抗上皮细胞粘附分子和t细胞抗原的双特异性抗体的制作方法
【专利摘要】一种双特异性抗体，其包含(1)结合EpCAM的第一功能域，(2)结合CD3的第二功能域，以及(3)连接所述第一和第二功能域的接头，所述第一功能域包含至少一个轻链可变区和至少一个重链可变区，所述轻链可变区包含如下三个互补决定区：CDR-L1：RASQDISNYLN；CDR-L2：YTSRLHS；CDR-L3：QQGSTLPYT，所述重链可变区包含如下三个互补决定区：CDR-H1：GYTFTYYGMN；CDR-H2：WINTYTGEPTYGDDFKG；CDR-H3：TGRATSFDY。
【专利说明】抗上皮细胞粘附分子和T细胞抗原的双特异性抗体
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤治疗相关抗体，更具体的，基因工程抗体领域。
【背景技术】
[0002]目前的研究已知上皮细胞粘附分子(EpCAM, Epithelial cell adhesionmolecule KD326)是糖基化的I型跨膜糖蛋白，分子量为30到40kD，其结构包括一个表皮生长因子样，一个甲状腺球蛋白样的胞膜外区，一段跨膜区和一段26氨基酸的胞浆区。EpCAM主要定位于上皮细胞之间，以定向和高度有序的方式起作用来粘附上皮细胞。而一旦上皮细胞恶性转化，快速生长的肿瘤细胞将废弃上皮细胞的高度有序性。结果，EpCAM的表面分布变得较少受约束并且分子更多地暴露于肿瘤细胞上。大多数肿瘤细胞由于其上皮细胞的来源，其表面表达有EpCAM[7]。因此EpCAM可以成为对表面表达有该种分子的肿瘤细胞和肿瘤干细胞进行抗体免疫治疗的靶位点。
[0003]目前已有大量以EpCAM为祀标的免疫治疗研究开展，例如Adecatumumab,Catumaxomab,和一种抗EpCAM/⑶3三功能抗体已进入临床试验研究阶段。其中Catumaxomab抗体在治疗结肠癌/胃癌/或胰腺癌中的效果，Adecatumumab抗体针对前列腺癌的治疗效果，和抗EpCAM/CD3的三功能抗体对卵巢癌的治疗效果在文献中[12-14]被记载。
[0004]据称显示具有治疗胰腺癌，结肠直肠癌及卵巢癌的抗EpCAM/CD3双特异性抗体也已分别发表在研 究文献[15-18]中。此外，中国专利申请CN1812999A也报道了包含抗EpCAMX CD3的双特异性单链抗体构建物的药物，其被预期用于治疗，缓解和/或预防上皮
癌或微量残留癌。
[0005]但目前尚未发现显示具有期待的和理想的肝癌治疗效果的EpCAM抗体被报道。因此，本领域还需要研制具有优良特性包括但不限于有效针对和治疗肝癌的抗EpCAM抗体，从而开发出肿瘤免疫治疗效果更显著的针对性药物。
【发明内容】
[0006]本发明提供具有EpCAM特异性结合功能域的双特异性抗体分子，该分子同时还具有通过与CD3分子的结合引发T细胞靶向细胞毒作用来杀伤肿瘤细胞。本发明的双特异性抗体显示了优良的针对多种肝癌肿瘤细胞系和对瘤小鼠体内肿瘤的特异性杀伤，特别是针对肝癌细胞的特异性杀伤作用。
[0007]本发明涉及一种双特异性抗体，其包含(I)特异性结合EpCAM的第一功能域(2)特异性结合CD3的第二功能域以及(3)连接所述第一和第二功能域的接头，所述第一功能域包含至少一个轻链可变区和至少一个重链可变区，所述轻链可变区包含如下的三个互补决定区:
[0008]CDR-Ll:RASQDISNYLN(SEQ ID NO:7)
[0009]CDR-L2:YTSRLHS (SEQ ID NO:8)[0010]CDR-L3:QQGSTLPYT(SEQ ID NO:9)
[0011]所述重链可变区包含如下三个互补决定区:
[0012]CDR-Hl:GYTFTYYGMN(SEQ ID NO:10)
[0013]CDR-H2:WINTYTGEPTYGDDFKG(SEQ ID NO:11)
[0014]CDR-H3:TGRATSFDY(SEQ ID NO:12)。
[0015]“功能域”指的是能够特异性识别和/或结合到表位上的三维结构，例如抗体或抗体片段，包括天然完整抗体，单链抗体(scFV)，Fd片段，Fab片段，F(ab’)2片段，单结构域抗体片段，分离的⑶R片段，及其衍生物。此处“单链”意思是第一和第二功能域共价连接，优选地以一个核酸分子可编码的共线性氨基酸序列行形成。
[0016]优选地或备选地，上述本发明的双特异性抗体中的第一和/或第二功能域选自单克隆抗体，完整抗体，单链抗体(scFV)，Fab片段，Fd片段，Fv片段，F(ab’)2片段和其功能性衍生物。值得注意的是，本发明的功能域的结合位点可以不仅来自于抗体，也可以来自其他与EpCAM和/或CD3结合的蛋白质，例如天然存在的表面受体或配体。
[0017]“完整抗体”由两个同样的重链和轻链组成，各条链分别包含一个可变区(V区)和一个或多个恒定区(C区)。可变区负责与抗原结合，而恒定区主要负责结合效应分子。在各可变区有三个具有高度多样性的柔性的环，称作互补决定区(CDR)，其主要负责识别抗原。可变区的其他部分包含刚性的β片层并支持所谓的框架区(FRs)。CDR和FR间隔排列形成三明治结构。
[0018]“单链抗体(scFV)片段”指的是通过基因工程构建的抗体片段，其是有通过接头(linker)连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联以形成抗原结合位点。ScFV的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一个核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。
[0019]“Fd片段”指的是由重链VH和CHl组成抗体片段。
[0020]“Fab片段”指的是由Fd片段(由重链VH和CHl组成)和整条轻链通过链间二硫键形成的异二聚物。“Fab抗体”的大小是完整抗体的1/3，其只包含一个抗原结合位点。
[0021]“F(ab’)2片段“指的是包含两个相连的Fab片段的二价片段。
[0022]“单结构域抗体”由重链可变区或轻链可变区组成。由于该抗体片段只由一个结构域组成，所以得名。该片段的大小是一个完整抗体的1/12。
[0023]“抗体的衍生物”包括例如当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可使用如BIAcore系统中使用的表面等离子共振技术来增加与GPC3或CD3抗原表位结合的卩遼菌体抗体的效率(Schier,人抗体杂交瘤7 (1996) ,97-105 ；Malmborg,免疫学方法杂志183 (1995)，7-13)。还包括，例如W089/09622中描述的嵌合抗体的产生的方法，EP-A10239400和W090/07861中描述的人源化抗体产生的方法，W091/10741，W094/02602和W096/33735中有描述的产生异种抗体例如小鼠中的人抗体的方法。
[0024] 本发明使用的抗体或其片段可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，Sambrook,分子克隆:实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.。所指的修饰优选在核酸水平上进行。[0025]“结合”定义抗原上的特定表位与其对应抗体之间的亲和性相互作用，一般也理解为“特异性识别”。“特异性识别”的意思是本发明的双特异性抗体不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。和特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。
[0026]“⑶3”指的是作为T细胞受体复合物的一部分的表达于T细胞的抗原，其由三个不同的链⑶3 ε，⑶3 δ和⑶3 Y组成。⑶3在T细胞上通过例如抗⑶3抗体对其的固定作用而产生的集中(clustering),导致T细胞的活化,与T细胞受体介导的活化类似,但是不依赖于TCR克隆的特异性。绝大多数抗CD3抗体识别CD3 ε链。
[0027]本发明的特异性识别T细胞表面受体CD3的第二功能域不受具体的限制，只要其能够特异性地识别⑶3。例如但不限于在下列专利中提到的⑶3抗体:US7，994，289，US6, 750，325 ；US6, 706，265 ；US5, 968，509 ；US8, 076，459 ；US7, 728，114 ;US20100183615。
[0028]在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体的第一功能域是单链抗体，其包含具有如SEQ ID NO:1所述氨基酸序列的轻链和具有如SEQ ID NO:3所述氨基酸序列的重链的。
[0029]在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体具有如SEQ ID NO:5所述的氨基酸序列。 [0030]如上所述，本发明的双特异性抗体还包括连接第一和第二功能域的接头。接头序列可以是短的肽链，例如但不限于(Gly4Ser)n，其中η从I到5，η为整数。在一个具体实施方案中，η优选为3。包含缺乏二级结构促进作用的所述接头的特征是本领域中已知的，并描述在例如Dali’s Acqua等(Biochem.1998，37，9266-9273)。所设想的具有少于5个氨基酸的接头可以包含4，3，2，或I个氨基酸。优选的单个氨基酸是Gly。如下文实施例中所描述，通过例如基因工程方法接头提供所述第一和第二功能域的相互连接。制备融合的且有效连接的双特异性抗体和在哺乳动物细胞或细菌中表达抗体的方法在本领域中是公知的。
[0031]在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
[0032]在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体还与其他药物或标记物连接。
[0033]本发明还涉及编码上述双特异性抗体的核酸，或与所述核酸在严格条件下杂交的核酸，或由所述核酸的简并序列构成的核酸。术语“杂交”是本领域公职的，即本领域的技术人员知道必须使用什么样的杂交条件。根据本发明的严格杂交条件是指在例如含有50%甲酰胺，5父35(:(7501111氯化钠，751111柠檬酸钠)，501111磷酸钠，5\06111^1肚氏溶液和10%硫酸葡聚糖和20 μ g/ml变性的剪切鲑鱼精DNA的溶液中42度孵育过夜，然后用0.1 X SSC在大约65度洗涤滤膜。同样涉及在较低严格条件下杂交至本发明核酸的核酸分子。通过控制甲酰胺浓度(较低浓度的甲酰胺导致较低的严格性)，盐浓度或温度可以实现杂交和信号检测严格性的变化。此外，为了实现较低的严格性，可以在较高盐浓度(例如5XSSC)条件下进行严格杂交后的洗涤。另外，通过包含和/或替换用于抑制杂交实验背景的封闭实际可以实现上述严格条件的变化。典型的封闭试剂包括Denhardt氏试剂，肝素，变性鲑鱼精DNA和其他商业可获得的制剂。所述核酸分子可以是例如DNA，cDNA, RNA或包含任意这些核酸(单独地或组合地)的重组产生的嵌合核酸分子。[0034]在本发明的一个实施方案中，编码上述双特异性抗体的核酸包含(I)编码SEQ IDNO:1氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO:2，和(2)编码SEQ ID NO:2氨基酸序列的核酸序列 SEQ ID NO:4o
[0035]在本发明的一个实施方案中，编码上述双特异性抗体的核酸具有编码SEQ ID NO:5所述氨基酸序列的核酸序列SEQ ID NO:6。
[0036]本发明还涉及包含所述核酸的载体。许多适当的载体对于本领域技术人员而言是公知的，对载体的选择取决于预期的功能，包括克隆载体和表达载体。载体包括质粒，粘粒，病毒，噬菌体和常规用于基因工程的其他载体。此外，本发明的核酸和载体可以重建入脂质体内以递送到靶细胞。
[0037]表达载体可以是真核细胞载体或原核细胞载体,优选的,所述表达载体还包括有效连接到所述核酸的调节序列。调节序列是指影响连接到其上的编码序列的表达所需的DNA序列。有效连接是指编码序列的调节序列是以与其相容的实现编码序列表达的方式进行连接的。此类调节序列包括例如:(a)复制起始的序列，使得该载体能够在宿主细胞中得以复制，(b)其包含有编码筛选标记的基因序列，该基因编码的蛋白是该宿主细胞在特定的选择培养基中生存和生长所必需的，等等。在宿主细胞如果没有被转染或转化包含该基因的载体的情况下，宿主细胞不能在特定选择培养基中生存。典型的筛选标记基因编码的蛋白包括具有对抗生素或毒素具有耐受性的蛋白，抗生素或毒素包括例如氨节青霉素、卡那霉素、四环素、新霉素、潮霉素、氨甲蝶呤等；补偿营养缺陷的相关蛋白，供应培养基中不存在的关键营养成分，例如编码D-丙氨酸消旋酶基因。采用抗性筛选的例子包括，通过转染包含新霉素抗性基因的外源载体，使宿主细胞获得在含有药物新霉素或G418的培养基的情况下，继续生存生长。另外一个例子是在哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中使用二氢叶酸还原酶(DHFR)筛选标记，哺乳动物细胞宿主细胞是指DHFR缺陷型的细胞，不含二氢叶酸还原酶基因，不能合成核酸，必须在含有HT的培养基里生长。在利用载体转染宿主细胞时，可以通过上述培养基条件的选择筛选得到同时包含目的基因和DHFR基因的外源载体的阳性克隆。(c)其编码序列包含启动子的序列，(d)表达载体还可能包括其它组成序列，包括信号肽序列、转录终止序列、增强子序列等，优选地，本发明的载体为真核细胞载体。优选地,本发明的载体为来自用于抗体真核表达的的pH载体，其包含了 CMV的启动子、内部核糖体进入位点序列(Internal ribosome entry site, IRES)、DHFR筛选标记等元件。氨甲喋呤(MTX)是DHFR的抑制剂，可阻碍其作用。当细胞培养基内含有MTX时，DHFR被抑制，通过反馈调节，使得该基因自我扩增，连带其上下游基因都会扩增，如此目的基因也得到扩增，即可提高目的蛋白的表达量。有用的调节序列对本领域技术人员而言是可知的并且是可以商业得到的。
[0038]本发明还涉及包含有上述载体的表达体系，即涉及包含有所述载体的宿主细胞，用于表达所需的多功能抗体多肽。与使用的载体相适应，本发明的宿主细胞可以是任意的原核宿主细胞或真核宿主细胞。根据所使用的宿主，本发明的核酸编码的蛋白质可以是糖基化的或非糖基化的。是使本发明的核酸序列融合C末端His标签。真核宿主细胞，包括酵母、昆虫细胞、植物细胞，哺乳动物细胞等可以是优选的，因为真核细胞存在复杂的目的蛋白的翻译后修饰(例如糖基化)，越来越多的被用于规模化的培养。常用的宿主细胞系包括猴肾细胞(C0S-7ATCC CRL1651)、人胚胎肾细胞293及其亚克隆细胞系，幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。优选地，本发明的真核宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
[0039]本发明还涉及抗EpCAM/CD3双特异性抗体在制备治疗，预防或缓解肿瘤的药物中的应用。所述肿瘤包括但不限于肝癌，胰腺癌，结直肠癌，卵巢癌，肺癌，乳腺癌，头颈部肿瘤。优选的，所述肿瘤是肝癌。
[0040]本发明还涉及一种药物组合物，其包含安全有效量的抗EpCAM/⑶3双特异性抗体，和药学可接受的载体。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1是包含编码本发明的双特异性抗体EpCAM/⑶3的核酸序列的重组质粒PI H-an t 1-Ep CAM/CD 3 s cF v 的结构不意图。
[0042]图2是基因工程方式重组表达的本发明的双特异性抗体1H8/⑶3的凝胶变性蛋白电泳图(SDS-PAGE)结果，左栏为核酸分子量标记物(购自:上海升正生物技术公司，商品名:低分子量标准蛋白标记)。
[0043]图3是本发明的双特异性抗体1H8/⑶3与外周血淋巴细胞(PBMC)结合的流式细胞分析图(FACS)。
[0044]图4是本发明 的双特异性抗体1H8/⑶3分别与EpCAM阳性的肿瘤细胞Huh_7和SMMC-7721以及与EpCAM阴性肿瘤细胞PLC/PRF/5和SK-H印-1结合的流式细胞分析图。
[0045]图5是显示本发明的双特异性抗体1H8/⑶3诱导PBMC介导的对EpCAM阳性肿瘤细胞H印3B和Huh-7的细胞毒作用数值百分比)的条状图。
[0046]图6显示本发明的双特异性抗体1H8/⑶3诱导PBMC介导的对EpCAM阴性肿瘤细胞SK-H印-1的细胞毒作用数值百分比)的条状图。
[0047]图7是显示本发明的双特异性抗体1H8/⑶3募集PBMC至EpCAM阳性肿瘤细胞Huh-7的显微镜放大照片。其中红色箭头所示是Huh-7细胞，绿色箭头所示是PBMC，黑色箭头所示是聚集在Huh-7细胞周围的PBMC。
[0048]图8显示本发明的双特异性抗体1H8/⑶3不募集PBMC至EpCAM阴性肿瘤细胞SK-Hep-1的显微镜放大照片。其中图8中红色箭头所不是SK-Hep-1细胞，绿色箭头所不是PBMC0
[0049]图9是显示使用不同剂量的本发明的双特异性抗体1H8/CD3及对照介质治疗Huh-7荷瘤小鼠体后体内种植瘤体积改变的折线图，
[0050]图10显示使用不同剂量的本发明的双特异性抗体1H8/⑶3及对照介质治疗H印3B荷瘤小鼠体后体内种植瘤体积改变的折线图。
【具体实施方式】
[0051]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能理解为用于限制本发明的范围。下面实施例中如未注明具体条件的实验方法，则按照常规条件如Sambrook等,“分子克隆:实验手册(New York:Cold Spring Harborlaboratory Press, 1989) ”中所述的条件,而在实施例中明确说明有试剂公司说明书时,则按照说明书所建议的条件进行。[0052]实施例1.抗原免疫及杂交瘤筛选
[0053]1.1抗原免疫
[0054](I)重组蛋白免疫
[0055]EpCAM胞外区重组蛋白(购于上海锐劲生物技术有限公司，货号:R0720)与等体积完全弗氏佐剂(购自Sigma，货号:5881)充分乳化混合得到总体积200 μ L，其中含EpCAM抗原100μ g，皮下注射免疫六周龄BALB/c小鼠。4周后，将重组EpCAM抗原与等体积不完全弗氏佐剂(购自Sigma,货号:5506)乳化混合得到总体积200 μ L，其中含EpCAM抗原50 μ g，腹腔注射免疫小鼠。间隔2周，重复进行一次腹腔加强免疫。最后一次加强免疫完成3周后，对小鼠进行脾内免疫注射20 μ g EpCAM抗原。
[0056]1.2杂交瘤细胞株建立和筛选
[0057]小鼠脾内免疫后4天，在无菌条件下取脾，用100目滤网分离淋巴细胞，与骨髓瘤SP2/0细胞系融合，用含次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的含10%胎牛血清(购于:PAA公司，货号:A15-151)，DMEM(购于Gibco公司，货号:12800-082)择性培养基进行培养，3天后补加黄嘌呤和胸苷继续细胞培养一周。
[0058]用EpCAM胞外区重组蛋白抗原进行包被，通过酶联免疫吸附(ELISA)方法筛选阳性克隆，并对阳性克隆通过有限稀释法继续进行3次亚克隆，连续培养2个月，最后获得稳定的阳性克隆，该杂交瘤细胞株命名为1H8。
[0059]实施例2.制备抗EpCAM双特异性抗体
[0060]2.1抗EpCAM单链抗体的基因工程制备
[0061]使用Trizol(Invitrogene公司，货号:15596-026)提取上述实施例1的杂交瘤细胞株1H8的总RNA，然后使用逆转录RT-PCR试剂盒(Promega公司，货号:A3800)按照试剂盒说明书的操作步骤对上述所提取的总RNA进行逆转录得到互补DNA序列。
[0062]利用5’_Full Race试剂盒(Takara公司，货号:D315)按照试剂盒说明的步骤，以上述得到的互补DNA序列为模板，扩增包含抗体重链或轻链可变区及其上下游序列的一段DNA序列，其中:
[0063]上游引物由该试剂盒所提供，
[0064]下游外侧引物为:CCAGAGTTCCAGGTCACTGTCACT(SEQID NO:13)，
[0065]下游内侧引物为:CCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTT(SEQID NO:14)，
[0066]然后将PCR扩增得到的抗体重链及轻链可变区分别克隆到T-easy载体(Promega公司，货号:A1360)后，转化感受态大肠杆菌ToplO，抗性培养筛选，挑取单克隆菌株，分别进行测序。
[0067]然后将测序结果分别输入Pubmed Blast IgBlast数据库进行对比，数据库根据对比结果显示抗体的FWRl-⑶R1-FWR2-⑶R2-FWR3，根据小鼠抗体⑶R3末尾特征性氨基酸，即重链=Val-Ser-Ala或Val-Ser-Ser ;轻链:Ile-Lys_Arg，精确找出杂交瘤1H8单克隆细胞株重链和轻链可变区的起始部位。确定得到轻链可变区的氨基酸酸序列为SEQ ID N0:1,编码其的核酸序列为SEQ ID NO:2 ;重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，编码其的核酸序列为SEQ ID NO:4o
[0068]SEQ ID NO: I (1H8VL) [0069]DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGT
【权利要求】
1.一种双特异性抗体，其包含(I)结合EpCAM的第一功能域，(2)结合CD3的第二功能域，以及(3)连接所述第一和第二功能域的接头，所述第一功能域包含至少一个轻链可变区和至少一个重链可变区，所述轻链可变区包含如下三个互补决定区:
CDR-Ll:RASQDISNYLN(SEQ ID NO:7)
CDR-L2:YTSRLHS(SEQ ID NO:8)
CDR-L3:QQGSTLPYT(SEQ ID NO:9) 所述重链可变区包含如下三个互补决定区:
CDR-Hl:GYTFTYYGMN(SEQ ID NO:10)
CDR-H2:WINTYTGEPTYGDDFKG(SEQ ID NO:11)
CDR-H3:TGRATSFDY(SEQ ID NO:12)。
2.权利要求1的双特异性抗体，所述第一和/或第二功能域选自单克隆抗体，完整抗体，单链抗体(scFV)，Fab片段，Fd片段，Fv片段，F(ab’)2片段和其功能性衍生物。
3.权利要求1的双特异性抗体，所述第一功能域是单链抗体，其包含具有如SEQIDNO:1所述氨基酸序列的轻链可变区和具有如SEQ ID NO:3所述氨基酸序列的重链可变区。
4.权利要求1的双特异性抗体，其具有如SEQID NO:5所述的氨基酸序列。
5.权利要求1或2的双特异性抗体，其是嵌合抗体或人源化抗体。
6.权利要求1-3之一的双特异性抗体，其还与其他药物或标记物连接。
7.编码上述权利要求之一的双特异性抗体的核酸，或与所述核酸在严格条件下杂交的核酸，或由所述核酸的简并序列形成的核酸。
8.权利要求7的核酸，其包含(I)编码SEQID NO:1氨基酸序列的核酸序列SEQ IDNO:2，和(2)编码SEQ ID NO:2氨基酸序列的核酸序列SEQ IDNO:4。
9.权利要求7的核酸，其具有编码SEQID NO:5所述氨基酸序列的核酸序列SEQ IDNO:6。
10.含有权利要求7-9之一的核酸的载体。
11.权利要求10的载体,其为表达载体。
12.权利要求10或11的载体，其还包含有效连接到所述核酸的调节序列。
13.包含权利要求10-12之一的载体的宿主细胞。
14.权利要求1-6之一的双特异性抗体在制备治疗，预防或缓解肿瘤的药物中的应用。
15.权利要求14的应用，其中所述肿瘤为肝癌。
16.一种药物组合物，其包含安全有效量的权利要求1-6之一的双特异性抗体和药学可接受的载体。
【文档编号】C12N5/10GK103965359SQ201310025302
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月24日 优先权日:2013年1月24日
【发明者】李宗海, 张鹏飞, 石必枝, 王华茂, 高慧萍 申请人:上海市肿瘤研究所