人细胞色素p450 3a5酶及nadph-细胞色素p450氧化还原酶共表达体系的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，具体涉及一种人细胞色素P450?3A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系，其包括宿主酵母，以及定向插入P450氧化还原酶基因和人源P450?3A5基因的双表达载体。本发明所构建的人细胞色素P450?3A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系可在酵母中异源表达，此外，还可解决酵母细胞P450氧化还原酶表达水平较低的缺陷，能够保证被转染的细胞同时表达两种蛋白，可大量制备代谢物。
【专利说明】人细胞色素P450 3A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及利用基因工程的方法以酵母为宿主异源共表达人细胞色素P450 3A5酶和细胞色素P450氧化还原酶，以及用人细胞色素P450 3A5酶代谢咪达唑仑制备产物1-羟基咪达唑仑的方法。
【背景技术】
[0002]细胞色素P450酶是重要的药物代谢I相酶，市场上80%以上的药物是通过细胞色素P450酶代谢的。3A亚家族是细胞色素P450基因家庭的主要成员，主要包括3A4、3A5及3A7几个成员。细胞色素P4503A5酶能够代谢多种药物如咪达唑仑(Midazolam)、硝苯地平(Nifedipine)及睾丸激素、孕酮等。
[0003]传统的药物代谢研究以动物体内实验为主。近几年来，药物前期代谢研究进入到体外代谢的研究阶段:即利用重组CYP450基因在异源表达系统中进行表达，建立起体外筛选体系，进行体外代谢数据和性质到体内代谢数据和性质的预测，使现代新药研发具有了高通量、高效率、高准确性的特点。利用构建好的CYP药物体外筛选系统通过测定药物代谢的动力学参数及其产物性质，预测CYP450酶的体内代谢水平，这是目前欧美各国在进行新药申报时必须进行的一项研究。
[0004]此外，由于代谢活性定量测定时需要大量使用代谢物标准品，而标准品现在主要用化学方法合成，不仅反应条件复杂，而且中间产物的分离非常困难。而生物酶具有高度的特异性及较高的产量，因此，利用分子生物学构建的外源基因表达体系来大量制备代谢物具有重要价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于构建一种人细胞色素P450 3A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系以及其构建方法。
[0006]本发明的另一个目的是利用在酵母中表达的人细胞色素P4503A5酶代谢药物咪达唑仑来制备代谢产物1-羟基咪达唑仑。
[0007]本发明通过以下方式达到以上目的:
[0008]一种人细胞色素P450 3A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系，其包括宿主酵母，以及定向插入P450氧化还原酶基因和人源P4503A5基因的酵母表达载体。
[0009]所述的宿主酵母为毕赤酵母。
[0010]本发明还提供了一种构建所述人细胞色素P4503A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系的方法，包括以下步骤:
[0011](I)用XbaI酶切质粒PBS-2A，分别回收3.0kb PBS骨架片段和130bp的2A连接肽片段，将3.0kb骨架片段去磷酸化处理，重新连接选择反向克隆即载体pBS-2A(_)；
[0012] (2)将NADPH-细胞色素P450氧化还原酶基因POR定向插入所述载体pBS_2A(_)的BglII及Not I酶切位点之间，获得载体PBS-2A-P0R ；
[0013](3)将人细胞色素P4503A5酶基因定向插入所述载体pBS-2A-P0R的BamH I及XbaI酶切位点之间，获得载体pBS-CYP3A5-2A-P0R ；
[0014](4)用 BamH I 和 Not I 双酶切 pBS-CYP3A5-2A_P0R，将 CYP3A5-2A-P0R 片段定向插入到已经用BamH I和Not I双酶切处理过的酵母表达载体pPIC3.5K中，获得双表达载体 pPIC-CYP3A5-2A-P0R ；
[0015](5)在酵母细胞中表述上述双表达载体。
[0016]本发明还提供了利用所述人细胞色素P4503A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系代谢药物咪达唑仑来制备代谢产物1-羟基咪达唑仑的方法。
[0017]该方法中，利用电转染的方式将所述人细胞色素P4503A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系转染到宿主酵母细胞中，诱导人细胞色素P4503A5酶大量表达后将溶解的咪达唑仑加入细胞中，终浓度为100 μ M ;在加入咪达唑仑48h后，800g离心10分钟，弃去细胞碎处，保留上清；从而制备HPLC纯化咪达唑仑被人源P4503A5代谢的主要产物:1_羟基咪达唑仑。
[0018]所述的宿主酵母优选为毕赤酵母。
[0019]本发明的有益效果在于，本发明所构建的人细胞色素P4503A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系可在酵母中异源表达。此外，本发明中将人源P4503A5酶及其氧化还原酶基因插入同一个表达载体。这一载体用于制备代谢物的优点首先在于解决了酵母细胞P450氧化还原酶表达水平较低的缺陷，其次在于能够保证被转染的细胞同时表达两种蛋白。而现有技术中，当使用两个不同的表达载体分别携带两个基因时，某些被转染的细胞可能只表达其中一种蛋白，因而代谢活性很低甚至没有活性，最终导致代谢物的产量较低。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1 是 CYPOR 的 PCR 结果(两端带 BglII 和 Not I )，其中，Lanel: CYPOR PCR ；Lane2:1Kb Marker。
[0021]图 2 是 CYPOR 连接 pMD-19T simple 的 PCR 结果，其中，Lane 1-6: OR-PMD19Tsimple6 个克隆；Lane7:1Kb Marker。
[0022]图3 是 CYP0R-19T simple 和 PBS-2A (-) BglII 和 Not I 双酶切的鉴定结果，其中，Lanel:CYP0R-19T simple 用 BglII 和 Not I 双酶切；Lane2:pBS_2A (-)用 BglII 和Not I 双酶切；Lane3:IKb Marker。
[0023]图4是POR连接PBS-2A (-)Bglll和Not I双酶切的鉴定结果，其中，Lanel:1KbMarker ;Lane2_8:P0R 连接 pBS_2A (-)用 BglII 和 Not I 处理。
[0024]图5 是 CYP3A5 的 PCR 结果(两端带 BamH I 和 Xba I )，其中，Lanel:CYP3A5PCR ；Lane2:IKb Marker。
[0025]图6是3A5-pMD19T simple用BamHI和Xba I双酶切的鉴定结果，其中，Lanel:IKb Marker ;Lane2_6:CYP3A5_19T simple5 个克隆用 BamH I 和 Xba I 处理
[0026]图7 是 CYP3A5 - pMD19T simple 和 CYP0R-PBS-2A (-)用 BamH I 和 Xba I 双酶切处理的鉴定结果，其中 ，Lanel:CYP3A5_19T simple 双酶切处理；Lane2:CYP0RPBS-2A (-)双酶切处理；Lane3:1Kb Marker。
[0027]图8是CYP3A5-P0R-PBS-2A(_)用BamH I和Xba I双酶切处理的鉴定结果，其中，Lane 1-8:8 个克隆 BamH I 和 Xba I 双酶切处理；Lane9:1Kb Marker。
[0028]图9 是 CYP3A5 - 0R_PBS2A(_)和 pPIC3.5k 用 BamH I 和 Not I 双酶切的鉴定结果，其中，Lanel:1Kb Marker ；Lane2:CYP3A5-P0R-PBS2A (-)用 BamH I 和 Not I 双切；Lane3:pPIC3.5k 载体 BamH I 和 Not I 双切。
[0029]图10是野生型GS115及7个克隆的PCR鉴定结果(通用引物A0X1)，其中，Lanel:IKb DNA Marker ；Lane2:空白对照(不加模板)；Lane3:野生型GS115PCR结果(出现2.1kb条带)；Lane5:阳性克隆I (出现3.Skb左右目的基因以及2.1kb左右条带)；LanelO:阳性克隆2 ;Lane4，6，7，8，9:未知克隆。
[0030]图11 是 pPIC3.5k-CYP3A5-2A-0R 用 BamH I 和 Not I 双酶切鉴定结果，其中，Lanel:IKb Marker ;Lane2_3:2 个克隆双酶切结果。
[0031]图12 是阳性克隆超声破碎 SDS-PAGE 结果，其中，Lanel =Protein Marker ；Lane2:野生型 GSl 15 ；Lane3—7:诱导 Oh，24h，48h，72h，96h。
[0032]图13 是 Western Blotting 结果，其中，Lanel:野生型 GSl 15 ；Lane2一6:诱导 Oh,24h，48h，72h，96h。 [0033]图14是人P4503A5体外催化咪哒唑仑1_羟基化反应LC/MS图谱，其中，底物浓度:咪哒唑仑:100 μ M，反应条件:37°C，IOmin ;色谱柱=Zorbax SB-C18C2.1mm IDXlOOmm,
3.5-Micro);流动相:A 组成为 CH30H/H20 (10:90，v/v，含 0.1%HC00H)，B 组成为 CH30H/H20(90:10，v/v，含 0.1%HC00H);梯度(min，B%):0, 30 % — 0.2，30 % — 1.6，95%— 2.6, 95%—2.8, 30%^ 4.0, 30%;采用Turbo1nSpray离子源,在正离子检测方式下,选择MRM工作方式进行二级质谱分析。
【具体实施方式】
[0034]下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明的保护范围不限于以下实施例。
[0035]以下实施例中，所采用的原料均可商购获得，其中，人源P4503A5酶及其氧化还原酶的基因(经过英骏公司测序序列完全正确)均购自广州复能基因有限公司的。所用的宿主酵母优选为毕赤酵母，并以此为例进行说明。
[0036]实施例1构建人细胞色素P4503A5酶(CYP3A5)及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶(CYPOR)共表达体系
[0037]构建的具体步骤如下:
[0038]用XbaI酶切质粒pBS-2A (含有2A肽基因)，分别回收3.0kb骨架片段和130bp的2A连接肽，将3.0kb骨架片段去磷酸化处理，重新连接选择反向克隆即pBS-2A(_)；
[0039]将NADPH-细胞色素P450氧化还原酶基因(CYPOR)定向插入载体pBS_2A(_)的BglII及Not I酶切位点之间，获得载体PBS-2A-P0R (见图14)；
[0040]将人细胞色素P4503A5酶基因定向插入载体pBS-2AP0R的BamH I及Xba I酶切位点之间，获得载体PBS-CYP3A5-2A-P0R (见图5-8)；
[0041]用BamH I 和 Not I 双酶切 pBS-CYP3A5-2A_P0R (结果见图 9)，将 CYP3A5-2A-P0R片段定向插入到已经用BamH I和Not I双酶切处理过的酵母表达载体pPIC3.5K中，获得双表达载体PPIC-CYP3A5-2A-P0R (鉴定结果见图10)。
[0042] 对重组质粒CYP3A5_Ppic3.5k的测序结果:
[0043]目的基因人源P4503A5酶大小1509bp，载体Ppic3.5k约9kb (测序由上海英骏生物公司完成)。测序比对完全匹配(终止子由TGA变为TAG，但不影响序列终止)，说明目的基因已经正确连接到Ppic3.5k载体中。
[0044]实施例2人细胞色素P4503A5酶在毕赤酵母GSl 15中表达
[0045]通过抗性和PCR筛选后获得阳性克隆，对阳性克隆进行一定时间的甲醇诱导表达后超声破碎酵母细胞，用常规SDS-PAGE电泳和免疫印迹Western Blot分析蛋白表达情况(见图10、11、12)，结果初步证明CYP3A5在毕赤酵母中得到了表达。
[0046]实施例3酵母表达重组人源P4503A5酶的代谢咪达唑仑活性测定
[0047]以0.1M磷酸盐缓冲液将收集的酵母细胞匀浆；差速离心法分别在9000g，4°C离心20分钟及在100000g，4°C离心60分钟以制备微粒体；以0.1M磷酸盐缓冲液重悬微粒体沉淀，用Bradford法测定蛋白含量，用一氧化碳结合法测定P450含量；将上述适当浓度的微粒体与系列稀释的咪达唑仑混合物0.45mL置于反应管中，置37°C水浴保温5分钟。加40 μ LlOmM NADPH溶液启动反应。6分钟反应后取0.1mL加入含内标的反应终止液终止反应，混匀后置于冰水；上述各反应管于14000rpm离心30min,取上清100 μ L加入到96孔板进样板，进行LC/MS/MS定量分析和数据处理，计算得到酵母细胞重组表达的人源Ρ4503Α5代谢咪达唑仑的活性(结果见图14)。经过计算CYP3A5代谢咪达唑仑成1-羟基咪达唑仑的Km 值为 46.6 + 10.8mM, Vmax 为 9.2±0.8pmol.min-1.pmol 中450。
[0048]实施例4咪达唑仑的人源P4503A5代谢物的制备
[0049]用制备的同时含有人源P4503A5及其氧化还原酶基因的重组质粒电转染到对数生长期的酵母细胞中，诱导人源P4503A5酶大量表达后将溶解的咪达唑仑加入细胞中，终浓度为10(^11;在加入咪达唑仑4811后，80(^离心10分钟，弃去细胞碎处，保留上清；从而制备HPLC纯化咪达唑仑被人源P4503A5代谢的主要产物:1_羟基咪达唑仑。
[0050]由以上各实施例可见，本发明所构建的人源P4503A5酶表达载体可在酵母中异源表达。异源表达的蛋白仅代表CYP3A5这一亚型，因此其代谢活性也仅反映该亚型的活性。而人肝及其亚细胞成分虽然亦含有P4503A5蛋白，但同时也含有其他亚型的P450蛋白，因此它们的代谢活性不能代表单一的P4503A5酶亚型的活性。
[0051]此外，本发明中将人源P4503A5酶及其氧化还原酶基因插入同一个表达载体。这一载体用于制备代谢物的优点首先在于解决了酵母细胞P450氧化还原酶表达水平较低的缺陷，其次在于能够保证被转染的细胞同时表达两种蛋白。而现有技术中，当使用两个不同的表达载体分别携带两个基因时，某些被转染的细胞可能只表达其中一种蛋白，因而代谢活性很低甚至没有活性，最终导致代谢物的产量较低。
【权利要求】
1.一种人细胞色素P450 3A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系，其特征在于包括宿主酵母，以及定向插入P450氧化还原酶基因和人源P450 3A5基因的双表达载体。
2.根据权利要求1所述的人细胞色素P4503A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系，其特征在于:所述的宿主酵母为毕赤酵母。
3.构建权利要求1或2所述人细胞色素P4503A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)用XbaI酶切质粒pBS-2A，分别回收3.0kb PBS骨架片段和130bp的2A连接肽片段，将3.0kb骨架片段去磷酸化处理，重新连接选择反向克隆即载体PBS-2A (-)； (2)将NADPH-细胞色素P450氧化还原酶基因POR定向插入所述载体pBS_2A(-)的BglII及Not I酶切位点之间，获得载体PBS-2A-P0R ； (3)将人细胞色素P4503A5酶基因定向插入所述载体pBS-2A_P0R的BamHI及XbaI酶切位点之间，获得载体PBS-CYP3A5-2A-P0R ； (4)用BamH I 和 Not I 双酶切 pBS-CYP3A5-2A_P0R，将 CYP3A5-2A-P0R 片段定向插入到已经用BamH I和Not I双酶切处理过的酵母表达载体pPIC3.5K中，获得双表达载体PPIC-CYP3A5-2A-P0R ； (5)在酵母细胞中表述上述双表达载体。
4.利用权利要求1或2所述人细胞色素P4503A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系代谢药物咪达唑仑来制备1-羟基咪达唑仑。
5.利用权利要求1或2所述人细胞色素P4503A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系代谢药物咪达唑仑来制备1-羟基咪达唑仑的方法，其特征在于，利用电转染的方式将所述人细胞色素P450 3A5酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶共表达体系转染到宿主酵母细胞中，诱导人细胞色素P450 3A5酶大量表达后将溶解的咪达唑仑加入细胞中，终浓度为100 μ M ;在加入咪达唑仑48h后，800g离心10分钟，弃去细胞碎处，保留上清；从而制备HPLC纯化咪达唑仑被人源P4503A5代谢的主要产物:1_羟基咪达唑仑。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的宿主酵母为毕赤酵母。
【文档编号】C12N15/66GK103937829SQ201310024136
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年1月22日 优先权日:2013年1月22日
【发明者】戴仁科, 张伟, 黄黎珍, 邓继锋, 王珍玉, 谢水林 申请人:中山珐玛斯医药科技有限公司