专利名称：与大白菜橙色叶球基因Br-or连锁的SSR及InDel分子标记引物及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于蔬菜育种及分子遗传学领域，具体涉及与大白菜橙色叶球基因Br-OT连锁的SSR及InDel分子标记引物的开发及应用。
背景技术：
大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensis)属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种，是起源于我国的主要蔬菜作物之一，与人们的日常生活密切相关，近年来，随着人们生活水平的提高，人们对大白菜品质的要求日益高涨。因此，大白菜品质育种受到越来越多国内外学者，育种家的重视。申请人:从1993年开始进行橙色大白菜育种，其配置的大白菜一代杂种“金冠I号”和“金冠2号”橙色大白菜，于2004通过陕西省审定，受到国内外的广泛关注，同时也获得了大白菜生产者和消费者的青睐。但是，橙色大白菜的颜色直到其结球末期才能表现出，而且得采用田间逐个剖球观察，操作起来费时费力，极大的延缓了育种进程。因此为了加快橙色大白菜的育种速度，利用现代的分子生物技术，进行分子标记辅助育种十分必要。随着分子生物学技术的快速发展，多种基于DNA多态性的分子技术应运而生，并广泛应用于遗传育种研究的各个领域。简单序列重复(simplesequence repeats, SSR),又称为微卫星DNA (microsatellite，DNA)，是一类由1_6个核苷酸串联重复组成的DNA序列如(CA) n，(ATG) n，(TAGG) η等重复，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，由于重复次数的不同和重复程度的不完全造成了每个位点的多态性，包括SSR标记和EST-SSR标记两种类型。其中，SSR标记具有共显性、重复性好、多态性丰富、易于检测等优点，已广泛应用于植物遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究领域(Tautz and Schlotterer 1994 ；Powell et al.，1996)。
插入/缺失多态性(Insertion/Deletion, InDel)标记是由于同一位点处的DNA序列在不同个体间发生了核苷酸片段的插入/缺失，根据目标位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性即是InDel标记。InDel标记是根据同源序列之间的插入缺失差异来开发的，这对于基因组序列未知的作物而言开发具有一定的难度。InDel标记为一共显性标记，具有较好的稳定性及多态性丰富等优点，已被广泛应用于品种的多态性分析(Katherine et al., 2008)、基因的精细定位及图位克隆(Pan et al.,2008)等。因此，基于以上SSR及InDel标记的优点，申请人利用大白菜的测序结果，开发并成功筛选出与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的分子标记，并构建了 Br-or基因的分子遗传图谱，为克隆该基因及利用该分子标记进行橙色大白菜分子辅助育种，加快育种进程奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物，应用该SSR及InDel分子标记引物，在苗期即可鉴定区分橙色叶球和白色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择的效率。为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案:与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物，其特征在于，包括以下15个Br-SSR引物对和3个Br-1nDel引物对中的至少一对，即可将橙色与白色大白菜区分开；同时使用这多个标记能提高选择的准确性。其中:引物对Br-1nDel (1)的脱氧核糖核苷酸引物序列为:上游引物(F) :5 ; - TGAAATGACCCGTCTGTTGA — 3 ;下游引物(R):5 ; — TTGTCTTGCGAAGAGGATGT — 3 ;引物对Br-1nDel (2)的脱氧核糖核苷酸引物序列为:上游引物(F):5 ; - TCAGATGAAGAGCGTAGGAG — 3 ;下游引物(R):5 ; — AAAAGAGGGAGACAAGATGC — 3 ;引物对Br-1nDel (3)的脱氧核糖核苷酸引物序列为:上游引物(F):5 ; - TTCTTCTTCCTCACGCACTC — 3 ;下游引物(R):5 ; — GCTCGCCTTCTAAACTGAAT — 3 ;引物对Br-SSR (I)的脱氧核糖核苷酸引物序列为:上游引物(F):5 ; - CCATCAACAAACTCAACCCTG — 3 ;下游引物(R):5 ; — CTCTGTTCATAAATACGCCTC — 3 ;引物对Br-SSR (2)的脱氧核糖核苷酸引物序列为:上游引物(F):5 ; - GGTCCGCACAACATATCCTT — 3 ;下游引物(R):5 ' — TTGTAGCGGTGTCTAAGCAG — 3 ;引物对Br-SSR (3)的脱氧核糖核苷酸引物序列为:上游引物(F):5 ; - ACGCTCACCGTGCTTCCTTG — 3 ;下游引物(R):5 ; — TTCACTTTGCCTTTGTTTCT — 3 ;其中所述引物对Br-SSR4的脱氧核糖核苷酸引物序列为:上游引物(F):5 ; - CCACTCCCTGTATTCCTTATC — 3 ;下游引物(R):5 ' — ATCACGTCTACTGGTGCTATG — 3 ;引物对Br-SSR (5)的脱氧核糖核苷酸引物序列为:上游引物(F):5 ; - GTTTGGTCTGTTTCGGCACT — 3 ;下游引物(R):5 ' — GCCAAAACAAATCTGCTTGA — 3 ;所述引物对Br-SSR (6)的脱氧核糖核苷酸引物序列为:上游引物(F):5 ; -GTGGGATTTCTGGAGCTTTCA-3 ;下游引物(R):5 ' — AATCTAAACCTGGACCGCAAC — 3 ;引物对Br-SSR (7)的脱氧核糖核苷酸引物序列为:上游引物(F):5 ; - AAGACACCGTGAGTATCTTCT — 3 ;下游引物(R):5 ; — TTTCGTCTATTCTTGCTGGAT — 3 ;引物对Br-SSR (8)的脱氧核糖核苷酸引物序列为:上游引物(F):5 ; - TGTGAATGTGCGAATTTTGA — 3 ;下游引物(R):
权利要求
1.与大白菜橙色叶球基因Br-OT紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物，其特征在于，包括以下15个Br-SSR引物对和3个Br-1nDel引物对中的至少一对，即可将橙色叶球与白色叶球大白菜区分开；其中: 引物对Br-1nDel (I )，其脱氧核糖核苷酸引物序列为: 上游引物(F):5 ; - TGAAATGACCCGTCTGTTGA - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — TTGTCTTGCGAAGAGGATGT - 3 ;； 引物对Br-1nDel (2)，其脱氧核糖核苷酸引物序列为: 上游引物(F):5 ; - TCAGATGAAGAGCGTAGGAG - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — AAAAGAGGGAGACAAGATGC - 3 ;； 引物对Br-1nDel (3)的脱氧核糖核苷酸引物序列为: 上游引物(F):5 ; - TTCTTCTTCCTCACGCACTC - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — GCTCGCCTTCTAAACTGAAT - 3 ;； 引物对Br-SSR (I )，其脱氧核糖核苷酸引物序列为: 上游引物(F):5 ; - CCATCAACAAACTCAACCCTG — 3 ; 下游引物(R):5 ' — CTCTGTTCATAAATACGCCTC - 3 ;； 引物对Br-SSR (2)，其脱氧核糖核苷酸引物序列为:` 上游引物(F):5 ; - GGTCCGCACAACATATCCTT — 3 ; 下游引物(R):5 ' — TTGTAGCGGTGTCTAAGCAG - 3 ;； 引物对Br-SSR (3)，其脱氧核糖核苷酸引物序列为: 上游引物(F):5 , — ACGCTCACCGTGCTTCCTTG - 3 ;； 下游引物(R):5 ' -TTCACTTTGCCTTTGTTTCT-3 ;； 引物对Br-SSR (4)，其脱氧核糖核苷酸引物序列为: 上游引物(F):5 ; - CCACTCCCTGTATTCCTTATC - 3 ;； 下游引物(R):5 ' -ATCACGTCTACTGGTGCTATG-3 ;； 引物对Br-SSR (5)，其脱氧核糖核苷酸引物序列为: 上游引物(F):5 ; - GTTTGGTCTGTTTCGGCACT - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — GCCAAAACAAATCTGCTTGA - 3 ;； 引物对Br-SSR (6)，其脱氧核糖核苷酸引物序列为: 上游引物(F):5 ; - GTGGGATTTCTGGAGCTTTCA - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — AATCTAAACCTGGACCGCAAC - 3 ;； 引物对Br-SSR (7)，其脱氧核糖核苷酸引物序列为: 上游引物(F):5 ; - AAGACACCGTGAGTATCTTCT - 3 ;； 下游引物(R):5 ' - TTTCGTCTATTCTTGCTGGAT - 3 ;； 引物对Br-SSR (8)，其脱氧核糖核苷酸引物序列为: 上游引物(F):5 ; - TGTGAATGTGCGAATTTTGA - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — TCCTCCTACGCTCTTCATCT - 3 ;； 引物对Br-SSR (9)，其脱氧核糖核苷酸引物序列为: 上游引物(F):5 ; - TTACGCTCAAGTTCCTGAAT - 3 ;； 下游引物(R):5 ' — GCGATGTACGCTAACGAGAT - 3 ;；
2.权利要求1所述的与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物用于大白菜橙色球叶基因克隆及大白菜橙色叶球性状辅助育种中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的大白菜橙色球叶基因克隆的方法是: PCR扩增大白菜基因组DNA的多态性片段大小为150bp、208bp、182bp、122bp、189bp、203bp、193bp、114bp、26 Ibp、168bp、123bp、200bp、175bp、234bp、212bp，分别为与大白菜橙色叶球基因Br-or连锁的分子标记引物Br-SSR (1- 15)的PCR扩增产物；扩增大白菜基因组DNA的多态性片段大小为280bp、152bp、120bp，即为与大白菜橙色叶球基因Br_or连锁的分子标记fc-1nDel (I — 3)的PCR扩增产物；其中，fc-SSR (8 一 15)及fc-1nDel(1- 3)11个标记位于fc-or的一侧，与fc-or的遗传距离分别为0.38cM、0.38cM、0.44cM、0.43cM、l.43cM、l.98cM、2.33cM、2.96cM、0.llcM、0.38cM、l.05cM ；而 Br-SSR (I — 7)7 个标记位于fc-or的另一侧，与fc-or的遗传距离分别为5.01cM、3.llcM、2.57cM、l.17cM、1.17cM、0.79cM、0.79cM，离 fc-or 最近的两侧标记分别为 fc-1nDel (I)和 Br-SSR (6)。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增包括: 20 μ I PCR反应体系为:模板DNA50ng，Taq酶1U，10 μ mol的上、下游引物各0.8 μ 1，·0.32 μ 1flOmM dNTPs，2.0 μ 1f 10 XPCR buffer, 1.2 μ lof25mM MgCl2，用无菌蒸馏水补充反应体系至20 μ I ; PCR反应程序为:先940C，变性5min ;然后94°C，变性30s, 56°C，复性Imin, 72°C，延伸lmin，共30个循环；最后72°C延伸10min，4°C保存。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增产物的检测方法是，将PCR扩增产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后银染显色。
全文摘要
本发明公开了与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物及应用。该标记引物的获得是以橙色大白菜和普通白色大白菜及其F2S4分离群体的基因组DNA为模板，通过480对SSR及InDel引物对F2S4中橙色叶球和白色叶球单株DNA混合池进行多态性引物筛选，然后通过对F2S4群体的单株进行分析，筛选与大白菜橙色叶球基因Br-or连锁的分子标记，成功获得了与Br-or基因连锁的15个Br-SSR及3个Br-InDel标记引物，在第9连锁群上(A09)构建了大白菜橙色叶球基因Br-or的分子遗传图谱。连锁分析发现Br-or基因两侧连锁最紧密两标记的遗传距离分别为0.11cM和0.79cM，具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。为大白菜橙色叶球性状的分子辅助选择育种提供依据，加快育种进程。
文档编号C12Q1/68GK103103184SQ20131003187
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月28日 优先权日2013年1月28日
发明者张鲁刚, 张俊祥, 马晓彤, 李会霞, 张明科, 惠麦侠 申请人:西北农林科技大学