基因工程酵母细胞的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生产高水平的乙酰乙酰辅酶A的酵母细胞。还涉及一种用于制造这种酵母细胞的方法以及这种酵母细胞在生产乙酰辅酶A衍生产物的方法中的应用。
【专利说明】基因工程酵母细胞【技术领域】
[0001]本发明涉及生产高水平的乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A的酵母细胞。本发明还涉及用于制造这种酵母细胞的方法，以及这样的酵母细胞在生产乙酰辅酶A衍生的产物的方法中的应用。
【背景技术】
[0002]具有广泛工业利益的天然产物在工程化宿主细胞(即所谓的细胞工厂)中的生物合成可以放出这些天然资源的尚未实现的商业潜力。因此，开发可以有效地将廉价的碳源转换成所谓的前体代谢产物并进一步转化成目标产物的细胞工厂平台的兴趣与日俱增。其中的一个关键的代谢产物是乙酰辅酶A，其被用作前体用于生产各种各样的工业上感兴趣的产物，包括类异戊二烯(主要用作调味料和香料，生物柴油，抗疟药物和抗癌药，抗生素，橡胶，膳食补充剂，食品成份和维生素)、聚酮(抗生素，抗癌药和免疫抑制剂)、脂质(如膳食补充剂，药品和生物柴油)、聚羟基烷酸酯和1- 丁醇(图1)。
[0003]在前一项研究中，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的丙酮酸脱氢酶旁路的工程化显示增强了乙酰辅酶A的供应并增加了倍半萜化合物的紫穗槐二烯的生产(Metab Eng2007,9:160 ；W02007024718)。这是通过乙醛脱氢酶的过度生产和将异源沙门氏菌(Salmonellaenterica)乙酰辅酶A合成酶的变体引入宿主细胞中来达到的。
[0004]然而，仍然需要进一步提高乙酰辅酶A的生产，直至当其满足应当增加任何所需的乙酰辅酶A衍生产物的生产。本发明使用结合的推-拉-阻断策略(push-pul 1-block)解决了这一问题，从而提供了可用于提高生产乙酰辅酶A衍生产物的细胞工厂平台。这里通过使用由乙酰辅酶A衍生的3种不同的化合物来举例说明。
【发明内容】
[0005]在第一方面，本发明提供了通过将醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶(ACS)的过表达修饰的酵母细胞，其特征在于进一步过表达醇脱氢酶和乙酰乙酰辅酶A合成酶。
[0006]另一个方面，本发明提供了制备修饰的酵母细胞的方法，包括过表达醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶(ACS)，其特征在于所述方法还包括过表达醇脱氢酶和乙酰乙酰辅酶A合成酶。
[0007]又一个方面，本发明提供了一种生产升高水平的乙酰辅酶A衍生的产物的方法，其包含在有利于所述产物的生产的条件下培养本发明的酵母细胞，所述酵母细胞能够生产这样的产物。
【专利附图】
【附图说明】
[0008] 图1:酿酒酵母中的乙酰辅酶A代谢的简化概述。乙酰辅酶A是一个关键的初级代谢产物，其定位于三个不同的亚细胞区室:细胞质(C)、线粒体(A)和过氧化物酶体(B)。在三个区室之间没有乙酰辅酶A的直接传输，并且三个区室中乙酰辅酶A的生物合成涉及到不同的代谢路径。在线粒体中，乙酰辅酶A由丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶复合物而形成。在细胞质中，乙酰辅酶A由乙酸酯通过乙酰辅酶A合成酶而形成。在过氧化物酶体中，乙酰辅酶A可由乙酸酯(也通过乙酰辅酶A合成酶，未示出)形成，也可由脂肪酸通过β-氧化而形成。在线粒体中，在乙酰辅酶A的主要命运是通过三羧酸(TCA)循环的氧化。过氧化物酶体中的乙酰辅酶A可以通过乙醛酸循环(GYC)被转化为C4有机酸(苹果酸和琥珀酸)，所述有机酸可被转移到线粒体中通过苹果酸酶和TCA循环进行氧化。乙酰辅酶A在细胞质中的主要命运是作为细胞脂质(脂肪酸和麦角固醇)的前体。许多工业上感兴趣的生物技术产物均源自乙酰辅酶A并且大多数的这些产物合成发生在细胞质中。因此，所有这些产物的酵母细胞工厂平台应使碳重定向于细胞质中的乙酰辅酶Α。
[0009]图2:用于提高细胞质中乙酰辅酶A的生产的推-拉-阻断代谢工程策略的说明(乙酰辅酶A定位的三个细胞区室如图1所描绘的)。通过过表达编码NADP-依赖性乙醛脱氢酶的内源ALD6和来自沙门氏菌(ACSse)的编码乙酰辅酶A合成酶的异源ACS变体，可以确保在细胞质中流动(flux)由乙醛定向到乙酰辅酶A(该策略的推部分)。通过进一步过表达编码乙醇脱氢酶的ADH2，进一步保证了生产的乙醇可以被转换回乙醛并由此进一步转化为乙酰辅酶A(策略的拉部分)。为了在期望的路径上拉乙酰辅酶A，我们过表达编码乙酰乙酰辅酶A合成酶的ERGlO，所述合成酶催化乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A (AcAcCoA)，因为这种代谢物是用 于评估乙酰辅酶A平台菌株的三种产物的常见的前体。除了过表达之外，涉及乙酰辅酶A的消耗的反应被删除(策略的阻断部分)。这涉及乙醛酸循环(GYC)的两个关键反应，即由CIT2编码的过氧化物酶体柠檬酸合酶和由MLSl编码的细胞质苹果酸合酶。附图中的该路径图是代谢的简化视图，例如过氧化物酶体中柠檬酸合成酶使用的乙酰辅酶A是由乙酸酯通过Acslp在此合成的。
[0010]图3:质粒PIYC05和PIYC08的图谱。
[0011]图4:质粒pICKOUpAKOl和pPHB-pha的图谱以及α -檀香烯(A)U- 丁醇(B)和PHB(C)重组生物合成路径的示意图。
[0012]图5:酵母乙酰辅酶A的代谢工程提高了 α-檀香烯(A)、l_ 丁醇⑶和聚羟基丁酸酯(PHB)(C)的生产。重组生物合成路径的示意图在上部分中示出。下述的酶来源于其它生物:Sts,黄皮(Clausena lansium) ;PhaA, PhaB, PhaC,真氧产喊杆菌(Ralstoniaeutropha) ；Hbd, Crt, AdhE2,拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii) ；Ter,齿垢密螺旋体(Treponema denticola)。过表达截断版本的内源HMGl (tHMGl)用于α-檀香烯的生产。所有的工程化酿酒酵母菌株在文中都有记载。培养物生长在含有20ml定义的基本培养基(具有20克/升葡萄糖作为碳源)的10ml摇瓶中。α -檀香烯水平通过GC-MS定量，1- 丁醇和PHB水平通过HPLC定量。tHMGl，羟甲基戊二酰辅酶A还原酶；Sts，α -檀香烯合酶；PHaA,乙酰辅酶A乙酰转移酶；PhaB，乙酰乙酰辅酶A还原酶；PhaC，聚(3-羟基丁酸酯)聚合酶；Hbd，3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶；Crt，巴豆酸酶；Ter，反式烯酰辅酶A还原酶；AdhE2，丁醛脱氢酶/ 丁醇脱氢酶。
[0013]图6:Adh2和ErglO的过表达进一步提高了共表达ACSse和ALD6的酵母细胞中α -檀香烯的效价。在表达下述基因的酵母菌株中α -檀香烯积聚的对比:(i)截短版本的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(tHMGl)基因和α-檀香烯合酶基因(Sts)(菌株SCIYC40)；
(ii)tHMGl 和 Sts 基因连同 ACSse 和 ALD6 基因(菌株 SCIYC41) ;tHMGl、Sts、ACSse、ALD6 基因连同Adh2和ErglO (菌株SCIY42)。
【具体实施方式】
[0014]本发明的酵母细胞具有惊人的优势，生产增高水平的乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A，从而能够生产增高水平的由它们衍生的有用产物，例如萜类化合物、1-丁醇和聚羟基丁
酸酯等。
[0015]酵母细胞可以是任何类型的酵母细胞。优选地，所述酵母细胞能够产生乙醇。更优选地它是从酵母属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、毛霉属(Mucor)、毕赤酵母属(Pichia)和球拟酵母属(Torulopsisgenera)的酵母中选出。最优选地，它是酿酒酵母。
[0016]该策略包括将来自乙醇的碳通过乙醛推至乙酰辅酶A。这是通过过表达醇脱氢酶(例如酿酒酵母中的内源性ADH2基因)和醛脱氢酶(如酿酒酵母中的NADP依赖性ALD6基因)和乙酰辅酶A合成酶(例如来自肠道沙门氏菌(ACSse)的ACS变体(L641P))来实现的。ACSse含有点突变，可防止酶被乙酰化抑制(JB1l Chem2005，280:26200)，并且该变体的应用在细胞质中特别有效地将流动由乙醛重定向到乙酰辅酶A。
[0017]为了确保乙酰辅酶A朝着三种目标产物方向的拉动，同样过表达乙酰辅酶A C-乙酰转移酶，所述转移酶催化乙酰辅酶A转化成乙酰乙酰辅酶A(AcAcC0A)。AcAcCoA是用于评估的乙酰辅酶A平台菌株的三种产物的常见的前体。在酿酒酵母中，ERGlO基因编码乙酰辅酶A C-乙酰转移酶。 [0018]在本发明的一个优选实施方案中，所述酵母细胞通过缺失编码细胞质苹果酸合酶基因或来自酵母细胞基因组的编码过氧化物酶体柠檬酸合酶的基因被进一步修饰。这种缺失具有避免乙酰辅酶A在乙醛酸循环中被消耗的优点，从而增加乙酰辅酶A在其他路径(如那些生成萜类化合物、1- 丁醇或聚羟基丁酸酯的路径)中的可用性。
[0019]为了进一步降低来自前体乙酰辅酶A池的碳损失，优选清除涉及乙酰辅酶A消耗的反应。这涉及除去乙醛酸循环(GYC)的两个关键反应，即酿酒酵母中分别由CIT2和由MLSl编码的过氧化物酶体柠檬酸合酶和胞质苹果酸合酶。
[0020]本发明的酵母细胞可以通过包含过表达醛脱氢酶、乙酰辅酶A合成酶(ACS)、醇脱氢酶和乙酰乙酰辅酶A合成酶的方法来制得。
[0021]在本发明的一个优选实施方案中，所述方法还包括从酵母细胞基因组中缺失编码细胞质苹果酸合酶的基因或编码过氧化物酶体柠檬酸合酶的基因。
[0022]醛脱氢酶、ACS、醇脱氢酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、细胞质苹果酸合酶、过氧化物酶体柠檬酸合成酶和酵母细胞如上文涉及酵母细胞的本发明的任何实施方案中所定义。
[0023]醛脱氢酶、ACS、醇脱氢酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶的过表达可以使用附加型酵母表达载体进行或通过使用现有技术中公知的方法的基因组整合进行。这些方法是标准方法，但可以例如按照Methods in Yeast Genetics, 2005Ed., Cold Spring Harbor Laboratorypress中所描述的来进行。
[0024]苹果酸合酶和柠檬酸合酶基因的缺失可通过本领域技术人员公知的用于基因缺失的任何方法来进行，诸如例如无克隆基于PCR的等位基因置换方法(如在GenomeRes.1997,7:1174所述的)或任何其它基因缺失方法。
[0025]通过在合适的条件下培养本发明的酵母细胞，可以产生次级代谢物。优选地，以增加的水平产生所述代谢物，即将培养本发明的酵母细胞与培养未转化的酵母细胞相比较时产生了更多的次级代谢产物。
[0026]酵母细胞必须能够产生所希望的次级代谢产物。这意味着酵母细胞天然能够生产这样的次级代谢产物或者替代地用生产这类代谢物所必需的另外的基因转化酵母细胞。如上所述的酵母细胞的进一步修饰具有增加未如此修饰的酵母细胞产生次级代谢产物的水平的效果。
[0027]例如，当次级代谢产物是萜类化合物时，酵母细胞可以被转化以表达或过表达能够催化无环萜前体向此类萜类化合物转化的萜合成酶。取决于所打算要生产的萜类化合物，这适用于所有的无环萜前体，诸如例如焦磷酸栊牛儿酯、焦磷酸法呢酯和焦磷酸栊牛儿基栊牛儿酯。萜类化合物是因它们的风味和香味、化妆品、医药和抗微生物性质而公知的天然产物。这些化合物由称为异戊二烯单元的五碳单元形成，并通过这些单元存在于它们的结构中的数目来分类。因此单萜、倍半萜和二萜分别是含有10、15和20个碳原子的萜。例如倍半萜广泛存在于植物界中。许多单萜、倍半萜和二萜分子因它们的风味和香味特性以及它们的化妆品、医药和抗菌效果而公知。超过300种倍半萜烃和3000倍半萜类化合物已经被鉴定出来，并且每年有许多新的结构被鉴定出来。通过不同的方式如水蒸气蒸馏法或溶剂萃取得到的植物提取物作为萜的来源。萜分子通常原样使用，但在某些情况下，使用化学反应将萜转化为其它高价值分子。当今使用的大多数萜是提取自不同生物体(植物、海洋生物...)的天然产物。然而，大多数这些源生物体不适合于生产商业上可行数量的大规模种植，也不适合于遗传操作以增加其生产能力。此外，许多这些天然产物具有复杂的结构且目前尚无化学手段 可用。
[0028]优选的倍半萜的例子包括α -檀香烯、广藿香醇、β -檀香烯、朱栾倍半萜、荜澄茄醇、客烯(zizaene)、紫穗槐4，11_ 二烯、_草烯、马5?铃烯、佛手柑油烯(bergamotene)、姜烯、金合欢烯、石竹烯、异胡萝卜烯、倍半松油烯(sesquithujene)、阿维醇(avermitilol)、桉叶油醇、岩兰螺旋二烯(vetispiradiene)、长叶烯、环古巴茨烯(cyclocopacamphene)、异长叶烯、大根香叶烯、双环大根香叶烯、红没药醇、大根香叶二烯醇(germacradienol)、四甲基环癸二烯异丙醇(hedycaryol)、巴巴烯(barbatene)、表雪松醇、表马览铃、倍半香桧烯、枯烯(cuprene)、蛇床烯、古巴烯、大果烯(macrocarpene)、杜松醇、臭根醇(intermedeol)、橙花叔醇、穆罗拉_3，5- 二烯(muurola-3, 5-diene)、姜黄烯和表β -檀香烯。更优选的倍半萜类包括α-檀香烯、广藿香醇、β-檀香烯、朱栾倍半萜、荜澄茄醇、客烯、紫穗槐4，11-二烯，甚至更优选地，所述倍半萜烯是广藿香醇或α-檀香烯。
[0029]优选的双職的例子包括香紫苏醇、赖百当烯二醇(Iabdend1l)和紫杉烯。优选的单萜类的例子包括柠檬烯、菔烯、月桂烯、莰烯、水芹烯、萜品油烯、罗勒烯、里哪醇、桉树脑、香叶醇、萜品烯、葑醇、蒈烯、桧烯。
[0030]可以使用本发明的方法制成的代谢物的另一个例子是1- 丁醇。1- 丁醇被认为是一种可能的汽油替代品，因为它具有更高的能量密度，而它与乙醇相比具有更低的腐蚀性和水溶性。
[0031]可以使用本发明的方法制成的代谢物的另一个例子是聚羟基丁酸酯(PHB)。PHB是商业有趣的可生物降解的生物聚合物家族的成员之一。
[0032]本发明的酵母细胞可以培养于任何类型的适合于这样的酵母物种的生长培养基中。这种培养基在本领域中是公知的且在此不保证更详细的描述，这在任何情况下是不能穷尽的。生长培养基优选还适于用于过度表达上述基因的启动子的类型。例如，如果过表达的基因由葡萄糖调节启动子控制，生长培养基优选包含葡萄糖。
[0033]实施例
[0034]现在通过下列实施例的方式进一步详细说明书本发明。
[0035]实施例1
[0036]酵母菌株和培养某
[0037]将酿酒酵母菌株CEN.PKl 13-1IC (MATa SUC2MAL2-8cura3-52his3-Δ I,由德国University of Frankfurt的P.KiHter友情提供)用作背景菌株。在该研究中使用的所
有酵母菌株总结于表1中。
[0038]
【权利要求】
1.一种通过醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶(ACS)的过表达修饰的酵母细胞，其特征在于醇脱氢酶和乙酰乙酰辅酶A合成酶被进一步过表达。
2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其特征在于编码过氧化物酶体柠檬酸合酶的基因或编码细胞质苹果酸合酶的基因已被从酵母细胞基因组中删除。
3.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其特征在于所述酵母细胞是酿酒酵母细胞。
4.根据权利要求3所述的酵母细胞，其特征在于所述醛脱氢酶是ALD6，醇脱氢酶是ADH2，乙酰乙酰辅酶A合成酶是ERGlO，过氧化物酶体柠檬酸合酶是CIT2且细胞质苹果酸合酶是MLSl。
5.根据前述权利要求中任一项所述的酵母细胞，其特征在于在ACS包含防止酶被乙酰化抑制的点突变。
6.根据权利要求5所述的酵母细胞，其特征在于ACS是来自肠道沙门氏菌的变体L614P。
7.—种制造修饰的酵母细胞的方法，其包含过表达醛脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶(ACS)，其特征在于所述方法进一步包含过表达醇脱氢酶和乙酰乙酰辅酶A合成酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法还包含从酵母细胞基因组中缺失编码过氧化物酶体柠檬酸合酶的基因或编码细胞质苹果酸合酶的基因。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述酵母细胞是酿酒酵母细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述醛脱氢酶是ALD6，醇脱氢酶是ADH2，乙酰乙酰辅酶A合成酶是ERGlO，过氧化物酶体柠檬酸合酶是CIT2且细胞质苹果酸合酶是MLSl。
11.根据权利要求7~10中任一项所述的方法，其特征在于所述ACS如权利要求5或6中所定义。
12.—种用于生产增加水平的衍生自乙酰辅酶A的产物的方法，包含在有利于所述产物的生产的条件下培养权利要求1至6任一项所述的酵母细胞，该细胞能够生产这样的产物。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于该产物衍生自乙酰乙酰辅酶A。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述产物选自于由萜类化合物、1-丁醇和聚羟基丁酸酯组成的组。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述萜类化合物是α-檀香烯。
【文档编号】C12P7/16GK104039973SQ201280066169
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年12月17日 优先权日:2012年1月6日
【发明者】J·尼尔森, V·西韦尔斯, 陈云, L·达维耶, M·沙尔克 申请人:弗门尼舍有限公司