专利名称：一株产聚β-羟基丁酸酯细菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于应用微生物领域，涉及一株产聚β-羟基丁酸酯细菌及其应用。
背景技术：
传统石油产品来源的塑料制品广泛使用，但废弃的化学塑料由于不能被微生物分解，带来了严重的“白色污染”。聚β_羟基丁酸(PHB)酯是部分细菌细胞内利用常规碳源积累的一种能被微生物降解的一种高分子聚合物，是细胞内的能量和碳源物质。PHB可以加工处理作为一种生物合成塑料，不仅具有化学合成塑料的特性，还具有高度可生物降解性、生物组织相容性、压电性和抗凝血性等优点，可望在电子、光学、生物医学等高技术领域获得应用。能合成聚β —羟基丁酸的微生物分布极广，包括光能和化能自养微生物和异养微生物共计65个属300多种微生物。这些微生物能利用葡萄糖、蔗糖或淀粉的水解物等不同的碳源合成聚β —羟基丁酸酯。但是很多碳源价格比较昂贵，使生产聚β —羟基丁酸酯的成本升高，为了降低生产PHB的成本必须找到更便宜，更方便的碳源物质，而淀粉来源广泛，大部分来自于植物，成本低廉，能够长期满足生产聚β —羟基丁酸酯的需要。因此，以淀粉为单一碳源生产聚β —羟基丁酸酯的微生物在生物塑料的生产中具有更高的潜在应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一株以淀粉为唯一碳源的生产多聚β_羟基丁酸酯新菌株Aquabacterium sp.A7_Y。本发明的另一目的是提供该菌株的应用。一株聚β-羟基丁酸酯产生菌Aquabacterium sp.Α7-Υ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年8月27日，保藏编号为CCTCC NO:M2012316，以下简称A7-Y菌株。本发明所述的聚β -轻基丁酸酯产生菌Aquabacterium sp.Α7-Υ在生产聚β-轻基丁酸酯中的应用，特别是在以淀粉为唯一碳源生产聚β_羟基丁酸酯中的应用。利用所述的聚β -轻基丁酸酯产生菌Aquabacterium sp.A7_Y产生聚β-轻基丁酸酯的方法，利用改良的HV培养基对权利要求1所述的聚β_羟基丁酸酯产生菌Aquabacterium sp.A7_Y进行发酵，所述的改良的HV培养基的成分是:淀粉10g/L,NaNO30.5g/L, KCll.5g/L, Na2HPO40.75g/L, MgSO40.5g/L, FeSO40.02g/L, CaCl20.02g/L,pH=6.5-7.00有益效果:本发明提供了一株产聚β —羟基丁酸酯的菌株，本发明中聚β —羟基丁酸酯的生产能够以淀粉为唯一碳源，发酵生产培养配方简单，原料来源广泛、价格低，发酵周期短，耗能低，从而大幅降低了聚β —羟基丁酸酯生产成本。
图1 基于 16s rDNA 序列的 Aquabacterium.sp A7-Y 系统进化树图2Aquabacterium.sp A7-Y 在 HV 平板生长:透射电镜形态(5000 X )图3Aquabacterium.sp A7-Y HV平板生长透射电镜下产PHB情况(4000 X )生物材料保藏信息Aquabacterium sp.A7-Y，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年8月27日，保藏地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2012316。
具体实施例方式实施例11.菌种分离土壤样品采集于安徽省，首先用采样铲去表层土，用取样器取深度为10-30cm的土样，装入牛皮纸袋中。室温下风干IOd,称取5克土壤加入到IOOmL无菌水中制成土壤悬液，在土壤悬浮液中加6%酵母膏以及0.05%SDS并在40°C摇床上振荡培养20min，取ImL分别稀释10倍，100倍和1000倍，分别取0.1mL各稀释度的稀释液涂布改良HV平板(淀粉10g/L, NaNO30.5g/L, KCll.5g/L, Na2HPO40.75g/L, MgSO40.5g/L, FeSO40.02g/L, CaCl20.02g/L,琼脂16g/L，pH=6.5-7.0)，置于27°`C培养箱培养5天，将平板上单菌落用无菌接种环及时转接到HV平板培养基上，再继续培养，待培养出单菌落，使用苏丹黑染色，挑取染色后细胞呈黑色的为产PHB菌株。根据其胞内PHB的充盈程度确定其中菌株A7-Y是产PHB能力较好的菌株。采用HV液体培养基培养A7-Y，37°C震荡培养2天后，IOOOOrpm离心收集菌体，采用常见的氯仿抽提法提取A7-Y所产PHB，经核磁共振(NMR)，红外光谱、气相色谱-质谱联机测定等手段，确定A7-Y所产胞内聚合物为PHB。2.菌种鉴定(I) 16S rRNA 基因分析提取菌株A7-Y基因组DNA，采用细菌的16S r DNA通用引物(27f:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；1492r:5’ -TACCTTGTTACGACTT-3’)扩增 16S rRNA 基因并纯化测序，序列测定结果通过EzTaxon server2.1进行相似性比较。序列分析结果表明:菌株A7-Y的16S rRNA的核苷酸序列为SEQ ID N0.1。核苷酸序列相似性高于 97%,为 Aquincola tertiaricarbonis LlOT (相似度 97.105%,genbank号为DQ656489)，进一步将该菌株与同源性较高的50个菌株的16S rDNA进行序列比对，利用ClustalX(Versionl.83)和MEGA4.1软件进行多序列比对及系统发育树构建，用Neighbor-Join法，1000次，得到系统进化发育树，结果显示(图1):菌株A7-Y聚类到Aquabacterium 属的，是其一个新种，以此命名为 Aquabacterium sp.A7-Y。(2)菌株A7-Y形态特征及生理生化特性将菌株A7-Y与Aquabacterium属各个已鉴定菌株进行比较。形态特征按照《常见细菌系统鉴定手册》描述进行(图1)。生理生化按照ZYM、API20NE (法国梅里埃)说明书进行。DNA (G+C)mol%含量测定委托中国工业微生物菌种保藏管理中心完成。Aquabacterium sp.A7-Y为革兰氏染色阴性,菌落表面干燥并突起,相互粘连不易散开，轻度坚硬不易被接种环挑起，白色(见图2)。菌体杆状，有内含物，有运动能力(见图3)。根据ZYM结果:可以利用的碱性磷酸酯酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(CS)、类脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-B1-磷酸水解酶、α -葡萄糖苷酶、β -葡萄糖苷酶；根据ΑΡΙ20ΝΕ实验结果:硝酸盐还原阳性，氧化酶阳性、过氧化氢酶阳性、可以水解七叶苷、明胶、同化葡萄糖、麦芽糖等，其中与Aquabacterium属的5株菌及Aquincola tertiaricarbonis LlOT比较的生理生化具体情况如表I。表I与同源关系相近菌属生理生化特性比较
权利要求
1.株聚β-羟基丁酸酯产生菌Aquabacterium sp.Α7_Υ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年8月27日，保藏编号为CCTCC NO:Μ2012316。
2.权利要求1所述的聚β-轻基丁酸酯产生菌Aquabacterium sp.Α7_Υ在生产聚β_羟基丁酸酯中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于权利要求1所述的聚β-羟基丁酸酯产生菌Aquabacterium sp.Α7_Υ在以淀粉为唯一碳源生产聚β_轻基丁酸酯中的应用。
4.用权利要求1所述的聚β-轻基丁酸酯产生菌Aquabacterium sp.Α7_Υ产生聚β -羟基丁酸酯的方法，其特征在于利用改良的HV培养基对权利要求1所述的聚β -羟基丁酸酯产生菌Aquabacterium sp.A7_Y进行发酵,所述的改良的HV培养基的成分是:淀粉10g/L, NaNO30.5g/L, KCll.5g/L, Na2HPO40.75g/L, MgSO40.5g/L, FeSO40.02g/L, CaCl20.02g/L, pH =6.5-7.00
全文摘要
本发明属于应用微生物领域，涉及一株产聚β-羟基丁酸酯细菌及其应用。一株聚β-羟基丁酸酯产生菌Aquabacterium sp.A7-Y，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年8月27日，保藏编号为CCTCC NOM2012316，以下简称A7-Y菌株。本发明所述的聚β-羟基丁酸酯产生菌Aquabacterium sp.A7-Y可在以淀粉为唯一碳源生产聚β-羟基丁酸酯中的应用。
文档编号C12N1/20GK103087965SQ201310041368
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者崔中利, 冯丽, 孙志斌, 黄艳 申请人:南京农业大学