一种用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法，所述方法包括如下步骤：（1）用细齿麒麟菜饲喂蓝子鱼；（2）从蓝子鱼内脏获得粗酶提取液；（3）用所述粗酶提取液酶解细齿麒麟菜以获得原生质体。本发明方法的原料易于获得，结果完整、稳定，通过本发明方法能够获得具有完整结构的没有细胞壁的原生质体，为接下来的通过原生质体愈合和组织培养途径进行种质种苗培育奠定良好基础。
【专利说明】一种用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种原生质体的制备方法。
【背景技术】
[0002]细齿麒麟菜是重要的产^ -卡拉胶红藻，具有广阔的市场开发和应用前景。在我国，细齿麒麟菜除生产I卡拉胶用于食品和药品加工制造外，还可直接用来加工成凉拌速食产品，仅凉拌速食产品一项我国每年消耗约2000吨干品。
[0003]国际上细齿麒麟菜栽培多在热带和亚热带地区进行，细齿麒麟菜主产于印度尼西亚和菲律宾等东南亚国家和地区。以往该藻规模栽培主要依赖于营养繁殖，而该藻的孢子繁殖和有性生殖方式已经严重退化，造成种质退化、生长缓慢、产胶性能降低和抗病能力下降。
[0004]至今为止，细齿麒麟菜的育苗育种工作，在国内外尚没有重大突破。如果能够通过制备原生质体，进而结合细胞融合和愈伤组织等生物技术培育优良品种，将会对细齿麒麟菜的育种有巨大 作用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对上述问题，提供一种能够制备优良的原生质体的方法，从而为进一步的育种提供良好的基础。
[0006]为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，一种用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法，所述方法包括如下步骤:
(1)用细齿麒麟菜饲喂蓝子鱼；
(2)从蓝子鱼内脏获得粗酶提取液；
(3)用所述粗酶提取液酶解细齿麒麟菜以获得原生质体。
[0007]优选的，所述步骤(1)中用细齿麒麟菜饲喂蓝子鱼的时间为7天或更长时间。
[0008]优选的，步骤(2)中所述蓝子鱼内脏是蓝子鱼的胃和/或肝脏。
[0009]优选的，所述步骤(2)中获得粗酶提取液是由新鲜蓝子鱼内脏在pH值6.0的50HiM磷酸缓钠盐缓冲液中冰冻研磨、匀浆和过滤获得。
[0010]优选的，所述步骤(3)中用粗酶提取液酶解细齿麒麟菜过程中要添加渗透剂和膜稳定剂。
[0011]优选的，所述渗透剂为甘露醇，所述膜稳定剂为氯化钙。
[0012]优选的，所述步骤(3)用粗酶提取液酶解细齿麒麟菜过程中要添加0.5%的纤维素酶和0.5%的果胶酶，并在酶解过程中保持震荡。
[0013]优选的，所述在酶解过程中保持震荡为在25°C条件下保持震荡速度100转/分钟。震荡强度过大会造成原生质体发生破裂，制备的效果不好，因此应保持轻微震荡。
[0014]本发明具体步骤如下:O 利用细齿麒麟菜饲喂杂食性热带蓝子鱼，饲喂时间7天或更长时间，充分诱导蓝子鱼产生能分解细齿麒麟菜的酶类，备用；
2)取用细齿麒麟菜饲喂后的蓝子鱼，分离其胃、肝脏等内脏，冰冻；然后将冰冻后的蓝子鱼胃和肝脏切成小块，置于4摄氏度预冷的容器和50 mM的磷酸缓钠盐缓冲液(pH值
6.0)中，组织匀浆器研磨成匀浆，用不同孔径的滤纸过滤去除杂质，过滤液为可以消化细齿麒麟菜的蓝子鱼内脏酶粗提液；
3)将细齿麒麟菜切成小段，置于组织粉碎器中粉碎至藻泥；然后向其中放入一定比例的蓝子鱼内脏酶粗提液、渗透剂甘露醇和稳定剂氯化钙；同时，上述酶解液中，可添加
0.5%的纤维素酶和0.5%果胶酶，强化分解细齿麒麟菜细胞壁的功能；在25°C条件下，轻微震荡并充分酶解10-12小时。
[0015]向酶解后的藻泥中，加入3ml洗脱液后放回摇床，继续在25°C条件下，震荡酶解I小时；然后，以细孔径的筛絹过滤酶解液，将滤液再转入到离心管中，在相对离心力为218g(湘仪TGL-16M)的条件下离心5 min ;弃去离心管中最上层的清液5ml，并向离心管中加入5ml洗脱液混匀，在相对离心力为218g的条件下重复离心5 min，弃掉上清，向离心管中加入Iml洗脱液， 悬浮后转入1.5ml的离心管中，即为细齿麒麟菜原生质体。
[0016]本发明方法的优点在于:
1、原料易得。蓝子鱼终生喜食细齿麒麟菜，而且该鱼种分布广、易于获得，该鱼的摄食速度快量大，因此其消化系统内有分解该藻的酶类，而且酶活性较强；
2、结果完整、稳定，通过本发明方法能够获得具有完整结构的没有细胞壁的原生质体，为接下来的通过原生质体愈合和组织培养途径，进行种质种苗培育奠定良好基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为用蓝子鱼内脏提取液制备的细齿麒麟菜原生质体；
图2为细齿麒麟菜原生质体样品经伊文思蓝染色后的照片。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范围。
[0019]实施例1，
所需溶液配制:配制50mM pH为6.0的磷酸钠盐缓冲液,取lmol/L磷酸二氢钠4.4ml和lmol/L磷酸氢二钠0.6ml混匀,用蒸懼水将其定容至100ml,作为忙存液备用。
[0020]消毒培养基配制:取50mg的氯霉素，加入到100mL无菌海水中。
[0021]配制洗脱液:取109.3g甘露醇(0.6M)和554.9mg氯化钙(5mM)，分别溶入含I升F/2培养基的锥形瓶(2L)中，放入灭菌锅中，高温高压灭菌25min，待冷却后转入储液瓶待用。
[0022]实验材料准备:取IOg细齿麒麟菜藻体在无菌海水中冲洗干净，然后用纸巾吸干，并转入含有抗生素的培养基中处理30 min h，再用无菌海水冲洗，利用组织匀浆器将藻体打碎成藻泥，备用。
[0023]蓝子鱼内脏提取液制备:取20只热带蓝子鱼，每天用人工投喂细齿麒麟菜。饲喂一周后，分别选取其胃和肝脏内脏，并存放在低温冰冻条件下备用。将蓝子鱼的胃和肝脏放入4摄氏度预冷的小烧杯中，按每克内脏加50 mM pH值为6.0的磷酸缓钠盐冲液20ml，利用组织匀浆器研磨蓝子鱼内脏，提取液分别用20微米、8微米和I微米的滤纸先后分级过滤。向过滤后的粗提液中添加0.5%的纤维素酶(solarbio)、0.5%的果胶酶(solarbio)、
0.6M的甘露醇和5mM的氯化钙，备用。
[0024]将蓝子鱼内脏粗提取液酶解:均浆后的藻泥和粗提酶解液按照1:3比例混匀，然后置于摇床上震荡酶解。酶解过程中采用摇床连续震荡，震荡速度100转/分钟，酶解温度25°C。酶解11-12小时后，向其中加入3ml洗脱液，再放回摇床，继续按100转/分钟速度震荡酶解。I小时后，用500微米的筛絹过滤酶解液，将滤液转入离心管中，在相对离心力为218g (湘仪TGL-16M)的条件下离心5min。弃去离心管中最上层的清液5ml，向沉淀中并加入5ml洗脱液并混匀，在相对离心力为218g条件下离心5min，弃上清，向离心管中加入1ml洗脱液，重新悬浮即为细齿麒麟菜原生质体。
[0025]附注1:F/2培养基配制方法:
【权利要求】
1.一种用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)用细齿麒麟菜饲喂蓝子鱼； (2)从蓝子鱼内脏获得粗酶提取液； (3)用所述粗酶提取液酶解细齿麒麟菜以获得原生质体。
2.根据权利要求1所述的用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中用细齿麒麟菜饲喂蓝子鱼的时间为7天或更长时间。
3.根据权利要求1所述的用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法，其特征在于，步骤(2)中所述蓝子鱼内脏是蓝子鱼的胃和/或肝脏。
4.根据权利要求1所述的用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法，其特征在于，所述步骤(2 )中获得粗酶提取液是由新鲜蓝子鱼内脏在pH值6.0的50 mM磷酸缓钠盐缓冲液中冰冻研磨、匀浆和过滤获得。
5.根据权利要求1所述的用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法，其特征在于，所述步骤(3)中用粗酶提取液酶解细齿麒麟菜过程中要添加渗透剂和膜稳定剂。
6.根据权利要求5所述的用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法，其特征在于，所述渗透剂为甘露醇，所述膜稳定剂为氯化钙。
7.根据权利要求5所述的用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法，其特征在于，所述步骤(3)用粗酶提取液酶解细齿麒麟菜过程中要添加0.5%的纤维素酶和0.5%的果胶酶，并在酶解过程中保持震荡。
8.根据权利要求7所述的用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法，其特征在于，所述在酶解过程中保持震荡为在25°C条件下保持震荡速度100转/分钟。
【文档编号】C12N5/04GK103966153SQ201310026468
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月24日 优先权日:2013年1月24日
【发明者】刘建国, 李俊鹏, 庞通, 李虎, 林伟 申请人:南通中国科学院海洋研究所海洋科学与技术研究发展中心, 中国科学院海洋研究所