染料的光敏化化学漂白的制作方法
【专利摘要】本发明提供包括使用光敏化化学漂白以在生物样品中检测多靶标的方法。所述方法包括提供包含多靶标的生物样品，使至少一个探针结合存在于样品中的一个或多个靶标，和观测来自探针的信号的步骤。所述方法还包括使包含结合的探针的样品与电子转移试剂接触并照射样品，由此启动通过光敏化化学漂白基本上灭活探针的光反应的步骤。所述方法还包括使至少一个探针结合存在于样品中的一个或多个靶标，并观测来自探针的信号的步骤。结合、观测和漂白的过程可以反复重复。
【专利说明】染料的光敏化化学漂白
[0001] 背景 多种方法可用于生物学和医学中，以观测生物样品中的不同靶标。例如，组织切片和其 它细胞学制品中的蛋白质分析可使用组织化学、免疫组织化学（IHC)或免疫荧光的技术进 行。生物样品的蛋白质分析还可使用固态免疫测定法例如使用蛋白质印迹技术或使用可例 如通过使用流式细胞术进行的基于细胞的测定法进行。
[0002] 许多现有技术一次仅可检测单一样品中的几个靶标（例如IHC或基于荧光的蛋白 质印迹，其中可检测的靶标数量受到基于荧光的检测系统的限制）。靶标的进一步分析可需 要使用来自所述来源的额外生物样品，这限制了测定靶标的相对特征（例如生物样品中多 个生物靶标的存在、不存在、浓度和/或空间分布）的能力。此外，在某些情况下，可能可获 得有限量的样品以供分析之用或所述单个样品可能需要进一步的分析。
[0003] 重复分析单个样品的方法描述于美国专利号7, 629, 125和美国专利号7, 741，046 中。特别地，美国专利号7, 741，046提供检测生物样品中的多靶标的方法，其包括使用氧化 以灭活信号发生器（例如，漂白荧光染料）。氧化反应通过使用氧化剂例如过氧化氢完成。
[0004] 此外，通过使信号发生器连续曝光于照射，即通过光漂白，可灭活信号。类似于通 过氧化的信号灭活，这个过程可能是漫长的，并且可能不进行至完成，导致信噪比减少。此 夕卜，使样品连续曝光于照射可损害生物样品。因此，仍存在用于连续分析生物学靶标的更 快、更温和和更灵敏的方法的需求。
[0005] 简述 本文公开新的用于高通量多路复用样品分析的方法。所述方法采用，例如信号循环过 程，其中在各个循环中，光反应步骤允许相同的信号发生器例如荧光团重复用于随后的循 环中以检测另外的标记物，例如蛋白质。可采用这些方法，例如用于连续地分析生物样品， 以尤其辨别生物样品中多个生物靶标的存在、不存在、浓度和/或空间分布。光反应步骤可 包括应用电子转移试剂，例如硼酸盐，并启动光反应，例如，通过用可见光照射样品，以灭活 信号发生器，例如，荧光染料。
[0006] 在一些实施方案中，所公开方法的优点可包括在各个循环中迅速破坏信号。例如， 在一些例子中，与常规方法中超过15分钟相比，在约20秒内观测到猝灭。在一些实施方 案中，所公开的方法还可表征为甚至在例如导致信噪比增加的高表达靶标中缺乏残留的荧 光。此外，所公开的方法不损害生物样品或其成分，例如，抗原决定部位，以致相同的样品可 以在许多循环中使用。同样，在一些实施方案中，当与荧光染料的直接光漂白作用比较时， 所公开的方法是有利的，因为它们不需要可损害生物样品成分的高功率光。
[0007] 在一些实施方案中，本发明是一种探测生物样品中的多靶标的方法，其包括： (a) 使至少一个探针结合存在于包含多靶标的生物样品中的一个或多个靶标； (b) 观测来自步骤（a)中结合的至少一个探针的信号； (c) 使包含步骤（a)的结合探针的样品与电子转移试剂接触； (d) 照射步骤（c)的样品； (e) 使至少一个探针结合存在于步骤（d)的样品中的一个或多个靶标；和 (f)观测来自步骤（e)的结合探针的信号。
[0008] 在一些实施方案中，步骤（a)中的探针包含光信号发生器，和步骤（b)中观测到的 信号是光信号。在另外的实施方案中，光信号发生器是荧光信号发生器，和在步骤（b)中观 测到的光信号是荧光信号。
[0009] 在一些实施方案中，步骤（a)包括使一个以上的探针结合两个或更多个靶标。
[0010] 在一些实施方案中，照射步骤（d)中的样品在缓冲剂的存在下进行。在一些实施 方案中，照射在pH 5-9下进行。在一些实施方案中，照射在pH 6-8下进行。
[0011] 在一些实施方案中，照射步骤（d)中的样品在4-50°C的温度下进行。在优选的实 施方案中，照射样品在20-30°C的温度下进行。
[0012] 在一些实施方案中，照射步骤（d)中的样品通过使样品暴露于350 nm -1. 3 μΜ 波长的光来完成。在一些实施方案中，照射样品通过使样品暴露于400-700 nm波长的光来 完成。
[0013] 在一些实施方案中，电子转移试剂是硼酸盐。在一些实施方案中，硼酸盐由以下结 构式表示：
【权利要求】
1. 一种探测生物样品中的多靶标的方法，其包括： (a) 使至少一个探针结合存在于包含多靶标的生物样品中的一个或多个靶标； (b) 观测来自步骤（a)中结合的至少一个探针的信号； (c) 使包含步骤（a)的结合探针的样品与电子转移试剂接触； (d) 照射步骤（c)的样品； (e) 使至少一个探针结合存在于步骤（d)的样品中的一个或多个靶标；和 (f) 观测来自步骤（e)中结合的探针的信号。
2. 权利要求1的方法，其中步骤（a)的探针包含光信号发生器，和步骤（b)中观测到的 信号是光信号。
3. 权利要求2的方法，其中步骤（a)的探针包含荧光信号发生器，和步骤（b)中观测到 的信号是突光信号。
4. 权利要求1的方法，其中步骤（d)中照射样品在pH 5-9的缓冲剂的存在下进行。
5. 权利要求1的方法，其中步骤（c)和（d)在4-50°C的温度下进行。
6. 权利要求1的方法，其中步骤（d)中照射样品通过使样品暴露于350 nm - 1.3 μΜ 波长的光而完成。
7. 权利要求6的方法，其中步骤（d)中照射样品通过使样品暴露于400-700 nm波长的 光而完成。
8. 权利要求1的方法，其中电子转移试剂是由以下结构式表示的硼酸盐：
其中： Ri、R2和R3各自独立地是烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基，其中所述烷基、烯基、炔基、 芳基或杂芳基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：(C1_C4)烷基、（C1-C4)烷氧 基、（C1-C4)烷基氨基、氨基、羟基、氰基、卤素或硝基， R4是烷基、烯基或炔基，其中所述烷基、烯基或炔基任选地被一个或多个选自以下的取 代基取代：(C1_C4)烷基、（C1-C4)烷氧基、（C1-C4)烷基氨基、氨基、羟基、氰基、卤素或硝 基，和 M+选自有机和无机阳离子。
9. 权利要求8的方法，其中Ri、R2和R3各自是任选取代的芳基和R4是任选取代的烷基。
10. 权利要求9的方法，其中Ri、R2和R3各自为未取代的苯基和R4为未取代的丁基，和 硼酸盐为三苯基丁基硼酸盐。
11. 权利要求8的方法，其中M+是选自Li+、Na+或K+的无机阳离子。
12. 权利要求3的方法，其中荧光信号发生器包含花青染料。
13. 权利要求12的方法，其中花青染料是Cy3或Cy5。
14. 权利要求1的方法，其中步骤（c)-(f)重复一次或多次。
15. 权利要求1的方法，其中步骤（c)和（d)进行约20秒至约15分钟。
16. 权利要求1的方法，其还包括测量在观测步骤（b)、步骤（f)或步骤（b)和（f)中 观测到的信号的一个或多个强度值。
17. 权利要求16的方法，其还包括使强度值与存在于样品中的靶标的数量相关。
18. 权利要求1的方法，其中步骤（a)的探针和步骤（e)的探针各自包含信号发生器， 其中步骤（a)中的信号发生器不同于步骤（e)中的信号发生器。
19. 一种探测生物样品中的多靶标的方法，其包括： (a) 使多个探针结合存在于生物样品中的多靶标，其中多个探针包括第一组探针和第 二组探针； (b) 观测来自步骤（a)中结合的第一组探针的第一组信号； (c) 使包含步骤（a)的结合探针的样品与电子转移试剂接触； (d) 照射步骤（c)的样品； (e) 自步骤（a)中结合的第二组探针生成第二组信号； (f) 观测第二组信号。
20. 权利要求1的方法，其中步骤（d)中样品的照射启动通过光敏化化学漂白基本上灭 活信号发生器的光反应。
21. 权利要求1的方法，其中信号发生器被不可逆地改变。
22. 权利要求1的方法，其中在步骤（d)之后未观测到可检测的信号。
23. -种高通量多路复用生物样品分析方法，该方法包括： 信号循环过程，其中在各个循环中，染色和成像之后是应用电子转移试剂和照射生物 样品。
24. 权利要求23的方法，其中所述方法允许快速信号循环而不显著改变不同于探针的 生物样品的成分。
25. -系列描绘光学标记的生物靶标的至少两个图像，其中： 在探测生物样品的多靶标的过程中获得图像，其中所述过程包括： (a) 使至少一个光学探针与存在于包含多靶标的生物样品中的一个或多个靶标结 合； (b) 观测来自步骤（a)中结合的光学探针的信号； (c) 使包含步骤（a)的结合的光学探针的样品与电子转移试剂接触； (d) 照射步骤（c)的样品； (e) 使至少一个光学探针与存在于步骤（d)的样品中的一个或多个靶标结合；和 (f) 观测来自步骤（e)中结合的光学探针的信号。
【文档编号】C12Q1/48GK104114713SQ201280070449
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年12月3日 优先权日:2011年12月23日
【发明者】A.纳塔拉简, A.苏德, L.S.卡努马勒, 陈国邦 申请人:通用电气公司