一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及蓝细菌基因工程领域。具体而言，本公开涉及用于构建无筛选标签蓝细菌突变株的载体，包括所述载体的启动子和基因元件，以及构建无筛选标签的蓝细菌突变株的方法。
【专利说明】一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及蓝细菌基因工程领域，具体而言是一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体及其应用。
【背景技术】
[0002]蓝细菌广泛分布于地球各种环境中，是一类能够进行植物型光合作用的原核生物。1996年，日本Kazusa研究所完成了蓝细菌集胞藻PCC6803全基因组测序工作，这是第一个完成全基因组测序的光合生物；到目前为止，已经有约40多种蓝细菌基因组被测序完成。另外，由于蓝细菌具有细胞结构简单、易于培养、生长相对迅速、遗传操作简单方便等优势，包括集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7942和鱼腥藻PCC7120在内的一些蓝细菌菌株，成为光合作用、昼夜节律和固氮机理等研究的重要模式生物。
[0003]近年来，在能源和环境危机的背景下，基于生物质资源的通过生物或化学转化制备生物燃料的研究再次成为研究热点。而蓝细菌由于具有高效的光合作用能力、清晰的遗传背景、简单方便的遗传操作体系等优势，又被改造成为新一代光合能源微生物系统(Angermayr, S.A.，et al.(2009).“Energy biotechnology withcyanobacteria”，Curr 0pinBiotechnol20 (3): 257-263.)，用于合成各种生物燃料分子，如乙醇(Dexter, J.and Fu, P.(2009).“Metabolic engineering of cyanobacteria forethanol production”，Energy & EnvironmentalScience2(8):857-864.；Gao, Z., H.Zhao,et al.(2012)." Photosynthetic production of ethanol from carbondioxide ingenetically engineered cyanobacteria." Energy & EnvironmentalScience5 (12):9857-9865.)、正丁 醇(Lan，E.1.and J.C.Liao (2012)." ATP drivesdirect photosynthetic production of 1-butanol incyanobacteria." Proc NatlAcad Sci U S A109 (16): 6018-6023.)、异丁 醇(Atsumi, S.，et al.(2009).“Directphotosyntheticrecycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde，，，Nat.Biotechnol.27:1177-1180.)、脂肪醇(Tan, X.，L.Yao, et al.(2011)." Photosynthesisdriven conversion of carbon dioxide to fattyalcohols and hydrocarbonsin cyanobacteria.^Metab Engl3(2):169-176.)> 脂肪酸(Liu,Χ.，J.Sheng, etal.(2011)." Fatty acidproduction in genetically modified cyanobacteria." ProcNatl AcadSci U S A108(17):6899-6904.)和脂肪烃(Schirmer, A.，M.A.Rude, etal.(2010)." Microbial biosynthesis of alkanes." Science329 (5991): 559-562.)等。自2009年以来，相关研究证明了基因工程蓝细菌合成生物燃料的可能性和巨大应用潜力，也引起了国际上学术界和工业界的高度关注。不过，产品产率不高以及由此引起的生产成本过高，又成为限制了基因工程蓝细菌合成生物燃料路线产业化应用的主要瓶颈问题。
[0004] 为了不断提高蓝细菌合成生物燃料的产量，对蓝细菌基因组系统地遗传改造工作就显得十分重要。传统的蓝细菌遗传操作手段多通过同源重组的方式将筛选标签(多为抗性筛选标签)插入待改造基因位点中或置换其部分编码序列。这种遗传改造方式依赖于可用的抗性筛选标签数目，已经不能满足多基因位点(3个以上)乃至基因组范围的遗传改造工作。因此，开发一种能够在蓝细菌中切除筛选标签，构建无筛选标签突变株的方法，对于蓝细菌系统地遗传改造工作，和基因工程蓝细菌生产生物燃料研究具有重要的意义。 [0005]位点特异性重组系统，如Flp/FRT或Cre/LoxP等，就是一种能够实现筛选标签基因组内切除的有效工具，目前已经在包括E.coli (Datsenko, K.A.andB.L.Wanner(2000)." One-step inactivationof chromosomal genes in Escherichiacoli K-12 using PCR products." Proceedings of the National Academy ofSciences 97(12):6640-6645.和植物(Li, B.，N.Li, et al.(2010)." Generation ofmarker-freetransgenic maize with improved salt tolerance using the FLP/FRTrecombination system." J Biotechnol 145 (2): 206-213.)等许多模式生物体系中成功应用。以Flp/FRT重组系统在E.coli的应用为例，它的基本原理是，首先，在第一轮转化中通过抗生素筛选得到基因组的特定位置被带有FRT侧翼的抗性基因片段插入的突变株；然后，通过第二轮转化将flp基因导入到上述突变株，并诱导其表达，而FLP则特异地切除并连接抗性基因片段两侧的FRT位点实现抗性标签的切除；最终，通过热激等条件诱导实现flp表达质粒的丢失。而重复这一过程就能实现在多个基因位点的遗传改造。其中Flp/FRT系统中的Flp酶，最适反应温度为30° C，这与大多数蓝细菌最适生长温度一致，适合用于构建无筛选标签的基因工程蓝细菌。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体及其应用。
[0007]为实现上述目的，本发明采用技术方案为:
[0008]一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体，包含抗性基因片段和FLP基因元件；所述FLP基因元件包含FLP基因和用于驱动FLP基因的启动子；所述FLP基因由诱导型启动子控制。
[0009]所述驱动FLP基因启动子为Ppew启动子、Ptac启动子、PpetE>Prbpl > PisiA或PnrsB。
[0010]所述FLP基因为酿酒酵母的FLP基因。所述用于构建无筛选标签蓝细菌的载体如序列表SEQ ID N0:5的碱基序列所示。所述抗性基因片段为Omega片段、氯霉素抗性基因片段或红霉素抗性基因片段。
[0011]所述蓝细菌为集胞藻(Synechocystissp.) PCC6803、聚球藻(Synechococcuselongatus sp.) PCC7942、聚球藻(Synechococcus sp.) PCC7002、鱼渥藻(Anabaena sp.)PCC7120 或嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus) BP-1。
[0012]用于构建无筛选标签蓝细菌的载体的应用，利用所述载体诱导FLP基因表达获得无筛选标签蓝细菌突变株。
[0013]本发明所具有的优点:
[0014]本发明利用来源于酿酒酵母的FLP/FRT重组系统构建无筛选标签的蓝细菌突变株。
[0015]本发明利用在蓝细菌中具有活性的启动子驱动FLP酶在带有FRT侧翼的抗性基因敲除的蓝细菌突变株中表达，利用FLP特异性切除并连接FRT位点的特点，构建无筛选标签的蓝细菌突变株。获得的切除抗性片段后的突变株，可以多次被遗传改造，最终得到的还是无筛选标签的蓝细菌突变株。本发明由FLP/FRT重组系统能够很好的切除蓝细菌突变株基因组中的抗性基因片段，可以实现对蓝细菌多个基因位点乃至基因组规模的系统改造。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明实施例提供的质粒pXT218a的基本结构图。其中元件包括Ptae启动子、Ppetj启动子、flp基因、Trafi终止子和Omega片段。
[0017]图2为本发明实施例提供的质粒pXT218b的基本结构图。其中元件包括Ptae启动子、Omega片段、Ppetj启动子、flp基因和Trafi终止子。
[0018]图3为本发明实施例提供的反转录PCR检测FLP基因在蓝细菌突变株转录效果图。其中M，200bp DNA标准品；B，以无菌水作为模板；W，以野生型集胞藻PCC6803或野生型聚球藻PCC7942cDNA作为模板；+Cu，以普通BGll培养基培养的6803-XT206 (pXT218b)细胞cDNA作为模板；_Cu，以缺铜BGll培养基培养的6803-XT206 (pXT218b)细胞cDNA作为模板；_IPTG，以普通8611培养基培养的79424了212(?乂了218&)细胞cDNA为模板；+IPTG，以补加IPTG (终浓度ImM) BGll培养基培养的7942-XT212 (pXT218a)细胞cDNA为模板。
[0019]图4为本发明实施例提供的FLP表达后蓝细菌突变株基因型检测结果图。其中A图为集胞藻PCC6803野生型、phaAB基因突变株以及后续FLP表达后phaAB突变株基因型检测结果；B图为聚球藻PCC7942野生型、NSl基因突变株以及后续FLP表达后NSl突变株基因型检测结果。A、B图中，M为200bp DNA标准品；WT为以野生型集胞藻PCC6803或野生型聚球藻PCC7942基因组DNA作为模板；MT为以phaAB突变株或NSl突变株DNA作为模板；S为以诱导条件下培养的6803-XT206 (pXT218b)或7942-XT212 (pXT218a)细胞DNA作为模板。
[0020]图5为本发明实施例提供的FLP表达质粒丢失后突变株基因型检测结果图。其中A，B图为，以fIp-F和flp-R引物对PCR检测各菌株中pXT218b和pXT218a质粒的丢失情况；C图为以pha-cl和pha_c2引物检测各突变株phaAB位点基因型；D图为，以7942-NSl-seq-l和7942-NSl_seq-2弓丨物对PCR检测检测各突变株NSl位点基因型。图A、B、C和D图中M为200bp DNA标准品；BC为以无菌水作为模板；W为以pXT218b或pXT218a质粒作为模板；C为以未诱导质粒丢失的突变株(在补加壮观霉素或链霉素的BGll培养基培养)DNA为模板；1-4，以随机选取的4个对壮观霉素(或链霉素)和卡那霉素敏感的单克隆DNA作为模板。
[0021]其中，
[0022]SEQ ID NO:1:质粒 pXT218a 序列。
[0023]SEQ ID NO:2:质粒 pXT218b 序列。
[0024]SEQ ID NO: 3:切除抗性标签后的phaAB突变株phaAB位点附近的DNA序列。
[0025]SEQ ID NO: 4:切除抗性标签后的NS I突变株NS I位点附近的DNA序列。
[0026]SEQ ID NO:5:来源于酿酒酵母的Flipase酶基因序列。
【具体实施方式】
[0027]相关术语
[0028] 蓝细菌(也称为蓝藻)是一类光合自养的原核微生物，其能够利用太阳能，固定二氧化碳。
[0029]FLP酶(Flipase，FLP)是能够特异性的剪切和连接FRT位点的酶。
[0030]FRT 位点(Flipase Recognition Target, FRT)是一段长度为 34bp 的特定 DNA 序列(GAAGTTCCTATTCtctagaaaGtATAGGAACTTC)。
[0031]细胞色素c553(cytochrome c553,PetJ)是光合作用中将电子由细胞色素b6/f复合体传递到光系统I的电子载体，在集胞藻PCC6803基因组其编码基因为petj，slll796。在本发明的实施方案中，将它的启动子(本发明的实施方案中表不为PprtJ)克隆用于驱动FLP基因在集胞藻PCC6803中的表达，(其具体序列如SEQ ID NO:5的碱基序列所示)
[0032]ta c启动子(Pta。)是大肠杆菌色氨酸启动子(Pfep)和乳糖启动子(Pla。)的杂合启动子。在本发明的实施方案中，该启动子被用于驱动FLP基因在聚球藻PCC7942中的表达，其具体序列为 TGACAATTAATC ATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAAITTC。
[0033]phaAB基因簇是集胞藻PCC6803基因组中编码酮硫解酶(beta-ketothiolase)和乙酰乙酰辅酶还原酶(acetoacetyl-CoAreductase)的基因。本发明的实施方案就是通过同源重组将带有FRT侧翼序列的抗性基因片段置换该基因簇的编码序列，从而构建得到集胞藻PCC6803phaAB突变株。
[0034]NSl位点是聚球藻PCC7942基因组中的一个中性位点(neturalsite)。本发明的实施方案就是通过同源重组在该位点整合带有FRT侧翼序列的抗性基因片段，从而构建得到聚球藻PCC7942NS1突变株。
[0035]在本发明的实施方案中，载体(vector)是指能够将DNA片段(目的基因)转移到受者细胞中的一种自我复制的DNA分子。
[0036]“杂交”表示这样一个过程:在该过程中，于合适的条件下，两条核酸序列以稳定且特异的氢键相互结合以致形成双链。这些氢键在互补碱基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))之间(则这称为A-T键)或在互补碱基鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之间(则这称为G-C键)形成。两条核酸序列的杂交可以是全部的(则称为互补序列)，即在该杂交过程中获得的双链仅包含A-T键和C-G键。这种杂交可以是部分的(则称为足够互补的序列)，即获得的双链包含允许形成双链的A-T键和C-G键，但还包含未与互补碱基结合的碱基。两条互补序列或足够互补的序列之间的杂交取决于所使用的操作条件，并且特别是严紧性。严紧性特别是根据两条核酸序列的碱基组成来定义，以及通过这两条核酸序列之间的错配程度来定义。严紧性还可以取决于反应参数，例如存在于杂交溶液中的离子种类的浓度和类型，变性剂的性质和浓度，和/或杂交温度。所有这些数据是所熟知的，并且合适的条件可以由本领域技术人员来确定。
[0037]如本领域已知的，核酸序列彼此杂交的条件可以被描述为从低到高严紧性的范围。在此处提及低严紧杂交条件时，包括至少大约0%到至少大约15%v/v甲酰胺，以及用于杂交的至少大约IM到至少大约2M的盐，和用于洗涤条件的至少大约IM到至少大约2M的盐。一般地，低严紧杂交条件的温度为大约25-30°C到大约42°C。在此处提及中等严紧杂交条件时，包括至少大约16%v/v到至少大约30%v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐。在此处提及高严紧杂交条件时，包括至少大约31%v/v到至少大约50%v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐。一般地，洗涤在下列条件下进行:1?=69.3+0.41 (G+C)% (Marmur和Doty, J.Mol.Biol.5:109，1962)。但是，每增加1%的错配碱基对数目，双链体DNA的Tm 下降 I °C (Bonner 和 Laskey, Eur.J.Biochem.46.:83，1974)。在这些杂交条件中甲酰胺是可选的。因此，特别优选的严紧杂交条件如下确定:低严紧杂交条件是6x SSC缓冲液，1.0%w/v SDS，在25-42°C下；中等严紧杂交条件是2x SSC缓冲液，1.0%w/v SDS，在20°C至65°C的温度下；高严紧杂交条件是0.1x SSC缓冲液，0.l%w/v SDS，在至少65°C的温度下。关于核酸的杂交的详尽指导可见于Ti jssen, (1993)LaboratoryTechniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes,第 I部分，第 2 章(Elsevier, New York);和 Ausubel 等人，编辑(1995) Current Protocolsin MolecularBiology,第 2章(Greene Publishing and Wiley-1nterscience, NewYorkX还可参见 Sambrook 等人,(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual (第 2 版,ColdSpring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。
[0038]“同一性”或“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同一性百分比是由这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性百分数=相同位置的数目/位置的总数(例如，重叠位置)X100)。例如，“同一性百分比”通过下列方式来计算:在比较窗中比较两个经最佳比对的序列，测定在两个序列中出现相同核苷酸碱基或相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目(即，窗的大小)，并且将结果乘以100从而产生序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行:例如，Smith和Waterman (Adv.App1.Math.2:482, 1970)的局部同源性算法；Needleman 和 Wunsch (J.Mol.Biol.48:443, 1970)的同源性比对算法；Pearson 和 Lipman (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444，1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施(例如，WisconsinGeneticsSoftware Package, Genetics Computer Group, 575ScienceDr., Madison, ffis.中的 GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P,BLAST N和TFASTA);或手工比对和目测检查(参见，例如Ausubel等人，CurrentProtocoIs in Molecular Biology (1995 增刊))。
[0039]本发明的实施方案所涉及的同一性百分比包括至少大约60%，或至少大约65%，或至少大约70%，或至少大约75%，或至少大约80%，或至少大约85%，或至少大约90%，或更高，例如大约95%，或大约96%，或大约97%，或大约98%，或大约99%，例如至少大约60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、
100% O
[0040]本发明用于构建无筛选标签蓝细菌突变株的载体为质粒pXT218a和质粒pXT218b。所述载体可以包含在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的FLP酶基因。
[0041]所述载体还可以包含RSF1010复制子，用于使所述载体能够在蓝细菌中自主复制。所述在蓝细菌中具 有活性的启动子可以选自Pprtl启动子和Pta。启动子。另外，在本发明的实施方案中还可以使用 PpetE、Prbpl、PisiA 和 PnrsB0
[0042]所述FLP酶基因可以为选自下列的基因:来源于酿酒酵母的flp基因，另外，在本发明的实施方案中还可以使用与上述基因具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更加优选地至少95%同一性，最优选地至少99%同一性，并且编码具有FLP酶活性的蛋白质的基因；或者与上面所列基因在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下杂交，并且编码具有FLP酶活性的蛋白质的基因。
[0043]所述蓝细菌为集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7942。另外，在本发明的实施方案中还可以使用聚球藻(Synechococcus sp.)PCC7002、鱼渥藻(Anabaena sp.)PCC7120 和嗜热聚球藻(Thermosynechococcuselongatus) BP-1。
[0044]实施例1:
[0045]构建用于在蓝细菌表达FLP基因从而得到无筛选标签蓝细菌突变株的载体pXT218a 或 pXT218b:
[0046]为了验证FLP/FRT系统用于构建无筛选标签蓝细菌突变株的可行性，基于穿梭载体pRL59Hl构建了载体pXT218b和pXT218a。在这两个载体中，Ppew启动子和Ptae启动子分别被用于驱动FLP基因在两种蓝细菌(集胞藻PCC6803和聚球藻PCC7942)的突变株中表达。
[0047]I)质粒pXT218a的构建
[0048]以 PpetJ-F (CATCGGGGGCTGTGTTGGC)和 PpetJ-R (GTGTTTTACATAATATACCAAATTGTGGCATATGTTCTCCTTTCAAGGATAAAGT)为引物对，以集胞藻PCC6803基因组为模板进行PCR扩增(反应体系如表1所示；反应程序如表2所示);再以Flp-F(ACTTTATCCTTGAAAGGAGAACATATGCCACAATTTGGTATATTATGTAAAACAC)和 Flp-R (TTATATGCGTCTATTTATGTAGGATGAAAGG)为引物对，以质粒 pCP20 (Datsenko, K.A.and B.L.Wanner (2000)." One-step inactivationofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products." Proceedingsof the National Academy of Sciences97 (12): 6640-6645.)为模板进行 PCR 扩增(反应体系如表1所示；反应程序如表2所示)；将上述两步分别得到的PCR产物分别用回收试剂盒(Omega, Catalog N0.:D2500_01)收后,等摩尔比混合,不加任何引物,通过融合PCR串联(融合PCR反应体系中除了不添加任何引物和模板，其他如表1所示；反应程序除了退火温度由55°C改为50°C，循环次所由30次改为10次，其他如表2所示)；取融合PCR产物为模板，以 PpetJ-F (CATCGGGGGCTGTGTTGGC)和 Flp-R (TTATATGCGTCTATTTATGTAGGATGAAAGG)为引物对，再次PCR (反应体系如表1所示；反应程序除了 72°C延伸时间改为2分钟，其他如表2所示)，将得到的PCR产物克隆到pMD18-T载体(Takara，Catalog N0.:D101A)中，从而得到质粒PXT208。
[0049]表1.PCR反应体系a
[0050]
【权利要求】
1.一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体，其特征在于:包含抗性基因片段和FLP基因元件；所述FLP基因元件包含FLP基因和用于驱动FLP基因的启动子；所述FLP基因由诱导型启动子控制。
2.按权利要求1所述的用于构建无筛选标签蓝细菌的载体，其特征在于:所述驱动FLP基因启动子为Ppetl启动子、Pta。启动子、PpetE> Prbpl、PisiA或PmsB。
3.按权利要求1所述的用于构建无筛选标签蓝细菌的载体，其特征在于:所述FLP基因为酿酒酵母的FLP基因。
4.按权利要求1所述的用于构建无筛选标签蓝细菌的载体，其特征在于:所述用于构建无筛选标签蓝细菌的载体如序列表SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2中碱基序列所示。
5.按权利要求1所述的用于构建无筛选标签蓝细菌的载体，其特征在于:所述抗性基因片段为Omega片段、氯霉素抗性基因片段或红霉素抗性基因片段。
6.按权利要求1所述的用于构建无筛选标签蓝细菌的载体，其特征在于:所述蓝细菌为集胞藻(Synechocystis sp.) PCC6803、聚球藻(Synechococcus elongatus sp.)PCC7942、聚球藻(Synechococcus sp.)PCC7002、鱼腥藻(Anabaena sp.)PCC7120 或嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus) BP-1。
7.—种权利要求1所述的用于构建无筛选标签蓝细菌的载体的应用，其特征在于:利用所述载体诱导FLP基因表达获得无筛选标签蓝细菌突变株。
【文档编号】C12R1/01GK103966249SQ201310028228
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月24日 优先权日:2013年1月24日
【发明者】吕雪峰, 谈晓明, 梁飞燕 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所