专利名称：一种从神秘果中提取神秘素的方法
技术领域：
本发明涉及神秘果神秘素的高效提取和神秘果果汁饮料的制备，具体涉及一种从神秘果中提取神秘素的方法。
背景技术：
神秘果(Richadella dulcifica)属山榄科神秘果属，为常绿灌木植物,原产西非热带地区，自然分布在西非刚果一带。我国于60年代引入种植，在海南、云南、广西等热带亚热带地区生长良好。神秘果的神秘之处在于可将酸性食物在数小时内变成甜味，经研究证明该变味成分为糖蛋白，称为神秘素(Miraculin)。因此,可将其神秘素制成酸性食品的助食剂，也可制成满足糖尿病人对甜味需要的变味剂。然而，神秘果皮薄多汁，果实成熟期气温较高，空气湿度大，采摘后的鲜果在自然条件下极易变软腐烂。而神秘素对环境的要求更是苛刻，在o°c以上和中碱性条件下容易失活。而且神秘素本身难溶于水，与神秘果体内多种成分紧密相连，增加了其提升难度。由于神秘素的特殊性质，许多科研工作者早在20世纪60年代就开始神秘素活性成分的提取和分离纯化的工作。目前常用的提取分离纯化的方法有透析法、离心分离法、溶剂沉淀法和色谱法等。如Kurihara等人在1968年采用pH 10.5的碳酸盐缓冲液从冷冻干燥的神秘果肉中提取出活性成分；经过多年的研究后，在1982年又提出采用不同饱和度的硫酸铵分级沉淀，透析脱盐后再采用柱分离，获取较纯神秘素的方法，但该操作工艺复杂，活性成分回收率低。Inglett依次采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯、无水乙醇和水对冻干果肉进行提取，然后离心分离得到较高活性的淡黄色粉末；该学者又将冻干果肉用水搅拌后离心分离，然后依次用含水乙醇、无水乙醇、丙酮、氯仿、η-己烷对沉淀物进行提取，得到较多的活性物质，该方法实验条件要求低，但过程繁琐，且有试剂残留，易引入食品安全问题。Kurihara和Beidler首次利用离子交换色谱分离得到神秘素，并表明它是一种碱性糖蛋白。Narendra根据神秘素中含有多聚组氨酸残基(易与镍发生强结合)的结构特性，建立了用Immobilized Metal-Affinity Chromatography镍柱一步提取的方法,该色谱分离方法获得的神秘素纯度大于95%，但该法得率较低，仅限于实验分析分离纯化。高压脉冲电场(highintensity pulsed electric fields,HIPEF)是近年来兴起的非热处理技术，在处理热敏性物质方面具有巨大的优势，已被广泛应用于商业杀菌。同时，高压脉冲电场可在瞬间使被处理物种的成分电位混乱，改变其通透性，促进成分间的分离，使其在热敏天然物提取中具有不可言喻的后发优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从神秘果中提取神秘素的方法。本发明所述的一种从神秘果中提取神秘素的方法，包括如下步骤:
(O原料预处理:将采摘的新鲜神秘果除去叶梗，用无菌水清洗干净浙干水分，放入冰箱-18 -36 °C冻藏； (2)神秘果果肉及果汁的制备:将冻藏的神秘果果实放入搅拌机内，然后加入果实质量3 6倍的I 4で无菌水，搅拌至果肉与核脱离。离心分离，上清液为果汁清液，用5 10倍I 4で无菌水冲洗沉淀物，抽滤得到滤渣为果肉浆；
(3)神秘果果汁饮料制备:将蔗糖、葡萄糖和维生素溶于果汁清液中，采用10%柠檬酸溶液将果汁清夜PH值调至3.3 3.4，搅拌均匀，罐装，灭菌，得到神秘果果汁饮料；所述神秘果果汁饮料的总维生素含量为25 50 mg/100ml，所述蔗糖的用量为神秘果果汁饮料质量的百分比为4.0 7.0%，所述葡萄糖的用量为神秘果果汁饮料质量的百分比为1.0 3.0%，所述维生素的用量为秘果果汁饮料质量的百分比为0.015 0.04% ；
(4)神秘素的提取:取10 15倍含盐的酸性缓冲液加入果肉浆中，然后经均浆机均质，再经高压脉冲电场处理器辅助提取神秘素。(5)超滤分离:将高压脉冲电场处理后的浆液抽滤，滤液通过10000 Da的超滤膜，取截留液，冷冻干燥，得到神秘素。进ー步地,所述步骤(I)中选用神秘果采摘至预处理之间的时间不超4小时。进ー步地，所述步骤(2)中从-18 -36で冻藏中拿出的神秘果果实需在取出后10分钟内加入搅拌机内搅拌；搅拌后的混合物在温度为4 V，离心カ为8000Xg 12000 Xg的条件下，离心分离20 30 min。进ー步地，所述步骤(3)中灭菌的温度为90 100で，灭菌时间为15 30 min ； 所述的维生素为维生素C、维生素B6和B12混合物,其质量比例为2 5:1 2:0.5
1.5。进ー步地，所述步骤(4)中所述含盐的酸性缓冲液为氯化钠浓度为0.2 0.5 M、pH值为3.1 5.5的酸性缓冲液；所述高压脉冲电场处理器的脉冲极性为双极或单极脉冲，矩形或锯齿或指数衰减脉沖，电场强度为5 30 kV/cm,处理时间为10 40此。进ー步地,所述步骤(5)中，超滤流量不超过50 mL/min,进ロ压力不超过12 psi,出口压カ不超过7 psi，收集分子量大于10000 Da的截留液进行冷冻干燥。本发明与现有技术相比具有如下优点:
1、本发明采用无菌水对神秘果果肉进行水提，得到鲜红色的果汁，经过加入蔗糖、葡萄糖和维生素，可得到ロ感清甜，营养丰富，颜色诱人的神秘果果汁饮料；
2、本发明用含盐的酸性缓冲液作为水不溶性神秘果果浆的提取液，然后采用高压脉冲电场进行辅助提取，可极大提高神秘素的提取效率，且抑制提取物颜色的加深；
3、本发明公开的高效提取神秘素方法，エ艺简单，产品安全，可规模化生产。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进ー步的说明。实施例1
将采摘的新鮮神秘果除去叶梗，在4小时内用无菌水清洗干净浙干水分，放入冰箱-18で冻藏；将从冰箱拿出神秘果果实放入搅拌机内，然后加入果实质量3倍的I 4で无菌水，搅拌至果肉与核脱离，整个过程在10分钟内完成。搅拌后的混合物在温度为在4で下，离心カ为8000Xg的条件下离心20 min。上清液为果汁清液。用5倍I 4で无菌水冲洗沉淀物，抽滤得到滤渣为果肉浆。
将蔗糖、葡萄糖和维生素溶于果汁清液中，采用10%柠檬酸溶液将果汁清夜pH值调至3.3，混合搅拌均匀，得到神秘果果汁饮料；其中总维生素在神秘果果汁饮料中的含量为25 mg/100ml，蔗糖的用量为神秘果果汁饮料的质量百分比4.0%，葡萄糖的用量为神秘果果汁饮料的质量百分比1% ;所述维生素的用量为秘果果汁饮料质量的百分比为0.015%，其中，所述的维生素为维生素C、维生素B6和B12混合物，其质量比例为2:1:0.5。然后进行罐装，90°C下加热15 min进行灭菌，常温保存。取10倍含盐的酸性缓冲液(pH 3.1)加入果肉浆中，然后10000 r/min经均浆机均质2 min。然后在电场强度5k V/cm条件下处理10 Ps。将高压脉冲电场处理后的衆液抽滤，滤液通过10000 Da的超滤膜，膜流量为40 mL/min，进/出口压力分别为10 psi/5psi,取截留液，冷冻干燥，得到神秘素产品。神秘素产品的神秘素纯度为89%,引起甜味的阈值为100 ppm ο含盐的酸性缓冲液(pH 3.1)配制:配制0.1 M邻苯二钾酸钠溶液，采用I N盐酸溶液将体系PH调节至3.1，然后加入氯化钠使得最终氯化钠浓度为0.2M。实施例2
将采摘的新鲜神秘果除去叶梗，在4小时内用无菌水清洗干净浙干水分，放入冰箱-25°C冻藏；将从冰箱拿出神秘果果实放入搅拌机内，然后加入果实质量5倍的I 4 °C无菌水，搅拌至果肉与核脱10000离，整个过程在10分钟内完成。搅拌后的混合物在温度为在
4°〇下，离心力为IOOOOXg的条件下离心26 min。上清液为果汁清液。用8倍I 4 V无菌水冲洗沉淀物，抽滤得到滤渣为果肉浆。将蔗糖、葡萄糖和维生素溶于果汁清液中，采用10%柠檬酸溶液将果汁清夜pH值调至3.3，混合搅拌均匀，得到神秘果果汁饮料；其中总维生素在神秘果果汁饮料中的含量为40 mg/100ml，蔗糖的用量为神秘果果汁饮料的质量百分比6.0%，葡萄糖的用量为神秘果果汁饮料的质量百分比2% ;所述维生素的用量为秘果果汁饮料质量的百分比0.03%，所述的维生素为维生素C、维生素B6和B12混合物，其质量比例为3:2:1。然后进行罐装，95 °C下加热20min进行灭菌，常温保存。取12倍含盐的酸性缓冲液(pH 4.5)加入果肉浆中，然后10000 r/min经均浆机均质2 min。然后在电场强度20 kV/cm条件下处理20 Ps。将高压脉冲电场处理后的衆液抽滤，滤液通过10000 Da的超滤膜，膜流量为40 mL/min,进/出口压力分别为10 psi/5psi,取截留液，冷冻干燥，得到神秘素产品。该神秘素产品的神秘素纯度为86%,引起甜味活性为140 ppm。含盐的酸性缓冲液(pH 4.5)配制:将0.1 M醋酸溶液和0.1 M柠檬酸钠溶液混合，调节体系最终PH值至4.5，然后加入氯化钠使得最终氯化钠浓度为0.4M。实施例3
将采摘的新鲜神秘果除去叶梗，在4小时内用无菌水清洗干净浙干水分，放入冰箱-36°C冻藏；将从冰箱拿出神秘果果实放入搅拌机内，然后加入果实质量6倍的I 4 °C无菌水，搅拌至果肉与核脱离，整个过程在10分钟内完成。搅拌后的混合物在温度为在4 °C下，离心力为12000Xg的条件下离心30 min。上清液为果汁清液。用10倍I 4 °C无菌水冲洗沉淀物，抽滤得到滤渣为果肉浆。将蔗糖、葡萄糖和维生素溶于果汁清液中，采用10%柠檬酸溶液将果汁清夜pH值调至3.4，混合搅拌均匀，得到神秘果果汁饮料；其中总维生素在神秘果果汁饮料中的含量为50 mg/100ml，蔗糖的用量为神秘果果汁饮料的质量百分比7.0%，葡萄糖的用量为神秘果果汁饮料的质量百分比3.0%，所述维生素的用量为秘果果汁饮料质量的百分比0.04%，所述的维生素为维生素C、维生素B6和B12混合物,其质量比例为5:2:1.5。然后进行罐装，100で下加热30min进行灭菌，常温保存。取15倍含盐的酸性缓冲液(pH 5.5)加入果肉浆中，然后10000 r/min经均浆机均质2 min。然后在电场强度30 kV/cm条件下处理40 l^s。将高压脉冲电场处理后的衆液抽滤，滤液通过10000 Da的超滤膜，膜流量为50 mL/min,迸/出口压カ分别为12 psi/7psi,取截留液，冷冻干燥，得到神秘素产品。该神秘素产品的神秘素纯度为86%,引起甜味活性为140 ppmo含盐的酸性缓冲液(pH5.5)配制:将0.1 M醋酸溶液和0.1 M柠檬酸钠溶液混合，调节体系最终PH值至5.5，然后加入氯化钠使得最终氯化钠浓度为0.5M。神秘素含量的测定
在96孔板中每孔加入100 ML抗神秘果免疫球蛋白G，4で过夜，以使免疫球蛋白G(ant1-miraculin IgG)附着在孔内壁上,然后用0.18% pH 7.5的磷酸钾水溶液洗漆吸附的ant1-miraculin lgG。去除残留在各孔的溶液后姆孔内加入150 ML溶于pH 7.5的磷酸钾缓冲液的1%牛血清白蛋白，室温放置2 h。再去除1%的牛血清白蛋白溶液，依次加入分别稀释10000倍100 ML已知浓度的神秘素溶液和采用该专利方法提取得到的神秘素，室温静置2 h。然后再用0.18% pH 7.5的磷酸钾水溶液洗涤。去除残留溶液，接着加入100 ML标记的ant1-miraculin lgG，室温静置2 h。再用0.18% pH 7.5的磷酸钾水溶液洗涤，去除残留溶液后，在孔中加入过氧化物酶显色剂，诱导发生显色反应，3 min后加入反应抑制剂停止反应。用酶标仪測定在405 nm下的吸光值。神秘素由依次为已知浓度的神秘素溶液(0.5，1.0,2.0,5.0，10，20，50，100，200，500 ng/ml)标准曲线计算得出。
制备抗神秘果免疫球蛋白G (ant1-miraculin IgG)
250 99.9%纯度的神秘素与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化成油包水状乳液，对2只兔子(体重3-3.5 kg)进行背部皮下多点注射免疫。在10天和20天后分别继续注入250呢弗氏不完全佐剂与神秘素的混合物。最后一次免疫一周后，从耳静脉取血，得到ant1-miraculin 皿清。利用GE公司HiTrap Protein A HP 5 mL的预装柱进行亲和层析纯化。2.5 ml血清用10 mL PBS (20 mo I/L pH 7.0)稀释，0.25 um膜过滤，以I mL/min的流速上样。然后用10倍柱体积的缓冲液(20 mol/L PBS pH 7.0)洗去未结合的蛋白，再用6倍柱体积的
0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠(pH 3.5)缓冲液洗脱结合的蛋白，结合蛋白以2 mL/管为单位分步收集到含500 ii L pH 9.0 Tris-Cl中和液的收集管中。收集液经SDS-PAGE检测后合并，经PBS (20 mmol/L, pH 7.0)缓冲液透析后，用PEG 20000浓缩蛋白。标记IgG的制备
称取4 mg过氧化酶溶解于ImL蒸懼水中，加入0.2 mL新配的0.1 mol/L NaIO4溶液，室温下避光搅拌20 min ,将上述溶液装入透析袋中,用I mmol/L (pH 4.4)的醋酸钠缓冲液透析，4で过夜。加20 UL 0.2 mol/L (pH 9.5)碳酸盐缓冲液，使以上过氧化酶的pH值升高到9.0，立即加入I mL含有8 mg IgG的0.01 M碳酸钠缓冲液(pH 9.5)，室温避光轻轻搅拌2 h，再加0.1 mL新配的4 mg/mL NaBH4溶液，混匀，在4°C下放置2 h。上凝胶色谱柱(Sephacryl s_2200柱)进行分离，洗脱液为10 mM的磷酸缓液(pH 6.8)，吸收波长分别为280 nm (蛋白吸收波长)，403 nm (POD)和405 nm (具有过氧化酶活性的吸收波长)。对以上三个波长的色谱峰分别收集，得到酶结合物，用牛血清蛋白将标记抗体的浓度调整至Img/mL，保存。感官评价
采用滋味稀释分析法对分离纯化神秘素冻干样的引起甜味阈值进行感官评价。将神秘素冷冻干燥物准确溶于纯净水中，配成1%的浓度，然后进行1:1 (体积比)的逐步稀释，样品的逐步稀释的溶液按照浓度增加的顺序呈给经过训练的评员，每个稀释水平溶液采用3点测定进行评定。当某个稀释水平的溶液与2个空白(纯净水)之间的滋味差异刚好能被识别出来，那么称这时的样品浓度为可识别的阈值。每个评定组的阈值采用各个评员评定结果的平均值。神秘素引起甜味感觉的感官评价步骤如下:
(1)2 3ml 0.1 M柠檬酸含在口腔内，确定其酸味；
(2)吐掉柠檬酸，纯水漱口；
(3)将2.5 ml神秘素提取物含于口中I分钟；
(4)吐掉神秘素提取物，纯水漱口；
(5)2 3ml 0.1 M柠檬酸含在口腔内，确认产生的甜味。上述实施例仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明内容所作的均等变化与修饰，都为本发明权利要求所要求保护的范围。
权利要求
1.一种从神秘果中提取神秘素的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)原料预处理:将采摘的新鮮神秘果除去叶梗，用无菌水清洗干净浙干水分，放入冰箱-18 -36で冻藏； (2)神秘果果肉及果汁的制备:将冻藏的神秘果果实放入搅拌机内，然后加入果实质量3 6倍的I 4で无菌水，搅拌至果肉与核脱离；离心分离，上清液为果汁清液，用5 10倍I 4で无菌水冲洗沉淀物，抽滤得到滤渣为果肉浆； (3)神秘果果汁饮料制备:将蔗糖、葡萄糖和维生素溶于果汁清液中，采用10%柠檬酸溶液将果汁清夜PH值调至3.3 3.4，搅拌均匀，罐装，灭菌，得到神秘果果汁饮料；所述神秘果果汁饮料的总维生素含量为25 50 mg/100ml，所述蔗糖的用量为神秘果果汁饮料质量的百分比为4.0 7.0%，所述葡萄糖的用量为神秘果果汁饮料质量的百分比为1.0 3.0%，所述维生素的用量为秘果果汁饮料质量的百分比为0.015 0.04% ； (4)神秘素的提取:取10 15倍含盐的酸性缓冲液加入果肉浆中，然后经均浆机均质，再经高压脉冲电场处理器辅助提取神秘素； (5)超滤分离:将高压脉冲电场处理后的浆液抽滤，滤液通过10000Da的超滤膜，取截留液，冷冻干燥，得到神秘素。
2.根据权利要求1所述的从神秘果中提取神秘素的方法，其特征在于，所述步骤(I)中神秘果采摘至预处理之间的时间间隔不超4小吋。
3.根据权利要求1所述的从神秘果中提取神秘素的方法，其特征在于，所述步骤(2)中从-18 -36で冻藏中拿出的神秘果果实取出后在10分钟内加入搅拌机内搅拌；搅拌后的混合物在温度为4で，离心カ为8000Xg 12000Xg的条件下，离心分离20 30 min。
4.根据权利要求1所述的从神秘果中提取神秘素的方法，其特征在于，所述步骤(3)中灭菌的温度为90 100で，灭菌时间为15 30 min ； 所述的维生素为维生素C、维生素B6和B12混合物,其质量比例为2 5:1 2:0.5 1.5。
5.根据权利要求1所述的从神秘果中提取神秘素的方法，其特征在于，所述步骤(4)中含盐的酸性缓冲液为氯化钠浓度为0.2 0.5 M、pH值为3.1 5.5的酸性缓冲液；所述高压脉冲电场处理器的脉冲极性为双极或单极脉冲，矩形或锯齿或指数衰减脉沖，电场强度为5 30 kV/cm,处通时间为10 40 M<s。
6.根据权利要求1所述的从神秘果中提取神秘素的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，超滤流量不超过50 mL/min,进ロ压力不超过12 psi,出口压カ不超过7 psi,收集分子量大于10000 Da的截留液进行冷冻干燥。
全文摘要
本发明公开了一种从神秘果中提取神秘素的方法，该方法包括以下步骤(1)神秘果的预处理；(2)神秘果果肉及果汁的制备；(3)通过添加甜味剂及维生素制备神秘果果汁饮料；(4)选用含盐的酸性缓冲液作为提取液，均质混匀，高压脉冲电场辅助高效提取神秘素；(5)采用膜通量为10000Da的超滤膜对神秘素粗提液进行脱盐、浓缩，冷冻干燥处理，得到神秘素产品。本发明生产设备要求简单，安全性高，制得的神秘素纯度高，活性强，适宜大规模工业化生产；且制备过程中产生的神秘果果汁可制成营养可口的果汁饮料，拓展了神秘果的应用范围。
文档编号A23L2/52GK103082260SQ20131005548
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月21日 优先权日2013年2月21日
发明者赵谋明, 万福群 申请人:万福群