专利名称：用于神经组织再生的植入组合物、其生产方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中枢神经系统(CNS)中神经组织再生的领域。尤其地，本发明涉及用于神经组织再生的生物 相容性可生物降解凝胶移植组合物及其制造方法，以及其用途。
背景技术：
中枢神经系统(CNS)受伤后的再生受到对抗髓磷脂和神经元修复的来自细胞外环境之抑制性影响的限制。通常，在脊髄或脑组织受伤后，因为原有细胞的丧失而产生空腔。这种空腔缺乏细胞外基质(extracellular matrix,ECM),并且经常通过胶质瘢痕与组织分隔开，这最初被认为阻断受伤后CNS中的再生(Windle等，J Comp Neurol. 1950 ；93 241-258)。最近，在数个不同的实验模型中，研究人员已经证明CNS轴突至少能够少量再生，其在损伤部位内甚至在短距离上出芽。(Liu,CN. El Al. ,Arch. Neurol. Psychiat. 1958 ；79 :46-61 ；Guth 等，Exp Neurol. 1985 ；88 :1-12 ；Freund 等，Nat Med. 2006 ；12 :790-792 ；Goshgarian 等，J Appl Physiol. 2003 ；94 :795-810 ；Li, Y.等，J Neurosci. 1994 ； 14 4050-4063 ； ;Taylor 等 J Neurosci. 2006 ；26 :9713-9721)。因此，在损伤部位本身，可发育出新形成的生长锥。但是，它们不会离开受伤的直接部位，而且它们看来不能凭自身产生任何长距离的再生，很快就会变得营养不良。(Li，Y.等，Exp Neurol. 1995 ；134 =102-111 ；Misgeld, T.等，Nat Rev Neurosci. 2006 ；7 :449-463 ；Misgeld, T.等，Nat Protoc. 20072
263-268)。之后开发了通过细胞治疗实现的神经再生策略。已提出将造血干细胞(又称间充质干细胞)、巨曬细胞、树突细胞、嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell)、施万细胞、胚胎干细胞、神经干细胞(NSC)以及神经元前体细胞(NPC)作为人神经疾病移植治疗的候选(Kawasaki等，Neuron. 2000. 28 :31-40. I)。然而，这些细胞的收集和使用面临伦理和组织病理学的挑战。相比之下，骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cell, BMSC)具有根据ECM的特定组成和因子分化为成骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、软骨细胞或神经元的能力(Engle AJ.等，2006. Celll26 (4) :677-689)。在用营养因子(trophic factor, TF)和神经胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)诱导后，BMSC可特异性产生脑组织细胞。这些经诱导的BMSC可以允许神经再生。自体BMSC还可以预防排斥相关的并发症(Dezawa 等，J. Clin. Invest. 2004. 113(12) :1701-1710)。事实上，已经表明分离的离体扩增的自体干细胞在CNS内递送后整合到宿主组织中，并应答于局部信号(local cue)而分化。尽管如此，移植的细胞不能从头产生组织，并应答于细胞与ECM的不适当相互作用而进入凋亡，称作失巢凋亡(anoikis)，这是一种细胞死亡的类型，由不同于启动其他类型凋亡的信号启动，导致移植后细胞数量下降到低于临界量(Modo等，Stroke2002 ；33(9) :2270-8 ；Okada, S.等，FASEB J 2005 ；19 :1839-41)。由于这一点，数位作者已表明，向培养基和生物基质中添加营养因子可以保护细胞免于凋亡损伤(KodaM.等，Neurosci Lett 2008 ；444 143-7, Jost, M.等，Mol Biol Cell 2001;12:1519-27)，并且可用于诱导细胞分化(Silva GA.，等，Science 2004 ；303 :1352-5)。然而，营养因子没能解决ECM指导的缺乏。可植入支架看来是移植细胞缺乏ECM支持和指导的解决方案。已经测试了基于基质胶(matrigel)、胶原蛋白、藻酸盐水凝胶、纤维蛋白以及聚α羟基酸的细胞支架组合物在CNS的神经再生中的有效性。比较广泛使用的支架之一是胶原蛋白，因为它是ECM的主要组分之一并且在ー些脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)模型中看来能够诱导轴突再生(Liu 等，Neurosurgery 2001 ；49 143-50 ；Goldsmth 等，Neurol Res 2005；27 :115-23)。然而，胶原蛋白诱导出导致封闭和隔离植入物的应答，使植入物不能与宿主组织相互连接。其他能够促进轴突伸长的支架是藻酸盐水凝胶(Kataoka等，J Biomed Mater Res 2001 ；54 :373-84 ;Suzuki 等，Neurosci Lett 2002 ;318 :121-4)、聚-α -轻基酸(Blacher 等，Biomaterials2003 ；24 :1033-40, Patist 等，Biomaterials 2004 ；25 1569-82)、合成水凝胶(Bakshi 等，J Neurosurg Spine 2004 ；I :322-9)或聚こニ醇(Shi R J Neurotrauma1999 ；16 :727-3823)。基质胶是来源于Engelbreth HolmSwarm肉瘤的包含层粘连蛋白、纤连蛋白以及蛋白聚糖的的ECM。多种研究展示，其在体外有效诱导神经细胞増殖，并在多 种 SCI 模型中诱导轴突再生(Novikova LN.等，J Biomed Mater Res A2006 ；77 :242-52 ；Xiao M. ,Exp Neurol 2005 ；194 12-30 ；Facchiano F 等，J Neurosurg 2002 ；97 :161-8)。纤连蛋白(ー种ECM糖蛋白)也已成功用作CNS再生中的细胞支架(Ahmed Z,Tissue Eng2003 ；9 :219-31) ο已经表明基于聚こ醇酸(Poly-glycolic Acid,PGA)的包含NSC的支架增强供体与移植细胞之间的双向相互作用(Park等，Nature Biotechnology2002 ；20(11)1111-7)。这种方法的另ー步骤是用NSC接种经血衆聚合丙烯胺(plasma polimerizedalylamine, ppAAm)处理的聚(D, L-乳酸-co_こ醇酸)颗粒并注射进受伤脑的损伤腔中，这给出了与宿主脑组织有效整合的原始“新脑(de novo brain) ”组织的来源(Bible等，2009Biomaterials 30 :2985-2994)。然而，PLGA颗粒的降解产物以及外源物质的长期存在可对细胞生理学产生不可预知的有害影响。由纤维蛋白原和凝血酶制备的纤维蛋白凝胶(Fibrin gel, FG)是良好的替代性生物相容性支架。不同于细胞外基质的组分，FG通过改变的缩聚反应由纤维蛋白原迅速组装而成(Janmey等，1982. Biopolymers 21,2253-2264)。这允许在生理条件下控制胶凝作用的时间和凝胶形态。最近在许多研究中探讨了纤维蛋白的生物化学和机械特性，提示了其在医学和生物工程中应用的潜力。许多作者已经证明纤维蛋白在组织再生中的效用(Falanga 等，Tissue Eng2007 ;13 :1299-1312)，偶尔将纤维蛋白与生长因子(aFGF、NT-3)一起使用或与其它基质组合使用(Taylor SJ 等，J Control Release2004 ；98 :281-9431 ；Gille J等，Tissue Cell 2005;37:339-4832)。FG作为生物密封剂用在外科手术中，并且被认为是可以刺激细胞粘附和生长的多孔支架(Le Guehennec L, Eur Cell Mater 2004 ；8 1-10)。富含血小板的血衆(Platelet-rich plasma, PRP)是也包含纤维蛋白的更复杂且更先进的植入材料。它的主要优点是PRP支架由自体物质制造，因此没有毒性或免疫应答。PRP 是最常用于整形外科(ffakitani S 等，J Bone Joint Surg Br 1989 ；71 74-80)和颌面部手术的自体支架，并且已经在小鼠中表现出对皮肤溃疡修复以及作为皮肤移植物的有益效果(Matras等,Osterr Z Stomatol 1970 ；67 :338-59)。此外，它也用于诱导新血管形成，以改进缺血或正常组织中的组织灌注(US2009053208)。然而，在神经疾病领域中目前还没有对PRP支架应用的研究。对于可以用于组织再生的支架而言，它所支持的细胞应该能够获得其预期组织的表型。在这方面，很多文献数据表明，在FG和PRP支架上培养的hBMSC可以分化成骨或软骨(32，63)。此外，多种体外研究支持神经BMSC转分化的可行性(64-66)，即使是在FG 支架上(Willerth 等“Optimization of fibrin scaffolds for differentiation ofmurine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials 2006 ；27 5990-6003.)，但目前还不知道这个过程是否能在PRP支架上发生。总之，目前在脊髄和脑损伤修复中用于细胞治疗的材料和策略并不完全令人满意。依然缺乏能够完全促进细胞増殖、迁移以及分化成健康神经细胞 的组合物。本领域需要开发用于CNS再生的有效工具。为解决该迫切需求，本申请的发明人在长期实验工作后已经开发出新的可生物降解生物相容性移植组合物，其能够引导和支持神经再生，促进新形成的神经组织整合到已有结构中。已经表明，这种新组合物在用于脑或脊髓修复时是有利的，因为它们易于成型，从而确保其适应受伤的组织并且填充外伤后的空腔。他们首次证明当把干细胞接种在这些PRP支架上并用生长因子(例如BDNF、NFG或视黄酸)刺激时，这些干细胞可以获得神经表型。因此，干细胞能粘附到这些生物基质上，呈现间充质形态并且表现出高存活率。本发明的作者己能表明，当将干细胞用在脊髄损伤或中枢神经系统的其他创伤性损伤的临床方案中时，可以将RPR支架视为支持这些细胞的理想基质。发明目的首先，本发明涉及用于神经组织再生的生物相容性可生物降解移植组合物，其包含a)由分离的含有血小板之流体与包含氯化钙的活化剂(包含或不包含凝血酶)形成的凝胶支架，b)神经生长因子，其选自BDNF、NGF、视黄酸及其组合；以及c)至少50000个祖干细胞的培养物。此外，本发明的ー个目的是用于治疗中枢神经系统损伤的方法，其包括将本发明的组合物移植至有此需要的对象中。最后，本发明的ー个目的是制备本发明组合物的方法，其包括i)分离含有血小板之流体；ii)分离并离体扩增祖干细胞；；iii)将ii)中获得的祖干细胞与i)中获得的含有血小板之流体和选自BDNF、NGF、视黄酸及其组合的至少ー种生长因子相组合；iv)向iii)中获得的组合中添加包含氯化钙的活化剂(其包含或不包含凝血酶)；以及V)使iv)中获得的混合物发生胶凝作用。附图
简述图I. FG支架。A :本研究所用支架的制备。B :100/50 FG支架(上)和20/100 FG支架(下)的宏观外观。两种支架都表现出高坚实度。C :10/4 FG支架的宏观外观。10/4 FG支架和5/2-GF支架表现出相似的中等坚实度。D :通过环境扫描电子显微镜分析的20/100FG支架的表面。可以看见粘附于蛋白网格的纤维蛋白的纤维结构以及ー些具有成纤维细胞形态的hBMSC(箭头)。E :接种在10/4 FG支架上的hBMSC的外观。培养7天后，hBMSC表现出球形形态。F :接种在20/100 FG支架上的hBMSC的外观。可以看见具有圆形形态的细胞(H&E技术)。G :影像示出了在20/100 FG支架FG中具有典型的成纤维细胞外观的平展的hBMSC (H&E技术)。H:接种在100/500 FG支架上的hBMSC。可以看到捕获在纤维蛋白网中的圆形细胞(H&E技术)。I和J :100/500FG支架上的凋亡的hBMSC。可以看到典型的染色质凝聚(I)以及细胞质泡(J) (H E技木)。图2. PRP支架。A :无凝血酶的PRP支架。中等坚实度。B:含有氯化钙和4IU凝血酶的PRP支架。该PRP支架和2IU凝血酶的PRP支架表现出中等坚实度。C :含有氯化钙和100IU凝血酶的PRP支架。凝胶的坚实度使得可以容易地操作。D :含有氯化钙和500IU凝血酶的PRP支架，其表现固体但多孔的坚实度。E至H :通过环境扫描电子显微镜观察的PRP支架表面。E :仅含有氯化钙的PRP支架(0IU凝血酶)。具有松散并且多孔的纤维蛋白网格的粗糙表面。其被hBMSC和血小板完全覆盖。F :含有2IU凝血酶的PRP支架。表面更加平滑，但hBMSC被很好地结合。G :含有100IU凝血酶的PRP支架。H :含有500IU凝血酶的PRP支架。在这两种PRP支架中都具有松散的纤维蛋白网格，但表面非常粗糙，这是因为很多的血小板以及粘附hBMSC。I至L :通过倒置显微镜观察的接种在我们的PRP支架上的hBMSC的外观。这些细胞表现成纤维细胞形态。I :只含有氯化钙的PRP支架。J:含有20IU凝血酶的PRP支架。K :含有100IU凝血酶的PRP支架。L :含有500IU凝血酶的PRP支架。 M至P :培养在我们的不同PRP支架上的表现出成纤维细胞形态的hBMSC。M :含有20IU凝血酶的PRP支架。O :含有100IU凝血酶的PRP支架。P :含有500IU凝血酶的PRP支架。图3.测量hBMSC在FG支架和PRP支架上的增殖能力。A :20/100FG支架上的表现Ki-67阳性的hBMSC。尽管这些细胞表现为球形形态，但可以看到増殖活性。在插图(a)中双免疫染色示出了⑶73阳性细胞(绿色)和Ki67表达(红色)。B :在含有100IU凝血酶的PRP支架上支持的Ki-67阳性hBMSC。可以看到大量表现Ki_67阳性的细胞。箭头指出了处于有丝分裂中的细胞。细胞死亡率的测量C :20/100 FG支架上表现TUNEL阳性(绿色)的hBMSC。D :含有100IU凝血酶的PRP支架上的hBMSC。只有分离的细胞(箭头)表现TUNEL阳性。图4.培养的hBMSC的RT-PCR分析。A :接种在FG支架上的hBMSC中神经元基因以及星形胶质细胞基因的表达。含有NGF的20/100 FG支架允许巢蛋白(nestin)表达，但无β-III微管蛋白(神经元的)或GFAP (星形胶质细胞的)基因表达。含有BDNF的10/4支架允许巢蛋白和β-III微管蛋白表达，但无GFAP表达。含有BDNF的20/100 FG支架允许巢蛋白、β-III微管蛋白以及GFAP的表达。(a):接种在含有BDNF的20/100支架上的hBMSC (H. E.技术)。(b):接种在含有BDNF的20/100支架上的hBMSC。免疫染色表明强的巢蛋白阳性。B:在接种于PRP支架上的hBMSC中神经元基因以及星形胶质细胞基因的表达。这些支架总是允许巢蛋白、β-III微管蛋白以及GFAP的表达。(c):接种在含有100IU凝血酶的PRP支架上的hBMSC，其表现神经细胞的形态(相差显微术)。(d) =PRP上的hBMSC。图5. A:脑损伤区上凝胶移植的位置(* )。B:置于脑损伤处的凝胶移植物。C:一周后，植入细胞的外貌(双苯甲酰胺标记測定)。D :七天后，在脑损伤处包封在凝胶支架中的用双苯甲酰胺标记的基质细胞(细胞核为绿色)以及具有活细胞外貌的基质细胞。免疫荧光示出了这些细胞的神经分化(箭头)，其通过细胞质延长的形成以及巢蛋白表达(红色)来识别。发明描述本领域需要用于CNS损伤中的神经组织再生的有效工具。
在本发明中，本发明的作者提供了移植组合物，其能完全促进干细胞増殖、迁移以及分化成健康神经元细胞，其以可生物降解的生物相容性移植支架形式用作CNS再生的有效工具，该支架引导和支持神经再生、促进新形成的组织整合到已有结构中。在ー个主要实施方案中，本发明涉及用于神经组织再生的生物相容性可生物降解凝胶移植组合物，其包含以下组分a)由分离的含有血小板之流体与包含氯化钙的活化剂(有或没有凝血酶)形成的凝胶支架山)神经生长因子，其选自BDNF、NGF、视黄酸及其组合，以及c)至少50000个祖干细胞的培养物(下文称为“本发明的组合物”)。在本发明的上下文中，以下术语应当按如下理解移植物个体中的可植入元件，包含支架和分离的细胞，其中“可植入”指其与机体组织结合，通常是为了替代、矫正或以其他方式克服缺损，其中所述支架提供适于细胞粘附和增殖的表面。·
生物相容性指由于无毒、无害且不产生免疫排斥而对活组织或活系统显示相容性的化合物。可生物降解指能够降解成无害产品并且可以被机体逐渐吸收和/或清除的物质。生物活性指对活生物体、其部分、器官、细胞或其代谢产生影响的化合物。用在本发明组合物中的分离的祖干细胞的培养物可以获得自分离的自体或异体祖干细胞。此外，为本发明目的，术语“含有血小板之流体”指悬浮在作为血小板生长因子载体的小体积血浆中的血小板浓缩物，所述血小板生长因子由血小板主动分泌，例如血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, F1DGF)、血小板衍生表皮生长因子(platelet-derived epidermal growth factor, F1DEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowth factor, FGF)、转化生长因子 β (transforming growth factor-beta, TGF-β )和血小板衍生血管发生生长因子(platelet derived angiogenesis growth factor,PDAF)等。含有血小板之流体可以是自体的或非自体的。在一个优选实施方案中，含有血小板之流体为自体的。自体血小板凝胶指由含有自体血小板之流体和自体或非自体活化剂制成的组合物。在组合物中使用自体组分的主要优点是降低受者发生炎性应答或暴露于传染性和外源物质的风险。在一个优选的实施方案中,含有血小板之流体选自富血小板血衆(platelet richplasma, PRP)或贫血小板血衆(platelet poor plasma, PPP)。在PRP中，血小板浓度为95%，而在PPP中该百分比低于5%。在ー个具体实施方案中，当使用贫血小板血浆(PPP)时，移植组合物还包含外源添加的血小板细胞因子。这些血小板细胞因子可以是自体或异体的。含有血小板之流体与氯化钙之间的反应(有或没有凝血酶)产生凝胶。可以在支架凝胶化之前将细胞与活化剂离体混合。通过这种方式，在移植进组织前细胞就被捕获在凝胶中。然而，在ー个具体实施方案中，活化剂可以以单独的形式提供，其g在原位施用于含有血小板之流体，从而在损伤部位形成凝胶支架。在一个优选的实施方案中，凝胶支架由富血小板血浆流体和量为25至50 μ mol/1的氯化钙形成。任选地，所述组合物可以额外包括量为O. Ol至5IU/ml的凝血酶。更优选地，在所述组合物中使用的生长因子为BDNF、NGF和视黄酸的组合。在ー个更优选的实施方案中，生物相容性可生物降解移植组合物包含量为50至200ng/ml的BDNF、量为50至200ng/ml的NGF以及量为O. 5至2 μ g/ml的视黄酸。在另ー主要实施方案中，本发明涉及用于治疗中枢神经系统中损伤的方法，其包括向有此需要的对象的CNS组织损伤部位提供本发明的组合物在ー个具体的实施方案中，可以将活化剂(组分B)与组合物(组分A)(包含含有血小板之流体、神经生长因子和细胞)分开施用至损伤部位，从而在“原位”形成凝胶支架。为使凝胶可以在损伤部位形成，活化剂(组分B)必须与包含细胞和神经生长因子的含有血小板之流体的凝胶(组分A)同时放置。为了使这两种组分可被均匀混合，优选在本发明中使用双注射器注射技术。在另ー实施方案中，本发明涉及本发明组合物在制造用于治疗CNS中损伤的药物 组合物中的用途。可以将药物组合物的组分一起施用，或者可将活化剂以与其他组分以分开的形式施用。所述药物组合物可以包含一种或更多种可药用赋形剂。本文使用的“可药用赋形齐U”指不干扰本发明的细胞和其他试剂的生物活性效果的无毒物质。在另ー实施方案中，本发明涉及本发明组合物作为移植物用于治疗CNS中损伤的用途。在另ー实施方案中，本发明涉及制备本发明组合物的方法，其包括i)分离含有血小板之流体；ii)分离和离体扩增祖干细胞；iii)将b)中获得的祖干细胞与a)中获得的含有血小板之流体和选自BDNF、NGF、视黄酸及其组合的至少ー种生长因子相组合；iv)向c)中获得的组合中添加包含氯化钙的活化剂(有或没有凝血酶)；以及V)使在e)中获得的混合物发生胶凝作用。含有血小板之流体的胶凝作用可以非原位发生或者原位发生。在后一种情况下，步骤iv)和步骤V)在损伤部位原位进行。
实施例材料和方法BMSC的分离和表征从进行常规的全髋关节置换手术的血液学上正常的成年患者(从52岁至60岁)中收集骨髓样品。所有情况下都获得了知情同意。从每个患者的髂嵴获取单个骨髄抽出物(35ml至50ml)。为了防止凝集，在抽吸针中预先装入无菌的硫酸肝素(1000U/ml)。收集后立即将骨髄抽出物分份。将每4ml的抽出物在15ml锥形管中的3ml无菌聚蔗糖-泛影葡月安(Ficoll_Hypaque)TM Plus(Stem Cell Technologies Inc. , vancouver,BC, Canada； Jl成层。将产生的悬液在室温下以1500rpm离心30分钟。将在聚蔗糖-泛影葡胺与血浆之间界面的单核层取出并在10mla-MEM/2. 5FBS介质中重悬，并通过70μπι细胞滤网。将该细胞在IOOOrpm下离心5分钟并重悬在α -MEM/2. 5FBS介质中。使用台盼蓝测试来测定细胞的数目和活力，并在密度为5000细胞/cm2时将该细胞在含有a-MEM(补充有10%胎牛血清、1000单位/ml青霉素、1000 μ g/ml硫酸链霉素，O. 25 μ g/ml)的T-75瓶中涂板。在通气培养箱中于37°C、5% CO2下进行培养。第一次细胞培养基更换在第3天进行以除去非粘附细胞。之后每2至3天进行细胞培养基更换。之后使用传代I至2次的BMSC。使用流式细胞术分析以测定培养细胞上的特异性标志物。将悬液中的细胞与缀合有荧光染料的抗 CD29、CD31、CD44、CD45、CD105 以及 CD 166 抗体(R&D Systems SL, Inc. Minn.，USA)混合。使用适当的同种型抗体作为非特异性染色的对照。根据制造商的推荐进行染色。得到免疫染色的细胞并在流式细胞仪(Beckman Coulter Inc. ,Fullerton,CA,USA,Cytomic FC500-MPL)上分析。FG支架的制备根据制造商的说明使用Tissueol!< Duo kit 5ml(Baxter SL, Valencia, Spain)制备FG支架。通过混合两种分开的溶液而形成纤维蛋白凝胶。溶液A由纤维蛋白原 (100mg/ml) UOIU因子XIII、9mg纤连蛋白以及120mg/ml人纤溶酶原组成，以上物质溶解在3000IUK牛抑肽酶、人白蛋白、甘氨酸、氯化钠、柠檬酸钠、聚山梨酷-80、肌酸和水的溶液中。溶液B包含溶解在氯化钠溶液中的500IU人凝血酶以及40 μ mole的氯化钙。将溶液A与溶液B以I : I的比例混合。通过在无菌的蒸馏水中溶解纤维蛋白原而制备溶液。在我们的本研究中，测试了 4种不同的纤维蛋白原浓度5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml以及IOOmg/ml,还测试了氯化I丐(40 μ mole/ml)中4种不同的凝血酶浓度(2IU/ml、4IU/ml、100IU/ml和 500IU/ml)。对于实验，使用多种稀释度的溶液A和溶液B来制备FG支架，这些溶液由它们各自的纤维蛋白原和凝血酶浓度来标识(表I)。使用100 μ I的溶液A和100 μ I的溶液B在P35板上聚合成所有的FG支架，并进行小的200 μ I外植体(大约每板10个外植体)。首先聚合成支架，之后在37で、95%相対湿度以及5% CO2下孵育I小吋。在A和B之间的反应产生凝胶。对于每种类型的支架我们使用了总计六个P35板。在聚合成支架之前，将hBMSC与凝血酶组分混合，每个外植体总计50000个细胞。之后，向每个板加入3ml a -MEM/10%FBS完全培养基。每天通过倒置显微镜观察捕获在凝胶中的细胞的形态，观察7天。表I.用来制备FG支架的纤维蛋白原溶液以及凝血酶溶液的终浓度
厂-维蛋白原溶液I凝血酶溶液Γ支架「
P35数量
_( nii>/ml) j ( 11/ml) |、纤·维. 白/凝 jfc-酶)
ISI2 I5/26
10410/46
20100 I20/1006
_ 100 I 500 I 100/S00_ 6
PRP支架的制备为了制备PRP支架，获取来自健康供体患者的外周血并收集在含有3. 8%柠檬酸钠(O. 5cc全血，柠檬酸盐/4. 5cc)的管中。将经抗凝的血液样品在2000g下离心15分钟以除去红细胞。收集上清液并在2400g下再离心6分钟。将每4. 5cc的血收集至包含作为抗凝血剂的500 μ I 3. 8%柠檬酸钠的管中。将血液在2500rpm下离心5分钟，并分离包含PRP级分的黄色血浆。为了形成凝胶，向每IOOy I的PRP中仅加入IOOy I 10%氯化钙(34 μ mole/ml)，或者加入 50 μ I 凝血酶(2IU、4IU、100IU 以及 500IU)和 50 μ I 10% 氯化钙。所有的血浆支架在由小的200 μ I外植体制成的P35板(每板大约10个外植体)中聚合。首先使支架聚合，之后在37で、95%相対湿度以及5% CO2下孵育I小吋。PRP与氯化钙(有或没有凝血酶)之间的反应产生凝胶。在每组中研究6个板Ρ35。对于实验，使用多种溶液制备血浆支架(表II)。用PRP制备的支架由凝血酶浓度来标识。在支架聚合前将细胞与凝血酶或氯化钙组分混合，每个外植体总计50，000个细胞。之后，向每板加入3ml a -MEM/10% FBS完全培养基。每天通过倒置显微镜观察捕获在凝胶中的细胞的形态，观察7天。 表II :用来制备不同PRP支架的血浆溶液和凝血酶溶液的终浓度
权利要求
1.用于神经组织再生的生物相容性可生物降解移植组合物，其包含以下组分 a.由分离的含有血小板之流体与包含氯化钙的活化剂形成的凝胶支架，其含有或不含有凝血酶， b.神经生长因子，其选自BDNF、NGF、视黄酸及其组合，和 c.至少50000个祖干细胞的培养物。
2.根据权利要求I所述的生物相容性可生物降解移植组合物，其中所述活化剂可以与含有血小板之流体以分开的形式提供，以在原位形成所述凝胶支架。
3.根据权利要求I所述的生物相容性可生物降解移植组合物，其中所述含有血小板之流体选自富血小板血浆和贫血小板血浆。
4.根据权利要求3所述的生物相容性可生物降解移植组合物，其中所述含有血小板之流体是贫血小板血浆。
5.根据权利要求4所述的生物相容性可生物降解移植组合物,其还包含外源添加的血小板细胞因子。
6.根据权利要求3所述的生物相容性可生物降解移植组合物，其中a)是由富血小板血浆流体与量为25至50 μ mol/1的氯化钙所形成的凝胶支架。
7.根据权利要求6所述的生物相容性可生物降解移植组合物，其中a)还包含量为0.01 M 5IU/ml的凝血酶。
8.根据权利要求6和7中任一项所述的生物相容性可生物降解移植组合物，其中b)是BDNF, NGF与视黄酸的组合。
9.根据权利要求8所述的生物相容性可生物降解移植组合物，其中BDNF的量为50至200ng/ml, NGF的量为50至200ng/ml，视黄酸的量为O. 5至2 μ g/ml。
10.权利要求I至9中任一项所述的组合物作为移植物的用途
11.根据权利要求I至9所述的组合物在制造用于治疗CNS中损伤的药物组合物中的用途。
12.制备权利要求I所述组合物的方法，其包括 i.分离含有血小板之流体； .分离并离体扩增祖干细胞； iii.将ii)中获得的祖干细胞与i)中获得的含有血小板之流体和选自BDNF、NGFjf黄酸及其组合的至少一种生长因子相组合； iv.向iii)中获得的组合中添加包含氯化钙的活化剂，其含有或不含有凝血酶； v.使iv)中获得的混合物发生胶凝作用。
全文摘要
本发明涉及用于神经组织再生的植入组合物，其包含a)由分离的含有血小板之流体与包含氯化钙的活化剂形成的凝胶支持物，其含有或不含有凝血酶；b)神经生长因子，其选自BDNF、NGF、视黄酸及其组合；和c)至少50 000个祖干细胞的培养物。此外，本发明涉及所述组合物作为植入物的应用及其制备方法。
文档编号A61L27/38GK102858957SQ201080061796
公开日2013年1月2日 申请日期2010年11月18日 优先权日2009年11月20日
发明者梅塞德斯·苏里塔卡斯蒂略, 赫苏斯·巴克罗克雷斯波, 康塞普西翁·阿瓜约费雷尔, 劳拉·奥特罗奥尔特加 申请人:飞纳生物技术单人有限责任公司