专利名称：一种设计碱基替换或插入缺失的snp分子标记的方法
技术领域：
本发明属于SNP检测技术领域，尤其涉及一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法。
背景技术：
单核苷酸多态性(SNP)标记技术,属于新一代的标记技术。常用来表不不同生物个体在同一等位基因处个别碱基的差异，常常出现的单核苷酸多态性有碱基替换、碱基的插入缺失。目前，SNP是所发现的生物中存在最广泛的变异类型，即使在不同生物个体中序列差异不大的基因中也存在一定数量的SNP位点，因此是植物遗传研究中理想的分子标记。作为新兴的分子标记，SNP有如下优点:数量多分布广，SNP比微卫星标记密度更高，是等位基因间序列差异最为普遍的类型；SNP具有二态性特点，其不再以DNA序列长度的不同来检测多态性，能够用不同的方法进行基因的检测；在启动子区的SNP可能对基因的表达造成影响，而在编码序列的SNP可能会影响到所编码蛋白的结构和功能，是目前遗传研究的热点。目前，检测SNP的方法很多，常用的有如下几种:利用生物信息学的方法在已有的DNA数据库中搜索SNP，这种方法比较直接、快捷；单链构象多态性(SSCP)，通过个别碱基的变化影响DNA的构象的原理来检测SNP，操作简单、经济、适用面广。但影响因素较多，如电泳温度、凝胶浓度均可影响其灵敏性，所以稳定性不高；酶切法，基因中个别碱基的变化，可造成原来基因中部分酶切位置的变化，通过特异酶切割所扩增的序列，产生大小不一的切割片段，再利用简单的检测手段来可达到区分该位点的目的。酶切检测法方便、准确，但只能分析酶切位点处的SNP，而不能检测酶切位点以外的SNP，所以有一定局限性；杂交法，如DNA芯片技术，可以大大提高检测速度，但价格较昂贵；测序法，对不同个体等位基因片段进行测序分析，检测序列中的碱基变异。该法直观、准确，但工作量大，价格昂贵；PCR法，利用引物序列3'端的SNP不能与模板有效结合，导致PCR扩增结果的不一，通过特定的手段检测PCR结果来达到确定SNP位点的目的。PCR法方便快捷但受较多其它因子的干扰，重复性较差。利用SNP标记，人们已成功标记了一些抗病、抗逆和优质基因(Buren etal.2000 ；Brooks et al.2006 ；Mondini et al.2012)。从以上方法可以看出，目前常用的方法存在稳定性不高、有一定局限性、价格较昂
贵、重复性差等。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法，在获得基因序列后，针对该基因的变异开发相应的功能标记，对研究基因的功能并有效利用该基因提供坚实的基础。
本发明实施例是这样实现的，一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法，该方法将所发现的SNP位点设计在引物3'位置；该方法通过两次PCR，再通过技术检测PCR结果，确定出个体SNP位点的基因型。进一步，该方法引物设计方法为:两个个体相同的基因处有一个T碱基和C碱基的替换，由Allelel特异位点T设计特异引物P1，同样由Allele2特异位点C设计特异引物P2 ;两对引物在Genotypel中扩增时，Pl引物能够正常扩增出PCR产物，P2引物不能正常扩增而没有PCR产物，确定该基因的基因型为TT ;用相同的方法扩增可以确定Gen0type2基因型为CC ;若两者都能得到扩增产物，可确定Genotype3基因型为TC，从而分析出SNP位点。本发明提供的方法针对由于平常所用的TaqDNA聚合酶要进行正常扩增，其5'可以不需要与模板完全匹配，而其3'要求完全配对。针对这个特性，可以特异地将所发现的SNP位点设计在引物3'位置；针对突变型的基因设计的引物与野生型的基因会形成3'端错配，导致不能正常扩增；同样以野生基因设计的引物与突变型基因的3'端产生错配，也同样在突变型个体基因组中不能正常扩增。本发明通过两次PCR，再通过特定技术检测PCR结果，可以方便地知道该个体SNP位点的基因型。
图1是本发明实施例提供的等位基因特异PCR技术原理图2是本发明实施例提供的AS-PCR引物设计；黑体表示加入的错配碱基；图3是本发明实施例提供的AS-PCR引物组合筛选图4是本发明实施例提供的部分F2后代基因分型结果；泳道1-20为F2代第300-319个单株的基因型结果；`图5是本发明实施例提供的AS-PCR引物在24个品种中的扩增；M:DNA Ladder ；1中国春；2兰考大粒；3长武0318 ；4郑麦366 ；5烟农192 ；6西农979 ；7皖麦38 ；8济麦22 ；9郑麦9623 ；10皖麦50 ；11小偃22 ；12周麦18 ；13四川大粒；14陕麦229 ；15淮麦20 ；16西农 2611 ;17 西农 9871 ;18 兰考 185 ;19 郑麦 0856 ；20 明贤 169 ；21BYL3 ;22 大地 98 ;23 宿7075 ;24 徐麦 9074 ；图6是本发明实施例提供的5个品种的籽粒图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。如图1表示的是该技术引物设计原理，两个个体相同的基因处有一个T碱基和C碱基的替换。这样可以由Al I e I e I特异位点T设计特异引物PI，同样由Al I e I e2特异位点C设计特异引物P2(图1A)。两对引物在Genotypel中扩增时，Pl引物能够正常扩增出PCR产物，P2引物不能正常扩增而没有PCR产物(图1B)，可以确定该基因的基因型为TT;用相同的方法扩增可以确定Genotype2基因型为CC ;若两者都能得到扩增产物,可确定Genotype3基因型为TC。这样可通过简单的电泳技术来分析该SNP位点(图1C)。本发明用克隆的小麦粒重基因TaGW2的大小粒品种碱基差异为例，该基因全长cDNA1275bp,大粒品种兰考大粒在977bp处和小粒品种中国春相比有一个“T”碱基的插入，其余部分碱基基本相同，如图2所示，在突变位点处，根据兰考大粒的序列设计了三个引物:F4、F6和R4。其中F4、F6为上游引物分别在其3'端第2位和第3位加入错配碱基G ；R4为下游引物在其3'端第2位加入了错配碱基G。由中国春的序列设计一个引物F5，在其3 ^端第2位引入错配碱基G。此外，还分别在突变位点两侧200bp处设计一对内参引物F3和R3，扩增片段长度约540bp。通过特异引物F4、F5、F6和R4分别与内参引物F3和R3组合，便形成了 4 套引物组合(TaGW2-AS-Pl、TaGW2_AS_P2、TaGW2_AS_P3 和 TaGW2_AS_P4)，用于扩增兰考大粒和中国春的特异序列。以兰考大粒特异引物组合(TaGW2-AS-Pl、TaGW2-AS-P3和TaGW2-AS-P4)结合中国春特异引物组合(TaGW2_AS_P2)可鉴定基因型。引物序列列于表I中，由大连宝生物生物工程有限公司合成。表I AS-PCR引物设计；黑体表示加入的错配碱基
权利要求
1.一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法，其特征在于，该方法以已知功能基因SNP突变位点为参照，将此位点设计在特异引物的3'位置；通过分别设计Allelel和Allele2特异位点两对引物，通过两次PCR，再通过技术检测PCR结果，确定出个体SNP位点的基因型，通过标记功能验证及稳定性检测，将该分子标记用于辅助选择育种。
2.如权利要求1所述的设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法，其特征在于，该方法引物设计方法为: 两个个体相同的基因处有一个T碱基和C碱基的替换，由Allelel特异位点T设计特异引物PI，同样由Al I e I e2特异位点C设计特异引物P2 ;两对引物在Genotype I中扩增时，PI引物能够正常扩增出PCR产物，P2引物不能正常扩增而没有PCR产物，确定该基因的基因型为TT ;用相同的方法扩增可以确定Gen0type2基因型为CC ;若两者都能得到扩增产物，可确定Genotype3基因型为 TC，从而分析出SNP位点。
全文摘要
本发明公开了一种设计碱基替换或插入缺失的SNP分子标记的方法，该方法针对由于平常所用的TaqDNA聚合酶要进行正常扩增，其5′可以不需要与模板完全匹配，而其3′要求完全配对。针对这个特性，可以特异地将所发现的SNP位点设计在引物3′位置；针对突变型的基因设计的引物与野生型的基因会形成3′端错配，导致不能正常扩增；同样以野生基因设计的引物与突变型基因的3′端产生错配，也同样在突变型个体基因组中不能正常扩增。本发明通过两次PCR，再通过特定技术检测PCR结果，可以方便地确定该个体SNP位点的基因型。
文档编号C12Q1/68GK103146823SQ201310062218
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月27日 优先权日2013年2月27日
发明者李学军, 杨子博, 李立群, 吴青霞, 杨林, 邵慧, 冉从福 申请人:西北农林科技大学