
4. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞群体选自啮齿类动物细胞、灵长类动 物细胞、人细胞和来自具有帕金森氏病（PD)神经系统症状的患者的人细胞。
5. -种诱导细胞定向分化成底板中脑祖细胞群体的方法，包括， a) 提供： i) 细胞群体，其中所述细胞群体选自非胚胎干细胞、胚胎干细胞、诱导的非胚胎多能细 胞和工程多能细胞；和 ii) 第一信号传导抑制剂、第二信号传导抑制剂、音猬因子（SHH)信号传导激活剂和第 三信号传导抑制剂，其中所述第一抑制剂是SB431542,所述第二抑制剂是LDN-193189,所 述音猬因子（SHH)信号传导激活剂选自音猬因子（SHH)C25II和purmorphamine，并且所述 第三抑制剂是CHIR99021 ; b) 使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触，其中与所述第一抑制剂 和所述第二抑制剂的所述接触在能够产生所述分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行， 使得与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂的所述接触在将细胞体外铺布的48小时内发 生， c) 在使所述细胞群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，在使底板中脑祖 细胞群体分化的条件下，进一步使所述细胞与所述音猬因子（SHH)信号传导激活剂接触； 和 d) 在使所述细胞群体与所述音猬因子（SHH)信号传导激活剂接触之后，进一步使所述 细胞与所述第三抑制剂接触，以使所述细胞群体分化成底板中脑祖细胞群体。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞与所述音猬因子（SHH)信号传导激活剂 的所述接触在能够产生所述分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行，使得在使所述细胞 群体与所述第一抑制剂和所述第二抑制剂接触之后，所述细胞与所述音猬因子（SHH)信号 传导激活剂的所述接触为至少24小时且至多36小时。
7. 根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞与所述第三抑制剂的所述接触在能够产 生所述分化的底板中脑祖细胞群体的条件下进行，使得在使所述细胞群体与所述音猬因子 (SHH)信号传导激活剂接触之后，所述细胞与所述第三抑制剂的所述接触为至少24小时且 至多36小时。
8. 根据权利要求5所述的方法，其中所述底板中脑祖细胞群体包括大于40%的叉头框 蛋白A2(F0XA2)+UM同源盒转录因子1，a(LMX1A)+细胞。
9. 根据权利要求5所述的方法，还包括步骤e)使所述底板中脑祖细胞群体与神经元成 熟培养基接触，所述培养基包括N2培养基、脑源性神经营养因子（BDNF)、抗坏血酸（AA)、胶 质细胞系源性神经营养因子、二丁酰cAMP和0 3型转化生长因子，用于使底板中脑祖细胞 分化成底板中脑多巴胺（DA)神经元。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述底板中脑多巴胺（DA)神经元对于选自叉头 框蛋白A2(FOXA2)/LIM同源盒转录因子1a(LMX1A)/酪氨酸羟化酶（TH);叉头框蛋白A2/ LIM同源盒转录因子1a/酪氨酸羟化酶/CD142 ;叉头框蛋白A2/LIM同源盒转录因子1a/ 酪氨酸羟化酶/核受体相关1蛋白（NURR1);叉头框蛋白A2/LIM同源盒转录因子1a/酪 氨酸羟化酶/CD142/核受体相关1蛋白和酪氨酸羟化酶/a-突触核蛋白的标记物组是阳 性的。
11. 根据权利要求9所述的方法，还包括步骤f)将所述底板中脑多巴胺（DA)神经元对 于⑶142表达分选成对于⑶142至少80%阳性的细胞群体。
12. 根据权利要求9所述的方法，其中所述底板中脑多巴胺（DA)神经元对于鉴定一种 分子的标记物是阳性的，所述标记物选自：酪氨酸羟化酶（TH)、叉头框蛋白A2(FOXA2)、LIM 同源盒转录因子1、多巴胺、3,4-二羟基-苯乙酸（00?4〇和高香草酸（爪^)，〇，核受体 NURR1 (NR4A2)、神经元特异性III类0 -微管蛋白（Tujl)、TTF3、配对样同源域3(PITX3)、 achaete-scute复合物（ASCL)、早期B细胞因子1 (EBF-1)、早期B细胞因子3(EBF_3)、转 甲状腺素蛋白（TTR)、突触蛋白、多巴胺转运蛋白（DAT)和G蛋白偶联的内向整流钾通道 (Kir3. 2/GIRK2)、CD142、DCSM1、CD63 和CD99。
13. 根据权利要求9所述的方法，还包括，提供对产生多巴胺的神经元有需求的患者， 以及在e)之后的步骤，通过移植用于提供多巴胺（DA)神经元功能的所述底板中脑多巴胺 (DA)神经元来治疗所述患者。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述患者包括至少一种选自震颤、运动徐缓（活 动极为缓慢）、屈曲位、姿势不稳和僵直的神经系统症状。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述患者表现出至少一种所述神经系统症状的 减少。
16. -种用于治疗性处理的体内植入方法，包括， a) 提供： i) 底板中脑多巴胺（DA)神经元群体，其中大于40 %的所述群体表达酪氨酸羟化酶 (TH);和 ii) 受试者，其中所述受试者表现出至少一种神经系统症状，其中所述神经系统症状选 自震颤、运动徐缓（活动极为缓慢）、屈曲位、姿势不稳和僵直；和 b) 在允许体内植入的条件下将所述底板中脑多巴胺（DA)神经元移植到所述受试者 中，用于提供多巴胺（DA)神经元功能。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者表现出至少一种所述神经系统症状 的减少。
18. 根据权利要求16所述的方法，其中所述底板中脑多巴胺（DA)神经元群体源自根据 权利要求11所述进行处理的细胞群体。
19. 根据权利要求16所述的方法，其中所述底板中脑多巴胺（DA)神经元群体源自底 板中脑祖细胞群体，所述底板中脑祖细胞群体源自根据权利要求9所述进行处理的细胞群 体。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述底板中脑多巴胺（DA)神经元群体源自选自 动物、灵长类动物、人和具有帕金森氏病（PD)症状的患者的细胞群体。
【文档编号】C12N5/074GK104379731SQ201280066145
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2012年11月2日 优先权日:2011年11月4日
【发明者】L·施图德, J-W·沈, S·克里克斯 申请人:纪念斯隆-凯特琳癌症中心