大草蛉卵黄原蛋白新基因及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重要天敌昆虫大草蛉(Chrysopa?septempunctata)卵黄原蛋白基因DNA序列及其编码的蛋白质序列，填补了脉翅目昆虫卵黄原蛋白基因分子信息的缺乏，为研究卵黄原蛋白基因在大草蛉生殖发育调控中的作用机制、卵黄原蛋白基因功能提供了新基因。该发明将为大草蛉大量繁育和有效利用提供理论基础，在害虫生物防治领域具有良好的应用前景。
【专利说明】大草蛉卵黄原蛋白新基因及应用
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种卵黄原蛋白新基因DNA序列及其编码的蛋白质序列，属于基因工程和蛋白质工程领域。本发明涉及一种大草蛉(Chrysopa septempunctata)卵黄原蛋白新基因的克隆及应用。
【背景技术】
[0002]卵黄原蛋白(Vitellogenin，Vg)是特异地存在于非哺乳类性成熟的卵生雌性动物血液中的一种蛋白， 是几乎所有卵生动物卵黄蛋白的前体。1969年首次在惜古比天蚕娥(Hyalophora cecropia)中鉴定该蛋白，并将其命名为Vg。昆虫Vg来源于6_7kb的mRNA编码而形成的200KD的前体蛋白，经修饰后成为由几个亚基组成的天然的卵黄原蛋白，为正在发育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、磷、硫及微量元素等营养和功能性物质。
[0003]昆虫卵黄原蛋白的研究是近年来昆虫生理学和生物化学研究的热点。到目前为止，已有多种昆虫的Vg基因被克隆和鉴定，主要包括网翅目、半翅目、鳞翅目及膜翅目等昆虫，但在脉翅目昆虫中还没有Vg基因被克隆。大草蛉是一种重要的脉翅目天敌昆虫，能够有效地控制蚜虫、蚧虫、粉虱等农林害虫，由于它的取食范围广、食量大、分布广、数量多而深受国内外生防工作者的重视。大草蛉卵黄原蛋白与该天敌昆虫营养生理和生殖特性紧密相关，因此，研究大草蛉卵黄原蛋白具有重要意义和应用价值。本发明首先在脉翅目天敌昆虫大草蛉中发现、克隆了卵黄原蛋白基因，并对其编码的氨基酸序列、同源性及进化地位进行了分析，为Vg基因功能及大分子生物进化研究提供了新基因，为该重要天敌昆虫大量繁育和有效利用提供了理论基础。
【发明内容】
[0004]本发明包括以下内容:
[0005]1.本发明提供了一种编码大草蛉卵黄原蛋白的多核苷酸分子SEQ ID N0.1，所述的多核苷酸分子包括与SEQ ID N0.1相符合的核苷酸序列以及与SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列部分相符合并具有相似功能的片断。
[0006]2.本发明提供了一种蛋白质，所述的蛋白质包含与SEQ ID N0.2氨基酸序列基本及部分相符合的氨基酸序列。
[0007]3.一种卵黄原蛋白基因应用的方法，包括通过监测卵黄原蛋白基因表达量，来研究卵黄原蛋白含量，从而研究卵黄原蛋白对昆虫营养和生殖如产卵量影响的方法。
[0008]文中涉及氨基酸序列的地方使用“基本相符”这一术语是想包含那些不会导致卵黄原蛋白质生物活性降低的氨基酸序列上的变化.这些变化可能包括保守的氨基酸替代
坐寸ο
[0009]有益效果
[0010]1.本发明公开了一种编码大草蛉卵黄原蛋白基因(csvg)及其所编码的蛋白质。该基因为大草蛉(Chrysopa septempunctata)中的首次报道,为进一步研究大草蛉卵黄原蛋白基因的表达、调控奠定了基础；为研究卵黄原蛋白基因参与大草蛉生殖发育、为该重要天敌昆虫大量繁育和有效利用提供了理论指导；同时该基因功能及其编码产物研究结果也可应用于其他天敌昆虫营养和生殖方面的研究，为天敌昆虫在生物防治以及害虫的综合防治中的利用提供理论基础。
[0011]2.本发明提供了大草蛉卵黄原蛋白基因及其所编码的蛋白质，该卵黄原蛋白基因为脉翅目昆虫中首个被克隆的卵黄原蛋白基因，填补了脉翅目昆虫卵黄原蛋白基因克隆的空白，也为研究大分子进化提供了有用的材料。
[0012]下面将引用非限定性实例对本发明作进一步的说明。
【具体实施方式】
[0013]实例I
[0014]大草蛉卵黄原蛋白Vg基因cDNA的克隆，通过以下步骤进行:从大草蛉羽化雌性成虫中提取总RNA ;然后按clontechS' -RACE试剂盒操作步骤反转录进行cDNA第一链的合成；用简并引物SI和试剂盒引物扩增大草蛉卵黄原蛋白基因3'-末端片段；纯化以上步骤所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pMD19-T simple载体上，然后转化大肠杆菌感受态细 胞ToplO，37°C平板培养，以M13通用引物对阳性克隆子进行PCR检测鉴定；根据克隆测序的结果，设计5' -RACE特异性引物，按照clontech5' -RACE试剂盒操作步骤进行5'-末端序列扩增；纯化步骤所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pMD19-T simple载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，37°C平板培养，以M13通用引物对阳性克隆子进行PCR检测鉴定；根据以上步骤所得的阳性克隆序列测定结果，将所测得基因序列拼接，得到大草蛉卵黄原蛋白基因全长序列。本发明大草蛉卵黄原蛋白基因(csvg)DNA序列SEQ ID N0.1，为脉翅目昆虫中首个被克隆的卵黄原蛋白基因，该基因的序列完整，填补了脉翅目昆虫卵黄原蛋白基因克隆的空白，也为研究大分子进化提供了有用的材料。BLAST的结果证明:该卵黄原蛋白基因为一新基因。本发明提供的大草蛉卵黄原蛋白基因及其所编码的产物可应用于昆虫营养和生殖方面的研究，同时该发明也可以应用于天敌昆虫大量扩繁和工厂化生产。
[0015]实例2
[0016]上述获得的大草蛉(Chrysopa septempunctata)卵黄原蛋白基因csvg的DNA序列SEQ ID NO:1，其编码的蛋白质含有1810个氨基酸，其序列见SEQ ID NO:2。在数据库中比较，卵黄原蛋白基因CSVg编码的蛋白质与数据库中Lethocerus deyrollei>NiIaparvatalugens、Anopheles gambiae 的相似性分别为 49 %>42 %>40 %,与 Pimpla nipponica、Tribolium castaneum 均在 40%之下。
[0017]实例3
[0018]本发明如权利要求1和2所述的应用，利用RNAi干扰研究技术结果表明，干扰大草蛉(Chrysopa septempunctata)卵黄原蛋白基因后，卵黄原蛋白的表达量(表1),产卵总量以及卵孵化率(表2)都受到较大的影响，因此该发明对研究卵黄原蛋白基因在大草蛉中的生理功能具有重大意义。
[0019]表1, RNAi干扰Vg后对转录情况的影响
【权利要求】
1.一种大草蛉卵黄原蛋白基因Vg的CDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所述。
2.如权利要求1所述多核苷酸编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.—种如权利要求1所述的大草蛉卵黄原蛋白基因cDNA克隆方法，包括以下步骤: (1)从大草蛉中提取总RNA，然后反转录合成cDNA； (2)根据全变态昆虫Vg基因保守序列设计简并引物； (3)以步骤⑴得到的cDNA为模板，用步骤⑵所述的引物进行PCR扩增，得到扩增片段； (4)根据3'末端序列的结果，设计5'-RACE特异性引物； (5)按clontechS'-RACE试剂盒操作步骤反转录进行cDNA的合成； (6)以cDNA为模板，PCR扩增大草蛉Vg基因的5'-末端序列； (7)将所述基因的3’和5’端片段拼接，得到权利要求1所述的cDNA。
4.如权利要求1和2所述的应用，其特征在于:应用的材料中包含权利要求1所述的多核苷酸序列或权利要求 2所述的蛋白质，例如利用RNAI干扰研究技术研究卵黄原蛋白基因的生理功能。
【文档编号】C12N15/10GK103966225SQ201310027144
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月25日 优先权日:2013年1月25日
【发明者】曾凡荣, 刘昌燕, 毛建军 申请人:中国农业科学院植物保护研究所