优化的重组人骨形态发生蛋白质-2的dna序列及其编码蛋白质的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种优化的重组人骨形态发生蛋白质-2的DNA序列及其编码蛋白质，其重组蛋白质rhBMP-2SEDIDNO．1为人的BMP-2成熟肽的C端110个氨基酸加上MGAKQ五肽，其中BMP-2成熟肽的第五个氨基酸H突变为Q；构建的重组rhBMP-2蛋白序列，通过对密码子的优化，得到优化的DNA序列SEDIDNO．2和SEDIDNO．3。BMP-2成熟肽在加五肽或二肽的重组后，蛋白的表达量可提高至30%以上，而且后续纯化和复性过程中更容易，能够得到更高的复性效率，因而其产量会明显增高，有更高的生物活性，更加适合工业化生产。
【专利说明】优化的重组人骨形态发生蛋白质-2的DNA序列及其编码蛋白质
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种优化的重组人骨形态发生蛋白质-2的DNA序列及其编码蛋白质。
【背景技术】
[0002]自然界中BMP虽然广泛存在于各种动物的骨组织中，但其含量甚微，每公斤湿重新鲜骨仅含有几微克BMP，且不同来源BMP在理化性质及分子结构上存在差别，诱导成骨活性和稳定性也都有所不同。由于骨组织中各种BMP与不溶性非胶原蛋白紧密结合，很难从中分离出单一的任何一种BMP分子。因此，从动物骨组织中分离BMP，过程繁杂，重复性差，收率低，蛋白纯度不高并且不可避免地存在差异。同时，这种动物来源的蛋白在人体使用，会引起不同程度的免疫排斥反应和潜在的病源传播危险。因此，完全依靠动物骨提取，难以满足实验和临床应用中的需求量。
[0003]利用基因工程方法生产人BMP-2，不仅可保证大量生产，还可避免免疫排斥反应，是极具发展前景和吸引力的方法。自1988年Wozney等获得了牛骨来源的BMP-2基因，并在重组大肠杆菌中成功表达后，基因工程大量生产人的BMP-2也就成为可能。
[0004]在BMP-2的产业化研究方面，主要是真核表达载体和大肠杆菌为代表的原核表达体系两种基因重组方案。1988年，Wozney等获得了 C0S-1真核表达的BMP-2 ；1992年，Israel DI获得了 CHO真核表达的BMP-2 ;美国Medtronic SofamorDanek公司研制的INFUSE骨移植剂和LT-CAGE腰椎融合器械在2002年7月获得FDA批准用于治疗椎间盘退行性疾病；Wyeth公司开发的InductOs(TM) (rhBMP-2/ACS)于2002年9月获得欧洲委员会(EC)的批准，用于成人急性胫骨骨折的治疗。INFUSE骨移植剂和InductOs的表达体系都为CHO细胞，表达量低，生产成本很高，并不适合大规模生产。因此，真核表达方法生产BMP在国内还未实现产业化。
[0005]在原核表达体系方面，1994年赵明、1995年陈苏民等完成了 BMP-2的在大肠杆菌中的高效表达，表达产物为包涵体，需要进行体外复性。2002年德国Vallejo等在大肠杆菌实现了大规模生产。
[0006]与真核表达系统相比，原核表达系统易于进行基因操作，表达效率高，细胞外有细胞壁，不如哺乳动物细胞娇嫩，营养要求低，对培养环境的耐受性强，易于培养，生产成本低，具有很强的竞争力。尽管原核表达系统不能使BMP糖基化，表达产物多以包涵体形式出现，且受复性过程难控制、制备工艺相对复杂等问题困扰，但对于BMP的表达，由于糖基化并不是BMP活性的必需条件，无糖基化修饰并不影响它们的生物活性。因此，原核表达系统也可用于BMP的表达和生产。
[0007]用基因工程方法在大肠杆菌中高效表达外源蛋白一直是生物【技术领域】的研究热门，有多种因素影响外源蛋白质的表达。对蛋白质进行结构修饰是基因工程领域经常采用的一种方法，包括天然蛋白质内氨基酸序列的改变、截短型的构建和长链型的构建等，目的是提高目标蛋白的表达、活性和稳定性。其中提高外源蛋白表达的方法中，基因的优化是最重要的手段。因此，本领域迫切需要开发适合工业化生产的、基于大肠杆菌表达系统的高效生产活性rhBMP-2的方法。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种优化的重组人骨形态发生蛋白质-2的DNA序列及其编码蛋白质，使之高效表达、复性效率高、产量高、活性高、适宜工业化生产。
[0009]本发明的实施的技术方案如下:
[0010]优化的重组人骨形态发生蛋白质-2的DNA序列及其编码蛋白质，其重组蛋白质rhBMP-2为人的BMP-2成熟肽的C端110个氨基酸加上MGAKQ五肽；或者也可以看作是重组蛋白为BMP-2成熟肽C端113个氨基酸加上MG 二肽，其中BMP-2成熟肽的第五个氨基酸H突变为Q ;其编码的氨基酸序列如下所示SED ID N0.1:
[0011]
【权利要求】
1.优化的重组人骨形态发生蛋白质-2的DNA序列及其编码蛋白质，其特征在于:其编码的氨基酸序列如下所示SED ID N0.1:
2.优化的重组人骨形态发生蛋白质-2的DNA序列及其编码蛋白质，其特征在于:其优化的DNA序列有两个，为如下所示的核苷酸序列:
【文档编号】C12N15/12GK104163865SQ201410310953
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月1日 优先权日:2014年7月1日
【发明者】曹建新 申请人:杭州瑞固生物技术有限公司