专利名称：特异性检测转基因番茄品系华番1号的标准分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种特异性检测转基因番茄品系华番I号的标准分子及其应用。
背景技术：
近年来，转基因技术广泛应用在农业生产中。华番I号就是利用转基因技术将乙烯形成酶(EFE)反义基因导入到番茄中获得耐贮藏的番茄品系，进一步与另一番茄品系(A53)杂交而获得的。从1996 2001年，华番一号番茄已在湖北、广西、贵州、新疆、江苏等21个省市大面积推广应用，累计推广面积25余万亩，累计新增利润3.75亿元，新增税收7499.4 万元。在转基因检测时，必须使用标准物质作为阳性对照或制作标准曲线，以对转基因产品进行准确检测。标准质粒分子是近几年发展起来的一种可替代植物基因组的一种重组质粒分子，一般包括物种特异性片段和转基因作物检测的外源基因或品系特异性片段。优点是生产成本低，质粒DNA的纯度高，产量大，制作和应用更为灵活，可以人为设计携带多个外源基因，使其应用更为广泛。目前，已经成功应用于转基因大豆棉花和玉米等的定量检测，而且目前标准质粒分子已经获得了国际协同认证。目前尚未有针对转基因番茄品系华番I号进行特异性检测的质粒标准分子的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性检测转基因番茄品系华番I号的标准分子及其应用。本发明所提供的特异性检测转基因番茄品系华番I号的标准分子具体为环状载体。所述环状载体具体包括乙烯形成酶反义基因(ant1-EFE基因)片段、番茄内源基因Lat52片段，以及Ti质粒T-DNA的边界序列(如右边界序列RB)片段。在本发明中，所述乙烯形成酶反义基因片段的序列具体可如序列表中序列I的第1-87位所示；所述番茄内源基因Lat52片段的序列具体可如序列表中序列I的第94-185位所示；所述Ti质粒T-DNA的边界序列片段的序列具体可如序列表中序列I的第192-299位所示。进一步，所述环状载体为将所述乙烯形成酶反义基因片段、所述番茄内源基因Lat52片段、所述Ti质粒T-DNA的边界序列片段一同与pEASY_T3质粒相连后得到的重组载体。更加具体的，所述环状载体为将如序列表中序列I所示的DNA片段与所述PEASY-T3质粒连接所得的重组载体。所述环状载体在作为标准分子检测转基因番茄品系华番I号中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种定性或定量检测转基因番茄品系华番I号的试剂盒。本发明所提供的试剂盒，具体包括所述环状载体和如下(al)_ (a3)中的全部或部分:(al)由序列表中序列2和序列3所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸序列如序列表中序列4所示的探针；(用于扩增ant1-EFE基因片段)(a2)由序列表中序列5和序列6所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸序列如序列表中序列7所示的探针；(用于扩增番茄内源基因Lat52片段)(a3)由序列表中序列8和序列9所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸序列如序列表中序列10所示的探针。(用于扩增RB片段)以上(al)- (a3)中，所述探针可为TaqMan荧光探针。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭荧光基团连接在探针的3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； 0 扩增时3&(1酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。所述报告荧光基团可为Fam (FAM)、Hex (HEX)、Tet (TET)、Joe (JOE)、Vic (VIC)、Fite(FITE)、Cy3 (CY3)或 Cy5 (CY5)。所述淬灭荧光基团可为 Tamra (TAMRA)、Rox (ROX)、Dabcy (DABCY) ,Bhql (BHQl)或Bhq2 (BHQ2)。在本发明中，所述探针5’端标记的报告荧光基团具体为FAM荧光基团，3’端 标记的淬灭荧光基团具体为TAMRA荧光基团。所述试剂盒在作为标准体系检测转基因番茄品系华番I号中的应用也属于本发明的保护范围。制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。该方法具体可包括如下步骤:将所述试剂盒中的所述环状载体、各引物对和各探针分别单独包装。本发明所提供的特异性检测转基因番茄品系华番I号的标准分子包含外源基因ant1-EFE、内参基因Lat52及边界序列部分区段。实验证明，本发明所提供的标准分子具有较高的灵敏度，其最低检测线可达2拷贝，线性范围广，均匀性好，稳定性强，对于转基因番茄品系华番I号的定性和定量检测具有重要意义。
图1为标准分子pEASY-HFl质粒阳性克隆的PCR筛选结果。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准；泳道I为阳性对照；泳道2_17为16个标准分子pEASY-HFl质粒克隆。图2为标准分子pEASY-HFl的质粒构建图。图3为各引物和探针特异性检测结果。其中，A为外源基因ant1-EFE的特异性检测结果:I表示转基因番茄品系华番I号(GM0+)，2表示非转基因番茄品系Money maker(GM0-);B为内参基因Lat52的特异性检测结果:1表示转基因番茄品系华番I号(GM0+)，2表示非转基因番茄品系Money maker (GM0-) ;C为边界序列(品系特异性)的特异性检测结果:1表示转基因番茄品系华番I号(GM0+)。图4为标准体系的灵敏度及标准曲线测定。其中，a为外源基因ant1-EFE的灵敏度及标准曲线测定山内参基因Lat52的灵敏度及标准曲线测定；c为边界序列(品系特异性)的灵敏度及标准曲线测定。a-c中，A-H均表示所检测的模板(标准分子pEASY-HFl)的用量，A为1.5X IO7拷贝，B为1.5X IO6拷贝，C为1.5X IO5拷贝，D为1.5X IO4拷贝，E为1.5X IO3拷贝，F为1.5X IO2拷贝，G为1.5X IO1拷贝，H为1.5X10°拷贝。a_c中，标准曲线的横坐标均表示起始拷贝数的对数，纵坐标均表示Ct值，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pEASY-T3载体:北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CT301。转基因番茄品系华番I号(GM0+):记载于“黄文胜，陈红运，赵文军，等.转基因延熟番茄“华番一号”的品系特异性检测方法[J].植物检疫，2005，19(6):321-325” 一文中；公众可从中国检验检疫科学研究院获得。非转基因番爺品系Moneymaker (GM0-):记载于“刘晶，周树峰,等.农杆菌介导的双价基因抗盐转化番茄的研究[J].2005，38(8): 1636-1644” 一文中；公众可从中国检验检疫科学研究院获得。转基因水稻品系科丰6号:中国检验检疫科学研究院；戎俊，宋志平，苏军，夏辉，王锋，卢宝荣.Bt/CpTI转基因稻及其非转基因亲本对照在间隔种植条件下的转基因漂移.生物多样性，2006, 14(4):309 - `314。科丰6号由中国水稻研究所王渭霞提供，是1994年由福建省农业科学院生物技术研究所王锋和中国科学院遗传与发育生物学研究所朱祯共同培育的。转基因棉花(转Bt抗虫基因)品系中棉41:中国检验检疫科学研究院；刘生荣，夏志明，刘党培.双价抗虫棉中棉所41丰产稳产性及其简化栽培技术研究[J].中国农学通报，2005，(03): 166-168。转植酸酶基因玉米品系BVLA430101:中国检验检疫科学研究院；RumeiChen, Guangxing Xuej Yunliu Fan et al., Transgenic maize plants expressing afungal phytase gene.Transgenic Res(2008) 17:633-643。实施例1、标准分子pEASY-HFl的构建及特异性引物和探针的合成一、标准分子pEASY-HFl的构建合成序列表中序列I所示的DNA片段，自5’端至3’端依次为:乙烯形成酶反义基因(ant1-EFE基因)片段(第1-87位)-Hind II1-番茄内源基因Lat52片段(第94-185位)-BamH 1-Ti质粒T-DNA的右边界序列(右边界序列RB)片段(第192-299位)。将上述合成的序列表中序列I所示的DNA片段以T-A克隆的方式与pEASY_T3载体相连，以连接产物转化大肠杆菌，对重组菌悬液采用引物HF299-F和HF299-R进行PCR检测。同时以合成的序列表中序列I所示的DNA片段为模板作为阳性对照。
HF299-F:5’ -CTGCATCACTTCCTGGATTGTA-3’(序列 I 的第 1-22 位)；HF299-R:5’-CCAAACGTAAAACGGCTTGTCC-3’(序列 I 的第 278-299 位的反向互补序列)结果如图1所示，PCR检测的16个克隆均为阳性。进一步对阳性克隆送样测序。经测序表明正确连入序列表中序列I所示DNA片段的pEASY-T3载体为阳性，将其命名为pEASY-HFl (图2)。所得重组载体pEASY-HFl即为标准分子。二、特异性引物和探针的合成根据上述步骤一中合成的序列表中序列I所示的DNA片段，针对各基因设计如表I中所示的各特异性引物和探针。表I华番I号引物探针序列
权利要求
1.环状载体，包括乙烯形成酶反义基因片段、番茄内源基因Lat52片段，以及Ti质粒T-DNA的边界序列片段。
2.根据权利要求1所述的环状载体，其特征在于:所述乙烯形成酶反义基因片段的序列如序列表中序列I的第1-87位所示；或 所述番茄内源基因Lat52片段的序列如序列表中序列I的第94-185位所示；或 所述Ti质粒T-DNA的边界序列片段的序列如序列表中序列I的第192-299位所示。
3.根据权利要求1或2所述的环状载体，其特征在于:所述环状载体为将所述乙烯形成酶反义基因片段、所述番茄内源基因Lat52片段、所述Ti质粒T-DNA的边界序列片段一同与pEASY-T3质粒连接后得到的重组载体。
4.根据权利要求3所述的环状载体，其特征在于:所述环状载体为将如序列表中序列I所示的DNA片段与所述PEASY-T3质粒连接所得的重组载体。
5.权利要求1-4中任一所述的环状载体在作为标准分子检测转基因番茄品系华番I号中的应用。
6.定性或定量检测转基因番茄品系华番I号的试剂盒，包括权利要求1-4中任一所述的环状载体和如下(al)_ (a3)中的全部或部分: (al)由序列表中序列2和序列3所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸序列如序列表中序列4所不的探针； (a2)由序列表中序列5和序列6所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸序列如序列表中序列7所不的探针； (a3)由序列表中序列8和序列9所示单链DNA组成的引物对，以及核苷酸序列如序列表中序列10所示的探针。
7.权利要求6所述的试剂盒在作为标准体系检测转基因番茄品系华番I号中的应用。
8.制备权利要求6所述试剂盒的方法，包括如下步骤:将权利要求6所述试剂盒中的所述环状载体、各引物对和各探针分别单独包装。
全文摘要
本发明公开了一种特异性检测转基因番茄品系华番1号的标准分子及其应用。本发明所提供的标准分子为环状载体，包括如序列1的第1-87位所示的乙烯形成酶反义基因片段、如序列1的第94-185位所示的番茄内源基因Lat52片段，以及如序列1的第192-299位所示的Ti质粒T-DNA的边界序列片段。实验证明，本发明所提供的标准分子具有较高的灵敏度，其最低检测线可达2拷贝，线性范围广，均匀性好，稳定性强，对于转基因番茄品系华番1号的定性和定量检测具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK103194473SQ201310088348
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者黄新, 任鹤 申请人:中国检验检疫科学研究院