专利名称：三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法及基因工程菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及乙醇的生物制备领域，具体地涉及三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法及基因工程菌株。
背景技术：
随着人类文明的不断进步，全球能源问题彰显，现已成为制约全球经济持续稳定发展的重要因素。燃料乙醇是一种清洁、可再生的生物质能源，纤维素燃料乙醇技术原料来源广泛，是一项可持续发展的环境友好型技术，其核心技术体系的建设已成为一个全球能源战略必争之地。木质纤维素分解之后主要转化为葡萄糖和木糖，葡萄糖和木糖在厌氧条件下经酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵生成乙醇。本发明旨在以木质纤维生物质为原料，对经过多重基因改良获得酿酒酵母工程菌株进行发酵获得的纤维素乙醇关键技术进行系统地研究，通过筛选并获得一系列优化的高产和高效率的纤维素乙醇目标菌株，为纤维素乙醇商业化生产奠定技术基础。木糖发酵时先经木糖还原酶基因XR,木糖醇脱氢酶基因XDH，木酮糖激酶基因XK连续催化生成5-磷酸-木酮糖，然后在磷酸戊糖途径主要基因RPE1，RKII, TALI, TKLl催化作用下进入糖酵解途径，最后转化为乙醇。在上述发酵过程中，目前许多研究者对XR进行蛋白工程，例如单突变体XR (K270R)和四突变体XR (K270S/N272P/S271G/R276F)，希望通过调节XR的氧化还原水平来提高木糖的消耗速率。有一些研究者对木糖利用代谢途径关键基因XR/XDH/XK/TAL1中的一个或者两个进行不同拷贝的探索，期望更有效的提高木糖和葡萄糖的利用率。现有技术研究表明木糖乙醇发酵过程中大部分基因的转录水平发生了显著改变，因此转录调控是进一步提高乙醇产量的有效途径。现有基因转录调控技术主要是通过经典的组成型强启动子PGKl和ADHl来介导上述重要的七基因转录，期望提高七基因的表达水平，从而实现纤维素乙醇产量的提高。但上述现有技术改造的酿酒酵母工程菌株发酵木糖时生长速率缓慢，乙醇产量及转化率偏低，乙醇的产量水平在0.36-0.42g/g总糖。然而，基因转录调控技术带来的基因工程发酵代谢过程中的质粒负担，代谢负担，各种环境压力响应都有可能影响最终的乙醇产量和产率，这是该研究技术的不确定性。同时木糖利用的低消耗速率，低转化速率，尽管研究者尝试了不同的启动子，不同的拷贝数目，不同的微生物菌株背景来源，不同的基因蛋白工程，都没有改变纤维素乙醇技术目前面临的瓶颈和难点。
发明内容
因此为了解决上述问题提出并完成了本发明。本发明的首要目的是提供三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法。本发明的另一目的是提供三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的基因工程菌株。根据本发明的三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法包括通过构建基因XR、XDH、XK、RPEl、RKIl和TALl的表达质粒，在酿酒酵母中表达上述基因的步骤，其中，用KGDl启动子介导限速基因XK，用HSP26启动子介导关键限速基因TALl。根据本发明具体实施方式
，所述三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法包括步骤:(1)将质粒p61转入酿酒酵母WT，得到WXY1，其菌株含有两基因pADHl-RPEl和pPGKl-XDH,质粒p61的构建过程:721bp的启动子克隆进入pbluescript,接下来71bp7的ADHl 启动子，434bp 的 PGKl 终止子，410bp 的 RPEl 启动子，629bp (自 ATG 起 629bp)的 RPEl结构基因一部分，XDH结构基因，选择标记RKUR，依次克隆进来，形成质粒p61 ；(2)将质粒p62转入WXYl，得到WXY2，该菌株额外含有pADHl_XR和pPGKl_XK，质粒P62的构建过程:在上述p61质粒的基础上，500bp的XK启动子替换RPEl启动子，419bp(自ATG起419bp)的XK结构基因一部分替换RPEl结构基因一部分(自ATG)，含有四个突变的 xRk27cis/n272P/S271G/R276F 替换 XDH 结构基因，形成质粒 P62 ；(3)将质粒p64转入WXY2，得到WXY3，该菌株额外含有多拷贝的pPGKl-RKIl和pADHl-TALl，并且该菌株能初步利用木糖产生乙醇，质粒p64的构建过程:用717的ADHl启动子替换PESC-LEU中的反向启动子PGAL10/PGAL1，接下来72Ibp的PGKl启动子，选择标记Zeocin, 1723bp的r DNA，TALl和RKIl结构基因依次克隆进来，形成质粒p64 ；(4)将质粒pUC-3XK270R转入酿酒酵母WT，得到WXY4，该菌株含有三基因pADH1-XR/pPGK1-XDH/pPGK1-XK,能初步利用木糖产生乙醇；将质粒pUC_3XK270R转入WXY3，得到WXY5，该菌株能很好地利用木糖，产生更多的乙醇；(5) pv3质粒的构建过程如下:首先将TALl结构基因连接在pBluscript原始质粒上，接下来依次将启动子CRE1，启动子KGDlr，XK-ORFr，选择标记基因RUR结构，启动子HSP26r，终止子CREl克隆进来，形成pv3质粒，其表型见表I，整合插入位点为CREl结构基因，被分别转进WXY3和WXY5，得到了工程菌株WXY6和WXY7 ；(6)将pUC_3X(野生型XR)分别转入酵母菌株酿酒酵母WT，WXY3，WXY6，分别得到工程菌株 WXY8，WXY9, WXYlO。根据本发明的具体实施方式
，以安琪酵母公司的工业酿酒酵母YC-DM拆分孢子获得的单倍体菌株为出发菌株WT，首先构建了一个能够有效利用木糖的工程菌株即WXY3，含有 XRK27as/N272P/s27iG/R276F/XDH/XK/RpE1/RKn/TAL1。在此基础上，进一步转入了一个已验证过
的质粒PUC-3XK270R含有木糖利用三基因XRK27°7XDH/XK，得到了工程菌株WXY5，此即第一阶段葡萄糖阶段。接下来以WXY5为研究对象，委托深圳华大基因对其在高浓度混合糖发酵过程中的4小时，24小时和48小时进行了 RNA-Seq分析。根据发表的DNA芯片数据，获得RNA-seq的绝对表达量RPKM，我们自己验证的RT-qPCR数据，筛选获得了好氧状态下的启动子K⑶I和发酵后期的热休克启动子HSP26。用KGDl启动子介导限速基因)(K，HSP26启动子介导关键限速基因TAL1，构建了质粒pv3，含有木糖阶段和热休克阶段。将pv3转入WXY5，得到了一个有良好发酵特征的WXY7。用PUC-3X替换WXY7中的pUC_3XK270R，得到了阶段性的高产乙醇工程菌株WXY10，该菌株在5% (木糖+葡萄糖)厌氧发酵过程中，6小时消耗完了葡萄糖，大概60小时左右消耗完了木糖，乙醇转化率达到了 0.48g乙醇/g总糖。根据本发明的三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的基因工程菌株其保藏编号为 CGMCC N0.7191。根据本发明的技术方案，其中所用木糖还原酶基因XR的序列如SEQ ID N0.1所示:atgccttctattaagttgaa ctctggttacgacatgccagccgtcggtttcggctgttggaaagtcgacgtcgacacctgttctgaacagatctaccgtgctatcaagaccggttacagattgttcgacggtgccgaagattacgccaacgaaaagttagttggtgccggtgtcaagaaggccattgacgaaggtatcgtcaagcgtgaagacttgttccttacctccaagttgtggaacaactaccaccacccagacaacgtcgaaaaggccttgaacagaaccctttctgacttgcaagttgactacgttgacttgttcttgatccacttcccagtcaccttcaagttcgttccattagaagaaaagtacccaccaggattctactgtggtaagggtgacaacttcgactacgaagatgttccaattttagagacctggaaggctcttgaaaagttggtcaaggccggtaagatcagatctatcggtgtttctaacttcccaggtgctttgctcttggacttgttgagaggtgctaccatcaagccatctgtcttgcaagttgaacaccacccatacttgcaacaaccaagattgatcgaattcgctcaatcccgtggtattgctgtcaccgcttactcttcgttcggtcctcaatctttcgttgaattgaaccaaggtagagctttgaacacttctccattgttcgagaacgaaactatcaaggctatcgctgctaagcacggtaagtctccagctcaagtcttgttgagatggtcttcccaaagaggcattgccatcattccaaagtccaacactgtcccaagattgttggaaaacaaggacgtcaacagcttcgacttggacgaacaagatttcgctgacattgccaagttggacatcaacttgagattcaacgacccatgggactgggacaagattcctatcttcgtctaa木糖醇脱氢酶基因XDH的序列如SEQ ID N0.2所示:atgactgctaacccttccttggtgttgaacaagatcgacgacatttcgttcgaaacttacgatgccccagaaatctctgaacctaccgatgtcctcgtccaggtcaagaaaaccggtatctgtggttccgacatccacttctacgcccatggtagaatcggtaacttcgttttgaccaagccaatggtcttgggtcacgaatccgccggtactgttgtccaggttggtaagggtgtcacctctcttaaggttggtgacaacgtcgctatcgaaccaggtattccatccagattctccgacgaatacaagagcggtcactacaacttgtgtcctcacatggccttcgccgctactcctaactccaaggaaggcgaaccaaacccaccaggtaccttatgtaagtacttcaagtcgccagaagacttcttggtcaagttgccagaccacgtcagcttggaactcggtgctcttgttgagccattgtctgttggtgtccacgcctctaagttgggttccgttgctttcggcgactacgttgccgtctttggtgctggtcctgttggtcttttggctgctgctgtcgccaagaccttcggtgctaagggtgtcatcgtcgttgacattttcgacaacaagttgaagatggccaaggacattggtgctgctactcacaccttcaactccaagaccggtggttctgaagaattgatcaaggctttcggtggtaacgtgccaaacgtcgttttggaatgtactggtgctgaaccttgtatcaagttgggtgttgacgccattgccccaggtggtcgtttcgttcaagtcggtaacgctgctggtccagtcagcttcccaatcaccgttttcgccatgaaggaattgactttgttcggttctttcagatacggattcaacgactacaagactgctgttggaatctttgacactaactaccaaaacggtagagaaaatgctccaattgactttgaacaattgatcacccacagatacaagttcaaggacgctattgaagcctacgacttggtcagagccggtaagggtgctgtcaagtgtctcattgacggccctgagtaa介导限速基因XK的序列如SEQ ID N0.3所示:atgttgtgttcagtaattcagagacagacaagagaggtttccaacacaatgtctttagactcatactatcttgggtttgatctttcgacccaacaactgaaatgtctcgccattaaccaggacctaaaaattgtccattcagaaacagtggaatttgaaaaggatcttccgcattatcacacaaagaagggtgtctatatacacggcgacactatcgaatgtcccgtagccatgtggttagaggctctagatctggttctctcgaaatatcgcgaggctaaatttccattgaacaaagttatggccgtctcagggtcctgccagcagcacgggtctgtctactggtcctcccaagccgaatctctgttagagcaattgaataagaaaccggaaaaagatttattgcactacgtgagctctgtagcatttgcaaggcaaaccgcccccaattggcaagaccacagtactgcaaagcaatgtcaagagtttgaagagtgcataggtgggcctgaaaaaatggctcaattaacagggtccagagcccattttagatttactggtcctcaaattctgaaaattgcacaattagaaccagaagcttacgaaaaaacaaagaccatttctttagtgtctaattttttgacttctatcttagtgggccatcttgttgaattagaggaggcagatgcctgtggtatgaacctttatgatatacgtgaaagaaaattcagtgatgagctactacatctaattgatagttcttctaaggataaaactatcagacaaaaattaatgagagcacccatgaaaaatttgatagcgggtaccatctgtaaatattttattgagaagtacggtttcaatacaaactgcaaggtctctcccatgactggggataatttagccactatatgttctttacccctgcggaagaatgacgttctcgtttccctaggaacaagtactacagttcttctggtcaccgataagtatcacccctctccgaactatcatcttttcattcatccaactctgccaaaccattatatgggtatgatttgttattgtaatggttctttggcaagggagaggataagagacgagttaaacaaagaacgggaaaataattatgagaagactaacgattggactctttttaatcaagctgtgctagatgactcagaaagtagtgaaaatgaattaggtgtatattttcctctgggggagatcgttcctagcgtaaaagccataaacaaaagggttatcttcaatccaaaaacgggtatgattgaaagagaggtggccaagttcaaagacaagaggcacgatgccaaaaatattgtagaatcacaggctttaagttgcagggtaagaatatctcccctgctttcggattcaaacgcaagctcacaacagagactgaacgaagatacaatcgtgaagtttgattacgatgaatctccgctgcgggactacctaaataaaaggccagaaaggactttttttgtaggtggggcttctaaaaacgatgctattgtgaagaagtttgctcaagtcattggtgctacaaagggtaattttaggctagaaacaccaaactcatgtgcccttggtggttgttataaggccatgtggtcattgttatatgactctaataaaattgcagttccttttgataaatttctgaatgacaattttccatggcatgtaatggaaagcatatccgatgtggataatgaaaattgggatcgctataattccaagattgtccccttaagcgaactggaaaagactctcatctaa基因R削I的序列如SEQ ID N0.4所示:atggctgccggtgtcccaaaaattgatgcgttagaatctttgggcaatcctttggaggatgccaagagagctgcagcatacagagcagttgatgaaaatttaaaatttgatgatcacaaaattattggaattggtagtggtagcacagtggtttatgttgccgaaagaattggacaatatttgcatgaccctaaattttatgaagtagcgtctaaattcatttgcattccaacaggattccaatcaagaaacttgattttggataacaagttgcaattaggctccattgaacagtatcctcgcattgatatagcgtttgacggtgctgatgaagtggatgagaatttacaattaattaaaggtggtggtgcttgtctatttcaagaaaaattggttagtactagtgctaaaaccttcattgtcgttgctgattcaagaaaaaagtcaccaaaacatttaggtaagaactggaggcaaggtgttcccattgaaattgtaccttcctcatacgtgagggtcaagaatgatctattagaacaattgcatgctgaaaaagttgacatcagacaaggaggttctgctaaagcaggtcctgttgtaactgacaataataactteattatcgatgcggatttcggtgaaatttccgatccaagaaaattgcatagagaaatcaaactgttagtgggcgtggtggaaacaggtttattcatcgacaacgcttcaaaagcctacttcggtaattctgacggtagtgttgaagttaccgaaaagtga`
基因RPEl的序列如SEQ ID N0.5所示:atggtcaaaccaattatagctcccaggtatccttgcttctgacttcgccaacttgggttgcgaatgtcataaggtcatcaacgccggcgcagattggttacatatcgatgtcatggacggccattttgttccaaacattactctgggccaaccaattgttacctccctacgtcgttctgtgccacgccctggcgatgctagcaacacagaaaagaagcccactgcgttcttcgattgtcacatgatggttgaaaatcctgaaaaatgggtcgacgattttgctaaatgtggtgctgaccaatttacgttccactacgaggccacacaagaccctttgcatttagttaagttgattaagtctaagggcatcaaagctgcatgcgccatcaaacctggtacttctgttgacgttttatttgaactagctcctcatttggatatggctcttgttatg
actgtggaacctgggtttggaggccaaaaattcatggaagacatgatgccaaaagtggaaactttgagagccaagtt
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ttattgtcgctggtaccagtgttttcactgcagctgacccgcacgatgttatctccttcatgaaagaagaagtctcg
aaggaattgcgttctagagatttgctagattag:基因TALl的序列如SEQID N0.6所示:atgtctgaaccagctcaaaagaaacaaaaggttgctaacaactctctagaacaattgaaagcctccggcactgtcgttgttgccgacactggtg atttcggctctattgccaagtttcaacctcaagactccacaactaacccatcattgatcttggctgctgccaagcaaccaacttacgccaagttgatcgatgttgccgtggaatacggtaagaagcatggtaagaccaccgaagaacaagtcgaaaatgctgtggacagattgttagtcgaattcggtaaggagatcttaaagattgttccaggcagagtctccaccgaagttgatgctagattgtcttttgacactcaagctaccattgaaaaggctagacatatcattaaattgtttgaacaagaaggtgtctccaaggaaagagtccttattaaaattgcttccacttgggaaggtattcaagctgccaaagaattggaagaaaaggacggtatccactgtaatttgactctattattctccttcgttcaagcagttgcctgtgccgaggcccaagttactttgatttccccatttgttggtagaattctagactggtacaaatccagcactggtaaagattacaagggtgaagccgacccaggtgttatttccgtcaagaaaatctacaactactacaagaagtacggttacaagactattgttatgggtgcttctttcagaagcactgacgaaatcaaaaacttggctggtgttgactatctaacaatttctccagctttattggacaagttgatgaacagtactgaacctttcccaagagttttggaccctgtctccgctaagaaggaagccggcgacaagatttcttacatcagcgacgaatctaaattcagattcgacttgaatgaagacgctatggccactgaaaaattgtccgaaggtatcagaaaattctctgccgatattgttactctattcgacttgattgaaaagaaagttaccgcttaa本发明拟采用DNA芯片及qRT-PCR方法对酵母细胞在葡萄糖发酵阶段，木糖发酵阶段包括发酵后期等不同阶段的转录组表达谱进行构建。针对不同代谢阶段发现的转录水平大幅上调的特征基因，拟利用其启动子驱动木糖代谢中相关目标基因XR，XDH，XKS1，TAL1在相应阶段继续进行高水平表达，以使目标基因在发酵的各阶段都能持续高效表达。酵母在混合糖发酵的前期及对数生长期优先利用葡萄糖，本发明根据RT-PCR筛选并确认了厌氧状态下强启动子pPGKl，pADHl。当葡萄糖耗尽后，本发明筛选了 TCA中代谢转录水平发生较大改变的基因的启动子，用来调控具有呼吸特征的木糖基因转录，确定了木糖发酵状态下强启动子有PKGD1。发酵后期也称应激阶段，其中环境温度上升5°C引起的热休克效应对乙醇产量变化非常明显。将筛选获得的热休克蛋白强启动子pHSP26，pHSP70整合到目标基因上，以增强酵母细胞对发酵后期不利环境的抗性和适应性，提前到达发酵终点。总之，本发明通在葡萄糖阶段，木糖阶段及发酵后期阶段引入强启动子来优化乙醇的生物合成途径中目标基因的转录调控，并通过调控靶点基因mRNA转录水平这一核心思路解决发酵中后期的代谢瓶颈。因此，本发明相对于现有技术的改进和优点如下:本发明将纤维素酒精发酵过程分为厌氧的葡萄糖发酵阶段，好氧的木糖呼吸代谢阶段，具有热休克特征的高温抑制为主的发酵后期阶段，共三个阶段。针对现有基因工程菌株的具体问题，本发明提出在三个阶段用上述各阶段筛选出的目标基因转录上调的特征启动子全面启动木糖利用的七基因或者主要基因的转录调控，让目标基因在三个阶段的每一个阶段都能得到高效的表达，从而让纤维素底物更加高效地转化为纤维素乙醇。综上所述，我们提出了这样的三阶段转录调控理论(three stage transcription regulations,简称为 TSTR)。本理论的创新点及改进之处:1第一次优化总结并提出了三阶段转录调控关键基因提高纤维素乙醇产量的理论体系；2第一次将热休克启动子HSP26和TCA循环启动子KGDl等相关启动子用于介导木糖利用的关键基因XR/XDH/XK/TAL1提高乙醇的产量；3本发明实现了通过快速耗尽葡萄糖来降低葡萄糖在乙醇发酵过程中对木糖的代谢抑制；4我们构建的工程菌株WXYlO在各5%左右的混合糖发酵过程中，60小时左右实现了 0.48g乙醇/g总糖的糖醇转化率，达到了理论最大值的94%，具有一定的工业化潜力，处于国内外前沿水平。
附图 说明
图1显示了在45g/L (葡萄糖+木糖)厌氧发酵各时间段各酵母菌株WT⑷，WXY3⑶，WXY4 (C)，WXY5⑶的乙醇代谢图谱。图2显示对TCA循环基因和HSP家族基因考察的结果，在50g/L (葡萄糖+木糖)厌氧发酵各时间段各酵母菌株的乙醇代谢图谱。图3显示为菌株发酵结果，在45g/L和50g/L (葡萄糖+木糖)厌氧发酵各时间段各酵母菌株的乙醇代谢图谱。图4为WXY7和WXYlO在50g/L葡萄糖和50g/L木糖的培养基下进行发酵的结果。图5显示各菌株在￥^)培养基中发酵12小时，菌株訂1乂￥(3-54)和1乂￥(6，7，10, B)的基因XR/XDH/XK/TAL1的相对转录水平。酿酒酵母WXYlO (Saccharomyces cerevisiae),于 2013 年 I 月 23 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是:CGMCC N0.7191。
具体实施例方式实施例11、混合糖共发酵菌株的构建出发菌株WT来自安琪酵母公司的酿酒酵母工业菌株，经过从工业二倍体拆分孢子转化为单倍体，经过发酵筛选具有更好发酵特性的优势菌株，作为我们试验的原始工业出发菌株。将质粒p61转入WT，得到WXY1，其菌株含有两基因pADHl-RPEl和pPGKl_XDH ；将质粒P62转入WXY1，得到WXY2，该菌株额外含有pADHl_XR4m和pPGKl_XK ;将质粒p64转入WXY2，得到WXY3，该菌株额外含有多拷贝的pPGKl-RKIl和pADHl_TALl，并且该菌株能初步利用木糖产生乙醇；将质粒PUC-3XK270R转入WT，得到WXY4，该菌株含有三基因pADHl-XR(K270R)/pPGKl-XDH/pPGKl-XK,能初步利用木糖产生乙醇；将质粒 pUC_3XK270R转入WXY3，得到WXY5，该菌株能很好地利用木糖，产生更多的乙醇。图1显示了工程菌株WT和WXY (3-5)在约45克/升葡萄糖和45g/L的木糖培养基的发酵结果。WT菌株在24小时后，消耗完了 43.5g/L的葡萄糖，在发酵结束后利用了约8g/L (17.8%)木糖，产生了约21.4g/L的乙醇和2.7g/L的木糖醇(图1A)。WXY4在24小时内完全消耗43.5g/L的葡萄糖，在发酵结束时利用了约16g/L (35.7%)的木糖，产生了 26.4g/L的乙醇和1.7g/L木糖醇(图1C)。发酵结束后，菌株WXY3和WXY5消耗了 16.2(36%)和31.4 (70.l%)g/L的木糖，产生了 3.0和1.5g/L木糖醇，并产生较高的25.1和34.2g/L的乙醇，分别为(图1B和D)。与WT和WXY3菌株相比，WXY4和WXY5拥有更多的细胞数量(图1E)。相关的菌株基因型和发酵数据也参见表I和表2。与发表的工业菌株基因修饰策略相比，本发明在整体水平上，特别是关键基因拷贝数量进行了优化通过RT-PCR证实了基因拷贝数目的增加及相关基因得到了相对高的表达量:WXY5有两拷贝突变体XR(K270R)和 XR (K270S/N272P/S271G/R276F)，两拷贝野生型 XDH，两拷贝 XK，多拷贝 TALl 及其他相关基因。厌氧批发酵结果显示，混合糖到乙醇的转化率为0.39g/g总糖。
表I质粒
权利要求
1.一种三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法，其特征在于，所述方法包括通过构建基因XR、XDH、XK、RPEl、RKIl和TALl的表达质粒，在酿酒酵母中表达上述基因的步骤，其中，用KGDl启动子介导限速基因》(，用HSP26启动子介导关键限速基因TALl。
2.根据权利要求1所述的三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法，其特征在于，对于基因XDH使用启动子pPGKl，对于基因RPEl使用启动子pADHl，对于RKII使用启动子PGKl，对于基因XR使用启动子pADHl。
3.根据权利要求1所述的三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法，其特征在于，基因XR的序列如SEQ ID N0.1所示，基因XDH的序列如SEQ ID N0.2所示，基因XK的序列如SEQ ID N0.3所示，基因RKIl的序列如SEQ ID N0.4所示，基因TALl的序列如SEQID N0.6 所示。
4.根据权利要求1所述的三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法，其特征在于，所述方法包括步骤: Cl)将质粒p61转入酿酒酵母WT，得到WXY1，其菌株含有两基因pADHl-RPEl和pPGKl-XDH ； (2)将质粒p62转入WXYl，得到WXY2，该菌株额外含有pADHl_XR和pPGKl_XK ； (3 )将质粒p64转入WXY2，得到WXY3，该菌株额外含有多拷贝的pPGKl-RKI I和pADHl-TALl，并且该菌株能初步利用木糖产生乙醇； (4)将质粒pUC-3XK转入酿酒酵母WT，得到WXY4，该菌株含有三基因pADHl_XR/pPGKl-XDH/pPGKl-XK，能初步利用木糖产生乙醇；将质粒pUC_3XK转入WXY3，得到WXY5，该菌株能很好地利用木糖，产生更多的乙醇； (5)pv3质粒的构建过程如下:首先将TALl结构基因连接在pBluscript原始质粒上，接下来依次将启动子CREl，启动子KGDIr，XK-ORFr，选择标记基因RUR结构，启动子HSP26r，终止子CREl克隆进来，形成pv3质粒，其表型见表I，整合插入位点为CREl结构基因，被分别转进WXY3和WXY5，得到了工程菌株WXY6和WXY7 ； (6)将pUC-3X(野生型XR)分别转入酵母菌株酿酒酵母WT，WXY3，WXY6，分别得到工程菌株 WXY8，WXY9, WXYlO。
5.三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的基因工程菌株，其保藏编号为:CGMCCN0.7191。
6.一种通过生物发酵制备乙醇的方法，其特征在于，所述方法包括发酵菌株CGMCCN0.7191的步骤。
全文摘要
本发明涉及乙醇的生物制备领域，具体地涉及三阶段基因转录调控提高纤维素乙醇产量的方法及基因工程菌株。所述方法包括通过构建基因XR、XDH、XK、RPE1、RKI1和TAL1的表达质粒，在酿酒酵母中表达上述基因的步骤，其中，用KGD1启动子介导限速基因XK，用HSP26启动子介导关键限速基因TAL1。本发明将纤维素酒精发酵过程分为厌氧的葡萄糖发酵阶段，好氧的木糖呼吸代谢阶段，具有热休克特征的高温抑制为主的发酵后期阶段，共三个阶段。让目标基因在三个阶段的每一个阶段都能得到高效的表达，从而让纤维素底物更加高效地转化为纤维素乙醇。
文档编号C12R1/865GK103146741SQ20131004134
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者萧伟, 曹利民, 汤兴良, 田雪蕾 申请人:首都师范大学