通过三维培养重新编程细胞的制作方法
【专利摘要】本申请提供了在允许形成三维细胞聚集体的条件下通过培养细胞使所述细胞重新编程的方法。本申请还涉及使用所述方法获得的细胞和细胞聚集体。
【专利说明】通过三维培养重新编程细胞
[0001] 发明背景
[0002] 干细胞的特征在于其具有增殖能力，同时保持形成特定细胞类型的潜能和分化能 力。这种特征也被称为干性，其赋予了干细胞在科研和治疗应用方面广阔的前景。细胞干性 受到了广泛关注，特别是如何重新编程体细胞以获得干性。Yamanaka等此前的工作表明，通 过强制过表达关键转录因子，能够由体细胞产生万能干细胞（pluripotent stem cells), 从而建立了一种操纵干性的新方法（Takahashi和Yamanaka, 2006)。从那时起，已大力致力 于设计更加安全和更加有效的用于诱导性万能干细胞（iPS)的方法，如利用蛋白（Kim等， 20〇9 ;Zhou 等，2〇〇9)、RNA (Warren 等）、microRNA (Anokye-Danso 等）或特定的化学品（Shi 等，2008 ;Zhu等）。尽管已证实这些方法在操纵所述细胞的干性方面是有效的，但是其效率 和风险控制仍有待改进。因此，仍需寻找重新编程细胞的替代方法。
[0003] 发明概沭
[0004] 本申请的一个方面涉及将细胞重新编程的方法，所述方法包括在允许形成三维 (3D)细胞聚集体的条件下培养所述细胞，其中所述细胞被诱导进行重新编程。
[0005] 在某些实施方式中，在低粘附基质上培养所述细胞，以形成三维细胞聚集体。在某 些实施方式中，所述低粘附基质包括亲水性的和电中性的水凝胶层。在某些实施方式中，所 述低粘附基质包括疏水性表面。
[0006] 在某些实施方式中，在悬挂在支持材料上的培养基液滴中悬浮培养所述细胞，以 使得形成三维细胞聚集体。
[0007] 在某些实施方式中，所述三维细胞聚集体是多细胞和多层细胞聚集体。在某些实 施方式中，所述三维细胞聚集体具有球样形状。
[0008] 在某些实施方式中，所述细胞被重新编程以上调一种或多种干细胞标记物。在某 些实施方式中，所述细胞被重新编程以上调一种或多种转分化标记物。
[0009] 在某些实施方式中，所述方法还包括向所述培养物中引入诱导剂。在某些实施方 式中，所述诱导剂是能够诱导细胞重新编程的蛋白。在某些实施方式中，所述诱导剂是编码 蛋白的核酸，所述蛋白能够诱导细胞重新编程。在某些实施方式中，所述诱导剂是能够诱导 细胞重新编程的化合物。
[0010] 本申请的另一个方面涉及使用本申请中提供的任意方法获得的重新编程细胞。
[0011] 本申请的另一个方面涉及使用本申请中提供的任意方法获得的重新编程三维细 胞聚集体。
[0012] 本申请的另一个方面涉及用于将细胞重新编程的试剂盒，所述试剂盒含有低粘附 基质和，任选地，培养基。
[0013] 附图简沭
[0014] 图I :RT4细胞的3D球体的形成导致干细胞标记物的表达：
[0015] A.在单层（左图）和球体培养物（右图）中RT4细胞的相差图像。比例尺= 200 u m。
[0016] B.在单层和球体培养物中的RT4细胞干细胞标记基因的定量PCR(Q-PCR)分析结 果。
[0017] C.在单层和7天球体培养物中的RT4细胞NANOG和S0X2表达情况的Western印 迹结果。使用畸胎瘤细胞系PA-I作为阳性对照。
[0018] 图2 :RT4细胞的3D球体的形成产生具有癌干细胞特征的细胞。
[0019] A.在单层（左图）和7天球体培养物（右图）中迁移细胞的定量分析结果。
[0020] B在单层和7天球体培养物中的RT4细胞上皮间质转化（EMT)相关基因的Q-PCR 分析结果。
[0021] C. RT4细胞的裸鼠肿瘤形成试验结果汇总表。单层表示单层培养物经胰酶消化的 RT4细胞；球体表示球体经胰酶消化的RT4细胞。
[0022] 图3 :在3D球体中培养的人胚肾（HEK293)细胞部分获得了胚胎干细胞的表型。
[0023] A.在单层（左图）和球体培养物（右图）中HEK293细胞的相差图像。比例尺= 200 u m。
[0024] B.在单层和球体培养物中的HEK293细胞干细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
[0025] C.在单层和10天球体培养物中的HEK293细胞NANOG和S0X2表达情况的Western 印迹结果。
[0026] D.表示在单层HEK293和球体HEK293细胞中的0CT4、NAN0G和S0X2/0CT4转录活 性的荧光素酶试验（n = 3)。载体表示对照荧光素酶报告子。（M)表示单层HEK293细胞并 且（S)表示10天球体HEK293细胞。
[0027] E.在单层（图中的上部分）和10天球体培养物（图中的下部分）中的HEK293细 胞的0CT4、NAN0G和S0X2的转录调控区的亚硫酸氢盐基因组测序。将起始位点设定为+1。 空心圆表示未被甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG)，而实心圆表示甲基化的CpG。
[0028] F.在单层和球体培养物中的HEK293细胞胚胎干（ES)细胞标记基因的Q-PCR分析 结果。
[0029] G.在单层和10天球体培养物中的HEK293细胞内胚层、中胚层和外胚层标记基因 的Q-PCR分析结果。
[0030] H.在单层（左图）和10天球体培养物（右图）中的HEK293细胞的碱性磷酸酶 (AP)染色结果。
[0031] I. HEK293细胞的裸鼠肿瘤形成试验结果汇总表。"A^示胰酶消化的在单层培养 物中的HEK293细胞；"B"表示胰酶消化的HEK293细胞球；"C"表示未经胰酶消化的HEK293 球。
[0032] 图4 :在后肾间质和完全分化的肾单位中表达的基因的Q-PCR分析结果。
[0033] A?肾单位的示意图。
[0034] B-F.在单层、5天球体培养物和10天球体培养物中的在后肾间质（B)、肾小球（足 细胞）（C)、近曲小管（D)、亨勒襻（Henle' s loop) (E)、远曲小管和集合管（F)中表达的基 因的Q-PCR分析结果。
[0035] 图5 :小鼠胚胎成纤维（MEF)细胞的3D球体的形成导致部分胚胎干细胞表型。
[0036] A.在单层（左图）和球体培养物（右图）中MEF细胞的相差图像。比例尺= 200 u m。
[0037] B.在单层和7天球体培养物中的MEF细胞干细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
[0038] C.在单层和12天球体培养物中的MEF细胞干细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
[0039] D.在单层和7天球体培养物中的MEF细胞Sox2表达情况的Western印迹分析结 果。
[0040] E.在单层（左图）和7天球体培养物（右图）中的MEF细胞的碱性磷酸酶染色结 果。
[0041] 图6 :MEF细胞的3D球体形成导致神经球的表型。
[0042] A.在单层和7天球体培养物中的MEF细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
[0043] B.在单层和12天球体培养物中的MEF细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
[0044] C.在单层和球体培养物中的MEF细胞Tuj 1和Gfap表达情况的Western印迹。使 用小鼠神经球作为阳性对照。
[0045] D-H.在单层MEF和来源于7天球体的粘附MEF中Tujl(D)、神经丝蛋白（E)、 SlOO (F)、Gfap (G)和GABA01)阳性的细胞百分率。
[0046] I.由丁基化的羟基苯甲醚（BHA)进行神经源性分化后的MEF标记基因的Q-PCR分 析结果。
[0047] 图7 :GFP和神经元标记物在体内均为阳性的移植MEF的百分率。
[0048] A-E. GFP和神经元标记物在体内均为阳性的移植MEF的百分率，神经元标记物包 括 Tu j I (A)、GFAP (B)、SlOO (C)、NeuN (D)或 MAP2 (E)。
[0049] 图8 :小鼠尾尖成纤维（TTF)细胞的3D球体的形成导致出现神经细胞。
[0050] A.在单层（左图）和球体培养物（右图）中的TTF的相差图像。比例尺=200 ii m。
[0051] B.在单层和7天球体培养物中的TTF Sox2表达情况的Western印迹分析结果。
[0052] C.在单层和7天球体培养物中的TTF标记基因的Q-PCR分析结果。
[0053] D-E.单层TTF和来源于7天球体的粘附TTF中Tujl⑶和SlOO (E)阳性的细胞百 分率。
[0054] 图9 :MCF_7细胞的3D球体的形成导致干细胞标记物的上调。
[0055] A.在单层（左图）和球体培养物（右图）中的MCF-7细胞的相差图像。
[0056] B.在单层和球体培养物中的MCF-7细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
[0057] 图10 :大鼠成骨细胞的3D球体的形成导致一些干细胞标记物的上调。
[0058] A.在单层（左图）和球体培养物（右图）中的大鼠成骨细胞的相差图像。
[0059] B.在单层和球体培养物中的大鼠成骨细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
[0060] 图11 :鼠神经元干细胞的3D球体的形成导致干细胞标记物的上调。
[0061] A.在单层（左图）和球体培养基（右图）中的大鼠神经元干细胞的相差图像。
[0062] B.在单层和球体培养物中的大鼠神经元干细胞标记基因的Q-PCR分析结果。
[0063] 图12A-J :-些干细胞标记物的示例性蛋白序列。
[0064] 图13A-R :-些转分化标记物的示例性蛋白序列。
[0065] 发明详沭
[0066] 本申请提供了在允许形成三维细胞聚集体和诱导所述细胞进行重新编程的条件 下重新编程细胞的方法。本申请还提供了使用本申请所述的方法重新编程的细胞。本申请 还提供了用于使用本申请所述的方法重新编程细胞的组合物和试剂盒。
[0067] 本申请的一个方面涉及重新编程细胞的方法，所述方法包括在允许形成三维细胞 聚集体的条件下培养所述细胞，其中所述细胞被诱导进行重新编程。
[0068] 在本申请中使用的术语"重新编程（reprogram) "或"重新编程（reprogramming) " 指诱导分化细胞以产生一个或多个干细胞特征的过程。
[0069] 分化细胞是一种细胞，其致力于成为或已经成为特化细胞，并显示出这种特化细 胞的一种或多种生物学或功能特征。分化细胞可以部分分化，其中所述细胞没有完成成为 特化细胞的过程并且不含有所述特化细胞的全部特征。部分分化细胞还可以包括在还原至 非特化细胞过程中的并且已经丧失了所述特化细胞的某些特征的特化细胞。分化细胞可以 是终末分化的，其中所述细胞已完成成为特化细胞的过程并且含有所述特化细胞的全部特 征。本申请所使用的术语"分化细胞"包括部分分化细胞和/或终末分化细胞。
[0070] 干细胞是具有能分化成各种特化细胞类型潜能的细胞。干细胞可以是万能性的 (pluripotent)，即能够分化成大多数类型的特化细胞，如胚胎干细胞。干细胞可以是多能 性的（multipotent)，即能够分化成某些类型的特化细胞，如骨髓干细胞或造血干细胞。干 细胞可以是单能性的（unipotent)，即能够分化成特定类型的特化细胞。干细胞可以是全能 性的（totipotent)，即受精卵。本申请所使用的术语"干细胞"包括具有上述各种潜能水平 的任意和全部类型的干细胞。
[0071] 本申请的方法可以用于重新编程任意细胞，所述细胞在允许形成三维细胞聚集体 的培养条件下能够被诱导以显示出一种或多种干细胞的生物学和/或功能性特征。在某 些实施方式中，本申请的待重新编程的细胞为贴壁细胞。贴壁细胞是为了在体外生长需要 粘附于固体基质的细胞（参见 John M. Davis, Animal Cell Culture:Essential Methods. (动物细胞培养：基本方法），John Wiley&Sons 2011年出版，4. 2章；Jennie P. Mather等， Introduction to Cell and Tissue Culture:Theory and Technique(细胞和组织培养介 绍：理论和技术），Springer出版，1998, p. 64-65)。在悬浮培养基中，贴壁细胞不能生长或 存活，或者生长或存活较差。贴壁细胞通常来源于实体组织和器官。贴壁细胞的例子包括 但不限于：内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和成纤维细胞。
[0072] 在某些实施方式中，贴壁细胞在悬浮培养基中的存活率低于15%。在某些实施方 式中，贴壁细胞在悬浮培养基中的存活率低于10%。在某些实施方式中，贴壁细胞在悬浮 培养基中的存活率低于5 %。在某些实施方式中，贴壁细胞在悬浮培养基中的存活率低于 1%。细胞存活率根据在细胞培养基中的活细胞数占细胞总数的百分率计算。可以采用公 知的方法测量细胞活力，如碘化丙啶染色。
[0073] 在某些实施方式中，待通过本申请的方法进行重新编程的本申请的细胞是体细 胞。体细胞的例子包括但不限于成纤维细胞（例如小鼠胚胎成纤维细胞（MEF)、小鼠尾尖 成纤维（TTF)细胞和人成纤维细胞样滑膜细胞（HFL))、膀胱细胞（例如人膀胱乳头状瘤 (RT4)细胞）、幼仓鼠肾（BHK21)细胞、卵巢细胞（例如中国仓鼠卵巢（CH0-K1)细胞）、宫颈 细胞（例如HeLa细胞）、肌细胞、胚胎细胞（例如人胚胎肾（HEK) 293细胞、NIH3T3细胞）、 肺细胞（例如人胎肺成纤维（MRC-5)细胞、MRC-9细胞）、肝细胞（例如H印G2细胞）、上 皮细胞（例如WPE干细胞）、内皮细胞（例如HUV-EC-C细胞）、脑细胞（例如T98G细胞）、 骨细胞（例如KH0S-240S细胞）。在某些实施方式中，所述体细胞是非癌细胞。
[0074] 在某些实施方式中，所述体细胞是癌细胞如乳腺癌细胞（例如MCF-7细胞、 MDA-MB-231细胞、MDA-MB-435细胞或SK-BR-3细胞）、结肠癌细胞（例如DLD-1细胞、HCT-15 细胞、T84细胞、HCT-8细胞）、肾癌细胞（例如A-498细胞、769-P细胞、G401细胞）、肺癌细 胞（例如NCI-H2126细胞、DMS 79细胞、A549细胞）、肝癌细胞（例如H印G2细胞）、宫颈 癌细胞（例如HeLa细胞）、神经胶质瘤细胞（例如M059K细胞、LN-18细胞）、神经元细胞 (例如大鼠嗜铬细胞瘤（PC12)细胞、人神经母细胞瘤（SH-SY5Y)细胞、前列腺癌细胞（例如 DU145细胞、LNCaP细胞）和骨肉瘤细胞（例如KHOS/NP细胞）。
[0075] 在某些实施方式中，通过本申请所述的方法将部分分化的所述细胞诱导进行重新 编程。在某些实施方式中，通过本申请所述的方法将干细胞诱导进行重新编程。
[0076] 在某些实施方式中，本申请提供了一种重新编程细胞的方法，所述方法包括在允 许形成三维细胞聚集体的条件下在体外培养所述细胞，其中所述细胞被诱导进行重新编 程。在某些实施方式中，所述培养条件是低粘附条件。低粘附条件指所述细胞不粘附于固 体基质或者所述细胞在所述固体基质上的粘附降低或被抑制的培养环境。在某些实施方式 中，当与常规粘附条件相比时，在低粘附条件下，细胞在基质上的粘附降低至少 50%、60%、70%、80%或90%。可以由市售的细胞培养瓶提供常规粘附条件，例如康宁细胞 培养皿（例如目录号430589康亇?未经处理的细胞培养皿（纽约，US)或目录号3353002 猎鹰?细胞培养皿（纽约，美国）或目录号715001 NEST细胞培养皿（无锡，中国））。
[0077] 在某些实施方式中，所述低粘附条件由低粘附基质提供，所述低粘附基质减少或 抑制细胞粘附于其表面（参见John M. Davis，同上）。在某些实施方式中，所述低粘附基质 包括使用减少或抑制细胞粘附的材料包被的细胞培养容器（例如皿、板、圆底管或瓶）。在 某些实施方式中，这种材料含有亲水性的和电中性的水凝胶层。本申请所使用的"水凝胶" 指由一定量的水构成的半固体组合物，并且其中溶解或分散有聚合物或混合物。在某些实 施方式中，所述水凝胶由聚苯乙烯制成。在某些实施方式中，所述聚苯乙烯选自以下组：聚 苯乙烯-嵌段-聚（N-异丙基丙烯酰胺）_嵌段-聚苯乙烯、聚（苯乙烯-共-马来酸酐） (SMA)、聚（苯乙烯-二乙烯基苯）（P(ST-DVB))、聚（苯乙烯磺酸）（PSSA)、聚（甲基丙烯 酸缩水甘油酯-共-a -甲基苯乙烯）、聚苯胺-聚（苯乙烯磺酸酯）（Pan-PSS)、聚（苯乙 烯-嵌段_(甲氧基二甘醇丙烯酸酯）_嵌段-苯乙烯）和聚（4-苯乙烯磺酸酯钠）。
[0078] 在某些实施方式中，所述水凝胶由琼脂、琼脂糖制成。在某些实施方式中，所述低 粘附基质包被浓度范围为〇. 2至5. 0 %的琼脂糖。在某些实施方式中，所述低粘附基质包被 浓度范围为1-5%的琼脂。
[0079] 在某些实施方式中，所述水凝胶由聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）制成。在某些实 施方式中，所述低粘附基质使用浓度范围为40-50%的聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）包被。
[0080] 在某些实施方式中，所述低粘附基质上包被有水凝胶与培养基的混合物（例如杜 尔贝科改良的伊格尔培养基（DMEM)或McCoy ' 5A培养基）。
[0081] 在某些实施方式中，减少或抑制细胞粘附的所述材料能够调节靶细胞的细胞外蛋 白的功能，从而减少所述细胞与所述基质的粘附。所述细胞外蛋白抑制剂的例子包括但不 限于蛋白聚糖（参见例如 Yamagata, M?等，Journal of Biological Chemistry, 264(14):8 012-8018, 1989)，氢化可的松或放线菌酮结合的肝素、L-氮杂环丁烷-2-羧酸、胰酶和乙二 胺四乙酸（EDTA)、分散酶、葡聚糖、聚环氧乙烷、合成肽如甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨 酸-丝氨酸-脯氨酸，甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（参见例如Whalen, G. F?等，Ann. Surg.，210 (6) : 758-764, 1989)。
[0082] 在某些实施方式中，将减少或抑制细胞粘附的材料包被于所述低粘附基质的表面 上作为层或薄膜或膜。在某些实施方式中，将减少或抑制细胞粘附的材料包埋于所述基质 中。
[0083] 在某些实施方式中，所述低粘附基质包含疏水性表面。在某些实施方式中，疏水性 表面由具有疏水性组分的聚合物和共聚物薄膜形成。在某些实施方式中，所述疏水性表面 由聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA)、聚（环氧乙烷）_聚（甲基丙烯酸甲酯）（PE0-PMMA)、聚二 甲基硅氧烷（PDMS)、全氟聚醚（PFPE)、聚偏二氟乙烯（PVDF)、聚四氟乙烯（PTFE)、聚苯乙烯 (PS)形成。
[0084] 任意适宜的培养基均可以用于本申请的方法中。常用培养基的例子包括但不限于 DMEM ( Gibco? )、RPMI 1640 ( Gibco? )、McCoy' s 5A(Hyclone，Thermo Scientific)和 DMEM/ 营养混合物 F-12 (DMEM/F12, GibcaKO。
[0085] 在另一个方面，在悬挂在支持材料如皮氏培养皿（petri dish)底部和滚瓶壁上的 培养基液滴中悬浮培养所述细胞。在某些实施方式中，所述培养基液滴的体积不超过lml、 2ml、3ml、4ml或5ml。在某些实施方式中，所述培养基的液滴悬挂于倒置的培养容器如皮氏 培养皿的底部。
[0086] 在某些实施方式中，所述细胞在旋转或振荡或静止状态下培养。
[0087] 在某些实施方式中，所述重新编程细胞的方法包括在缺乏以悬浮、飘浮或其他方 式处于培养基中的任何支持基质或结构的条件下培养所述细胞。
[0088] 本申请所使用的术语"三维细胞聚集体"指生长成三维（3D)形状而不是细胞单层 的细胞。三维细胞聚集体可以在二维、三维或多维基质中生长。在某些实施方式中，本发明 的三维细胞聚集体是多细胞和多层细胞聚集体。在某些实施方式中，本发明的三维细胞聚 集体是球样形状的。在某些实施方式中，本发明球样形状的细胞聚集体能够维持稳定的形 态若干周。在某些实施方式中，所述三维细胞聚集体的直径为至少10 U m、15 ii m或20 ii m。 [0089] 在某些实施方式中，重新编程所述细胞以上调一种或多种干细胞标记物。所述干 细胞标记物是干细胞特有的基因和蛋白。在本申请所述的方法中使用的干细胞标记物的例 子包括但不限于 0ct4、Nanog、Sox2、Klf4、c_Myc、Lin28、Rexl、Tdgfl、Leftb、Ebaf、Grb7、 Podxl、Nodal、Fgf4、Nest in、Gdf3、Daxl、Natl、Esgl、Slc2a3、Soxl、01 ig2 和 Pax6。这些干 细胞标记物（核苷酸和蛋白）的NCBI (美国国家生物技术信息中心）参考编号如下表I所 示。示例性的蛋白序列也在图12A-J中显示。
[0090] 表 1
[0091]
【权利要求】
1. 一种将细胞重新编程的方法，所述方法包括： 在允许形成三维细胞聚集体的条件下培养所述细胞，其中所述细胞被诱导进行重新编 程。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中在低粘附基质上培养所述细胞。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述低粘附基质包括可降低细胞粘附的材料。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述材料包括亲水性的和电中性的水凝胶层。
5. 根据权利要求3所述的方法，其中所述材料选自以下组：琼脂、琼脂糖和聚（甲基丙 烯酸-2-羟基乙酯）。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述琼脂糖的浓度范围为0. 2至5. 0%。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述琼脂糖与培养基混合。
8. 根据权利要求3所述的方法，其中所述材料包被于所述低粘附基质的表面上。
9. 根据权利要求3所述的方法，其中所述材料包括聚苯乙烯。
10. 根据权利要求2所述的方法，其中所述低粘附基质包括疏水性表面。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中在悬挂于支持材料上的培养基液滴中悬浮培养 所述细胞。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述液滴的体积不超过lml。
13. 根据权利要求11所述的方法，其中所述培养基液滴悬挂于倒置的培养容器的底 部。
14. 根据权利要求1-13任意一项所述的方法，其中在旋转、振荡或静止状态下培养所 述细胞。
15. 根据权利要求1-14任意一项所述的方法，其中在缺乏任何支持材料的培养基中培 养所述细胞。
16. 根据权利要求1-15任意一项所述的方法，其中所述细胞是体细胞。
17. 根据权利要求1-15任意一项所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
18. 根据权利要求1-15任意一项所述的方法，其中所述细胞选自以下组：HEK293细胞、 成纤维细胞和癌细胞。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述成纤维细胞是小鼠胚胎成纤维细胞或尾尖 成纤维细胞。
20. 根据权利要求1-19任意一项所述的方法，其中所述三维细胞聚集体是多细胞和多 层细胞聚集体。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述三维细胞聚集体具有球样形状。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述三维细胞聚集体的直径至少为lOum。
23. 根据权利要求1-22任意一项所述的方法，其中所述细胞被重新编程以上调一种或 多种干细胞标记物。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述干细胞标记物选自以下组：0ct4、Nanog、 Sox2、Klf4、c_Myc、Lin28、Rexl、Tdgfl、Leftb、Ebaf、Grb7、Podxl、Nodal、Fgf4、Nestin、 Gdf3、Daxl、Slc2a3、Soxl、01ig2 和 Pax6。
25. 根据权利要求1-22任意一项所述的方法，其中所述细胞被重新编程以上调一种或 多种转分化标记物。
26. 根据权利要求1-25任意一项所述的方法，所述方法还包括向所述培养物中引入诱 导剂。
27. 根据权利要求23所述的方法，其中所述诱导剂是能够诱导细胞重新编程的蛋白。
28. 根据权利要求23所述的方法，其中所述诱导剂是编码蛋白的核酸，所述蛋白能够 诱导细胞重新编程。
29. 根据权利要求23所述的方法，其中所述诱导剂是能够诱导细胞重新编程的化合 物。
30. 根据权利要求1所述的方法，其中在体外培养所述细胞。
31. -种使用权利要求1-30任意一项所述的方法获得的重新编程的细胞。
32. -种使用权利要求1-30任意一项所述的方法获得的重新编程的三维细胞聚集体。
33. -种用于将细胞重新编程的试剂盒，所述试剂盒包括低粘附基质和培养基。
34. 根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述材料是琼脂、琼脂糖或聚（甲基丙烯 酸-2-羟基乙酯）。
【文档编号】C12N5/02GK104334718SQ201280072949
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2012年3月13日 优先权日:2012年3月13日
【发明者】苏冠男, 赵燕南, 魏建树, 陈冰, 肖志峰, 戴建武 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所