基于pcr技术检测三七根腐病的方法
【专利摘要】本发明是利用PCR技术来实现对三七种苗质量进行量化评价，同时又可以对未来三七种植过程中根腐病患病的风险进行预测。通过DNA表达丰度作为单位植株携带病原菌数量的检测指标，其中当DNA丰度比DNA丰度比大于0.1时视为发病苗。通过DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测、数据统计四步即可完成对三七种苗的批量抽检评价。
【专利说明】基于PCR技术检测三七根腐病的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用常规PCR技术来预测未来三七(Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen)根腐病发病是否发病及其发病几率大小的技术。
【背景技术】
[0002]三七根腐病的常年发病率一般在5-20%，严重的可损失70%以上，甚至会造成七园的绝收。而三七一旦发病，想要控制则比较困难。所以，目前对根腐病的防治主要在于预防。
[0003]有专家调查发现:苗棵长势与根腐病的发生具有一定的关系，苗棵长势差的七园根腐病危害重，长势好的七园根腐病危害轻。因此，生产当中采用常常培育健壮种苗、移栽前分级等措施来降低三七根腐病发病的风险。
[0004]七农们常常把质量高(好)的种苗总结为芽(休眠芽)壮、主根(头)大、根(须根)多、体重、鲜活、无病。根据外观形态和单株根重可以分为不同的等级，详见下表1。然而，这种判决方法主要通过人为的经验判断来产生。尽管此法在一定程度上对三七根腐病的预防起到了作用，但依然存在有以下几种弊端:(I)判断标准模糊。例如一级种苗标准外观形态要求:休眠芽肥壮，根系生长良好，无病虫感染和机械损伤。其中对于“肥壮”的标准是什么，哪种的根系算是“良好”等等诸如此类问题任何人也说不清楚。(2)随意性大。不同分级人采用的判断 标准不同，其最后的结果自然也是各不相同(3)费事、费力。一亩地平均籽条(三七种苗)数为20万株，如果要挑选一遍，其工作量可想而知。假如是十亩、百亩等的规模的七园苗圃，显然对物力、人力等资源的消耗也是巨大的。
[0005]表1生产当中所使用的三七种苗质量分级表
[0006]
【权利要求】
1.一种基于PCR技术检测三七根腐病的方法，其特征在于DNA模板提取、高特异性聚合酶链式反应扩增、电泳检测和数据统计四个方面；①模板DNA的提取:称取0.03g左右须根加入2.0mL EP管中，加入磁珠后置于磨样器中破碎处理至粉末状；加入800ul65°C预热的2XCTAB裂解液后，轻缓颠倒混匀，置于65°C水浴锅中裂解lh，每隔15min轻缓颠倒一次；水浴结束后12000rpm离心10min ;转移上清液于新的2.0ml洁净离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24: I)，轻缓颠倒混匀后，放置10min，12000rpm离心10min ;吸取上清液于新的2.0ml离心管中，加入等体积的预冷异丙醇，轻缓颠倒混匀，-20°C冰箱放置lh，12000rpm离心10min ;弃上清液，加入ImL的70%乙醇洗涤2次；去除乙醇后，加入IOOuL双蒸水溶解DNA，-20°C冰箱保存；@PCR扩增:PCR反应体系25 μ L含2.5 μ LlOXExtaq缓冲液、2μL0.25mmol/L dNTPs，两种高度特异性引物镰刀菌属rDNA ITS特异性引物 Ful (5，-CCGAGTTTACAACTCCCAAA-3，)和 Fu2(5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，)以及植物叶绿体rbcL基因引物Rbl(5’-ATGTCACCACAAACAGAAAC-3’)和Rb2(5，-TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3’ )，各 0.25pmol，0.8U Ex taq DNA 聚合酶，约 l_15ngDNA模板；反应在ABI公司的9700型基因扩增仪上进行扩增，循环参数为94°C预变性5min ；94°C变性30s，52°C (镰刀菌ITS)/56°C (叶绿体rbcl)退火30s，72°C延伸Imin (镰刀菌ITS)/lmim30s(叶绿体rbcl)，35个循环后72°C延伸IOmin ;③电泳检测:PCR反应结束后在I %琼脂糖凝胶检测，每孔上样4 μ L PCR产物及2 μ L6 X loading buffer, 2000bp DNAMarker作为分子量对照；180v电泳15分钟，然后在自动凝胶电泳检测系统中观察、扫描并储存电泳结果；④数据处理:利用Gene tool软件纪录PCR扩增条带的光密度值；利用SPSS 13.0软件进行方差分析及其他统计分析。
【文档编号】C12Q1/04GK103966304SQ201310025275
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月24日 优先权日:2013年1月24日
【发明者】黄璐琦, 袁媛, 崔秀明, 李瑞博 申请人:中国中医科学院中药研究所