一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法
【专利摘要】本发明公开一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法，包括以下步骤：将大肠杆菌菌株中的野生型fnr基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-fnr，通过碱基替换，得到优化的重组载体pKSC-fnr1和pKSC-fnr2；最后用pKSC-fnr1和pKSC-fnr2中的fnr1和fnr2基因替换E.coliDH5α中野生型fnr基因，得到两个正丁醇耐受性提高的菌株。本发明通过对大肠杆菌菌株中的野生型fnr基因的碱基替换，影响其所调控的各种基因的转录水平，特别是与正丁醇耐受性相关的基因，进而提高大肠杆菌中的正丁醇耐受性，对利用大肠杆菌用于工业化生产正丁醇具有重要的意义。
【专利说明】—种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化工领域，特别涉及一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法。
【背景技术】
[0002]大肠杆菌具有生长快、技术操作相对简单、大规模发酵成本低等优点，是目前基因工程中的模式菌株和最为常用的外源蛋白原核表达系统。此系统可作为“细胞工厂”而生产许多人们需要的代谢产物，然而菌体常常需要在一些不利的环境中培养，各种代谢产物的积累，不仅会降低菌体自身RNA、DNA、蛋白和脂类等的合成速度，而且严重抑制重组菌的生长。对菌体进行有效改造，提高大肠杆菌对不利环境条件的忍耐性和适应性已成为微生物技术应用所需解决的一个重要问题。菌体对环境改变所做出的自身调节，或对一些恶劣条件忍耐性和适应性的形成涉及到整个代谢网络的调整，由许多基因共同作用，目前其相关机理仍没有完全明确。
[0003]转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，它控制着基因转录的开关、增强或减弱。大多数细胞功能是由一组基因互相作用形成功能模块来共同执行的，当转录因子调控的基因数目很大时，它参与多种细胞功能的可能性也大大增加，这意味着转录因子与被调控基因的功能多元化是相关的。转录因子FNR正是处于基因转录调控网络的最上层，能够直接或间接的调控菌体全基因组的转录水平，可以在FNR和多种细胞功能之间建立起一定的联系。因此，可以通过改变FNR的蛋白结构，影响其所调控各种基因的转录水平，调节整个菌体的代谢网络，进而改进大肠杆菌的菌体性状。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法，包括以下步骤:
(1)将大肠杆菌菌株疋coliDH5a中的野生型fnr基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-fnr,野生型fnr基因的序列如SEQ ID N0.1所示,野生型fnr的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，pKSC质粒的序列如SEQ ID N0.3所示，重组载体pKSC-fnr的序列如SEQ ID N0.4 所示；
(2)碱基替换:将步骤(1)得到的重组载体pKSC-fnr上的fnr基因进行碱基替换:C512T，得到优化的重组载体pKSC-fnrl ;碱基替换:G286T，T428A，得到优化的重组载体pKSC-fnr2 ;fnrl基因的序列如SEQ ID N0.5所示，fnrl的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示，fnr2基因的序列如SEQ ID N0.7所示，fnr2的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，pKSC-fnrl的序列如SEQ ID N0.9所示，pKSC-fnr2的序列如SEQ ID N0.10所示；
(3)分别用pKSC-fnrl和pKSC-fnr2中的fnrl和fnr2基因替换大肠杆菌菌株疋coli DH5a中的野生型fnr基因，得到正丁醇耐受性提高的大肠杆菌菌株疋coli DH5 afnr::fnrl 和厶 coli DH5 a fnr::fnr2。
[0006]本发明的有益效果是:通过对大肠杆菌菌株中的野生型fnr基因的碱基替换，影响其所调控的各种基因的转录水平，调节整个菌体的代谢网络，进而提高大肠杆菌的正丁醇耐受性，对利用大肠杆菌用于工业化生产正丁醇具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1:重组载体pKSC-fnr结构示意图；
图 2:本发明菌株疋 coli DH5 a fnr:: fnrl 和疋 coli DH5 a fnr:: fnr2 在 1.0 %(κ/κ)正丁醇中生长情况图。
【具体实施方式】
[0008]该野生型fnr的DNA序列及多肽序列分别在SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2中给出。
[0009]本发明是一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法，包括以下步骤: 1、将大肠杆菌菌株疋coliDH5a中的野生型fnr基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-fnr,野生型fnr基因的序列如SEQ ID N0.1所示,野生型fnr的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，pKSC质粒的序列如SEQ ID N0.3所示，重组载体pKSC-fnr的序列如SEQID N0.4 所示；
2、碱基替换:将步骤(1)得到的重组载体pKSC-fnr上的fnr基因进行碱基替换:C512T，得到优化的重组载体pKSC-fnrl ;碱基替换:G286T，T428A，得到优化的重组载体pKSC-fnr2 ;fnrl基因的序列如SEQ ID N0.5所示，fnrl的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示，fnr2基因的序列如SEQ ID N0.7所示，fnr2的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，pKSC-fnr I的序列如SEQ ID N0.9所示，pKSC-fnr2的序列如SEQ ID N0.10所示；
3、分别用pKSC-fnrl和pKSC-fnr2中的fnrl和fnr2基因替换大肠杆菌菌株疋coli DH5a中的野生型fnr基因，得到正丁醇耐受性提高的大肠杆菌菌株疋coli DH5 afnr::fnrl 和厶 coli DH5 a fnr::fnr2。
[0010]下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0011]实施例1，一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法，包括以下步骤:
1.将大肠杆菌菌株疋coliDH5a中的野生型fnr基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-fnr,野生型fnr基因的序列如SEQ ID N0.1所示,野生型fnr的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，pKSC质粒的序列如SEQ ID N0.3所示，重组载体pKSC-fnr的序列如SEQ ID N0.4 所示；
2.碱基替换:将步骤(1)得到的重组载体pKSC-fnr上的fnr基因进行碱基替换:C512T，得到优化的重组载体pKSC-fnrl ;fnrl基因的序列如SEQ ID N0.5所示，fnrl的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示，pKSC-fnrl的序列如SEQ ID N0.9所示；
3.用pKSC-fnrl中的fnrl基因替换大肠杆菌菌株疋coliDH5 a中的野生型fnr基因，替换方法如下:
3.1在TA克隆载体PMD-18上分别连接pKSC-fnrl中的fnrl基因和卡那霉素抗性基因，并用重组同源臂引物扩增含有fnrl基因及卡那霉素抗性基因的基因盒；重组同源臂引物fnr_RED_for的基因序列如SEQ ID N0.11所示；重组同源臂引物fnr_RED_rev的基因序列如SEQ ID N0.12 ;基因盒序列如SEQ ID N0.13所示；
3.2此基因盒通过大肠杆菌重组系统(λ-red)重组到大肠杆菌菌株疋coli DH5 α的野生型fnr基因上,得到优化菌株万.coli DH5 a fnr::fnrl ；
4.比较大肠杆菌菌株万.coliDH5a以及步骤3得到的优化菌株万.coli DH5 afnr::fnrl的正丁醇耐受性,步骤如下:
4.1将大肠杆菌菌株万.coli DH5a以及步骤3得到的优化菌株万.coli DH5 afnr::fnrl分别接种于50 ml LB培养基中，37 °C培养12 h，作为种子液；
4.2分别取步骤(4.1)得到的2种培养液各lml，分别接种到50 ml LB培养基中，37 V培养10 h ；
4.3每隔2h取步骤(4.2)得到的2种培养液，在分光光度计上测定其在600 nm处的吸光度；其生长情况如图2所示。
[0012]实施例2，一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法，包括以下步骤:
1.将大肠杆菌菌株疋coliDH5a中的野生型fnr基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-fnr,野生型fnr基因的序列如SEQ ID N0.1所示,野生型fnr的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，pKSC质粒的序列如SEQ ID N0.3所示，重组载体pKSC-fnr的序列如SEQ ID N0.4 所示；
2.碱基替换:将步骤(1)得到的重组载体pKSC-fnr上的fnr基因进行碱基替换:G286T，T428A，得到优化的重组载体pKSC-fnr2 ;fnr2基因的序列如SEQ ID N0.7所示，fnr2的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，pKSC-fnr2的序列如SEQ ID N0.10所示；
3.用pKSC-fnr2中的fnr2基因替换大肠杆菌菌株疋coliDH5 a中的野生型fnr基因，替换方法如下:
3.1在TA克隆载体PMD-18上分别连接pKSC_fnr2中的fnr2基因和卡那霉素抗性基因，并用重组同源臂引物扩增含有fnr2基因及卡那霉素抗性基因的基因盒；重组同源臂引物fnr_RED_for的基因序列如SEQ ID N0.11所示；重组同源臂引物fnr_RED_rev的基因序列如SEQ ID N0.12 ;基因盒序列如SEQ ID N0.14所示；
3.2此基因盒通过大肠杆菌重组系统(λ -red)重组到大肠杆菌菌株疋coli DH5 a的野生型fnr基因上,得到优化菌株万.coli DH5 a fnr::fnr2 ；
4.比较大肠杆菌菌株万.coliDH5a以及步骤3得到的优化菌株万.coli DH5 afnr::fnr2的正丁醇耐受性,步骤如下:
4.1将大肠杆菌菌株万.coli DH5a以及步骤3得到的优化菌株万.coli DH5 afnr::fnr2分别接种于50 ml LB培养基中，37 °C培养12 h，作为种子液；
4.2分别取步骤(4.1)得到的2种培养液各lml，分别接种到50 ml LB培养基中，37 V培养10 h ；
4.3每隔2h取步骤(4.2)得到的2种培养液，在分光光度计上测定其在600 nm处的吸光度；其生长情况如图2所示。
【权利要求】
1.一种提高大肠杆菌正丁醇耐受性的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将大肠杆菌菌株疋COliDH5a中的野生型fnr基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-fnr,野生型fnr基因的序列如SEQ ID N0.1所示,野生型fnr的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，pKSC质粒的序列如SEQ ID N0.3所示，重组载体pKSC-fnr的序列如SEQ ID N0.4 所示； (2)碱基替换:将步骤I得到的重组载体pKSC-fnr上的fnr基因进行碱基替换:C512T，得到优化的重组载体pKSC-fnr I ;碱基替换:G286T，T428A，得到优化的重组载体pKSC-fnr2 ;fnrl基因的序列如SEQ ID N0.5所示，fnrl的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示，fnr2基因的序列如SEQ ID N0.7所示，fnr2的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，pKSC-fnr I的序列如SEQ ID N0.9所示，pKSC-fnr2的序列如SEQ ID N0.10所示； (3 )用pKSC-fnr I和pKSC-fnr 2中的fnr I和fnr 2基因替换大肠杆菌菌株疋coliDH5a中的野生型fnr基因，得到正丁醇耐受性提高的大肠杆菌菌株疋coli DH5 afnr::fnrl 和厶 coli DH5 a fnr::fnr2。
【文档编号】C12N15/31GK104073508SQ201410311101
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】黄磊, 濮悦, 徐志南, 蔡谨 申请人:浙江大学