专利名称：高效表达人pkm1蛋白的dld1稳定细胞株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种高效表达人丙酮酸激酶PKMl蛋白的DLDl稳定细胞株及其构建方法。
背景技术：
肿瘤细胞即使在有氧存在的情况下，也主要通过糖酵解而不是氧化磷酸化进行代谢，同时伴有葡萄糖消耗和乳酸生成率的升高。这一糖代谢异常现象称为Warburg效应。糖酵解作为肿瘤细胞的主要产能方式，在肿瘤细胞生存、增殖中起到重要作用。为什么肿瘤细胞产能方式会发生改变呢？虽然该过程并完未被完全理解，但目前认为丙酮酸激酶在肿瘤细胞能量代谢改变过程中发挥重要作用。丙酮酸激酶是糖酵解途径的一个关键酶和限速酶。在哺乳细胞株中，丙酮酸激酶存在PKMl、PKM2、PKL和PKR四种同工酶，它们只在特定的组织中表达。PKL和PKR由基因PKL编码，分别表达于肝细胞和红细胞中。PKMl和PKM2是PKM基因选择性剪切的产物，两者都由531个氨基酸组成，其中23个氨基酸存在差异，这导致它们酶学特征完全不同。其中PKMl在于脑与骨骼肌中表达，保留了外显子9，它的丙酮酸激酶活性比PKM2要高，不能被磷酸化和被别构调控；PKM2在胚胎组织和肿瘤组织中表达，保留了外显子10。Christofk等在Nature上的报道发现用PKMl取代肿瘤细胞中的PKM2会降低糖酵解速率，并在体内实验证明PKMl取代PKM2会降低成瘤率和瘤块大小。研究发现，Wnt信号通路激活与结直肠癌的发生、发展密切相关。结肠癌DLDl细胞的fct信号处于活化状态，有助于DLDl细胞适应肿瘤微环境和生存。然而PKMl在结肠癌Wnt/i3-catenin信号中的作用机制未见报道。目前，文献报道PKMl功能研究主要采用表达质粒瞬时转染方法，其缺点是PKMl的表达不稳定、不持久。然而，慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，能特异、持续、高效、稳定促进目的基因表达的优点。现有技术中尚无持续、高效表达PKMl基因的结肠癌DLDl稳定细胞株。本发明通过慢病毒转染得到的稳定细胞株，为研究结肠癌fct信号通路与肿瘤能量代谢提供有力工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效表达人PKMl蛋白的DLDl稳定细胞株及其构建方法，该细胞株可用于研究结肠癌fct信号通路与肿瘤能量代谢提供有力工具。本发明提供的一种高效表达人PKMl蛋白的DLDl稳定细胞株的构建方法，包括如下步骤:I)利用基因重组技术将人PKMl基因克隆入慢病毒表达载体pLVX-AcGFPl-Nl中，构建成pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl，重组质粒经酶切鉴定；2)在IOcm的培养皿中铺1.4X IO6个293T细胞，加入IOmL含10%胎牛血清、无抗生素的DMEM培养基，37°C、5%C02培养细胞使汇合度达到80% ；3)在无菌 EP 管中将载体 pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl、psPAX2、pMD2.G 以质量比为 4:3:1且总体积不超过120ul混合，按磷酸钙法转染293T细胞；48h后收集293T细胞的上清，在IOOkD浓缩管中2000r/min离心lOmin，除去细胞碎片，得到病毒浓缩液，于一 80°C长期保存；4)在6孔板中培养DLDl细胞，用含10%胎牛血清不含任何抗生素的RPM1-1640培养基，37°C、5%C02的培养箱中培养，使细胞汇合度达到80% ;然后换含8μ g/ml polybrene的RPM1-1640培养基，加入IOOul步骤3)得到的病毒浓缩液，转染48h后，加入终浓度5 μ g/mL的puromycin进行加药筛选；每3天更换一次含5 μ g/mL puromycin的RPM1-1640培养基，筛选4周后在显微镜下挑取阳性细胞簇，再用有限稀释法把阳性细胞簇在96孔板中筛选；5)通过RT-PCR鉴定阳性细胞簇、扩大培养，收获蛋白再用Western blot进行鉴定，最终获得稳定细胞株，将其冻于液氮中保藏。与现有技术相比，本发明通过慢病毒转染得到的稳定细胞株，具有转染效率高，用量少，能特异、持续、高效、促进PKMl稳定表达的优点。本发明为研究结肠癌fct信号通路与肿瘤能量代谢提供有力工具。
图1:pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl重组质粒的酶切图(其中泳道I是重组质粒经BamHI和XhoI双酶切)图2:pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl重组质粒的测序鉴定3:高效表达人PKMl基因的DLDl稳定细胞株在Delta vision下(20X)的细胞荧光鉴定图
图4:高效表达人PKMl基因的DLDl稳定细胞株RT-PCR鉴定5:高效表达人PKMl基因的DLDl稳定细胞株Western blot鉴定图。泳道I为对照，泳道2为稳定细胞株，抗体为GFP
具体实施例方式实施例11、重组人丙酮酸激酶PKMl基因慢病毒表达载体的构建根据PKMl基因的编码序列(GenBank NM_182471.2)设计两端带有BamHI和Xho I 酶切位点及保护碱基的特异引物:5 ’ -CCGCTCGAGGCCACCATGTCGAAGCCCCATAGTGAAG-3’ 和 5’ -CGCGGATCCCGCGGCACAGGAACAACACG-3’，从人结肠细胞 NCM460 的 cDNA 中扩增PKMl基因。BamHI和XhoI双酶切、胶回收目的基因片段，与同样BamHI和XhoI双酶切的pLVX-AcGFPl-Nl载体进行连接，得到重组质粒pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl，通过双酶切鉴定(见图1)及测序鉴定重组质粒(见图2)。2、DLDl细胞和293T细胞的培养与传代细胞来源于山西大学生物技术研究所，复苏好的DLDl细胞置于IOcm培养皿，在含10% (V/V)的胎牛血清及不添加任何抗生素的RPM1-1640培养基中培养。用0.lmg/mL的多聚赖氨酸铺被IOcm培养皿5min，将其吸除，干燥培养皿，复苏好的293T细胞置于该培养皿中。293T细胞在含10% (V/V)的胎牛血清，不添加任何抗生素的DMEM培养基中培养。细胞汇合度达到80%传代，用PBS洗2次，加入ImL的0.25%胰酶消化，分别加入相应的含10%胎牛血清的RPM1-1640、DMEM终止消化，按1:3分装于3个细胞培养瓶中加相应的培养基培养。3、293T细胞转染、慢病毒包装和收获1)转染第一天，在IOcm培养皿中铺1.4X IO6个293Τ细胞，过夜培养使得次日细胞汇合度达到80%。2)转染第二天，在3个无菌EP管分别以质量比为4:3:1且总体积不超过120ul混合质粒 pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl (以 pLVX-AcGFPl-Nl 为对照)、psPAX2、pMD2.G，加入到 600ulCaCl2溶液中轻柔混匀。将混合液加入至600ul BBS溶液中(碧云天公司)，轻柔混匀，室温放置20min。将混合液加入IOcm培养皿的293T细胞培养液中，轻柔混匀，37°C、5%C02培养12h，倒去含有转染混和物的培养液，换含10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养36h。4)转染第四天，收集293T细胞上清液。将上清液置于IOOkD浓缩管中2000r/min离心lOmin，除去细胞碎片，至500ul的病毒浓缩体积，将病毒浓缩液按IOOul分装于一80°C长期保存。4、DLDl细胞的转染及筛选I)转染第一天，在6孔板中铺I X IO6个DLDl细胞，夜培养使得次日细胞汇合度达到 80%ο2)转染第二天，将培养基换成无血清、无抗生素且polybrene终浓度为8 μ g/ml的RPM1-1640培养基，加入100μ I用pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl包装的病毒浓缩液(以pLVX-AcGFPl-Nl病毒浓缩液为对照)轻柔混匀。37°C、5%C02培养48h。3)转染第四天，在荧光显微镜下观察绿色荧光(见图3)，换含10%胎牛血清的RPM1-1640 培养基,加 5 μ g/mL puromycin 筛选。每 3 天更换一次含 puromycin (5 μ g/mL)的培养液，筛选4周左右，6孔板中可见阳性细胞簇。4)在显微镜下挑取阳性细胞簇，再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。在荧光显微镜下观察单克隆形成的情况，对荧光强度较高的阳性克隆孔，扩大培养，并通过RT-PCR进行鉴定。对于经RT-PCR鉴定阳性克隆，扩大培养，提取蛋白进行western blot鉴定，最终获得稳定细胞株，并冻存于液氮中。5、高效表达人PKMl蛋白的DLDl稳定细胞株的鉴定I)根据人丙酮酸激酶PKMl基因的外显子9，设计一对特异引物F:5 ‘-GAAGAACTTGTGCGAGCCT-3’ 和 R:5 ‘-CGTCAGAACTATCAAAGCTGC-3’。以这两种稳定细胞株的mRNA反转录成的cDNA为模板，通过RT-PCR检测基因的表达变化(见图4)，反应条件为95°C, 30s ；(95°C /5s,60°C 34s) 40 个循环；添加熔解曲线。2)提取两种稳定细胞株的细胞总蛋白，western blot检测细胞PKMl的蛋白水平(见图5)。
权利要求
1.一种高效表达人PKMl蛋白的DLDl稳定细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)利用基因重组技术将人PKMl基因克隆入慢病毒表达载体pLVX-AcGFPl-Nl中，构建成pLVX-AcGFPl-Nl-PKMl，重组质粒经酶切鉴定； 2)在IOcm的培养皿中铺1.4父106个2931'细胞，加入IOmL含10%胎牛血清、无抗生素的DMEM培养基，37°C、5%C02培养细胞使汇合度达到80% ； 3)在无菌EP 管中将载体 pLVX-AcGFP1-Nl-PKMl、psPAX2、pMD2.G 以质量比为 4:3:1且总体积不超过120ul混合，按磷酸钙法转染293T细胞；48h后收集293T细胞的上清，在IOOkD浓缩管中2000r/min离心lOmin，除去细胞碎片，得到病毒浓缩液，于一 80°C长期保存； 4)在6孔板中培养DLDl细胞，用含10%胎牛血清不含任何抗生素的RPM1-1640培养基，37°C、5%C02的培养箱中培养，使细胞汇合度达到80% ;然后换含8 μ g/ml polybrene的RPM1-1640培养基，加入IOOul步骤3)得到的病毒浓缩液，转染48h后，加入终浓度5 μ g/mL的puromycin进行加药筛选；每3天更换一次含5 μ g/mL puromycin的RPM1-1640培养基，筛选4周后在显微镜下挑取阳性细胞簇，再用有限稀释法把阳性细胞簇在96孔板中筛选; 5)通过RT-PCR鉴定阳性细胞簇、扩大培养，收获蛋白再用Westernblot进行鉴定，最终获得稳定细胞株，将其冻于液氮中保藏。
2.如权利要 求1所述构建方法获得的高效表达人PKMl蛋白的DLDl稳定细胞株。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达人PKM1蛋白的DLD1稳定细胞株及其构建方法，属于动物细胞株领域。该细胞株的建立方法是构建重组人PKM1基因慢病毒表达载体，慢病毒包装、收获，转染DLD1细胞，经puromycin筛选、RT-PCR和Western blot技术检测，得到稳定细胞株。依照该方法建立的稳定细胞株为研究结肠癌Wnt信号通路与肿瘤能量代谢提供了有力的工具。
文档编号C12N15/54GK103160469SQ20131008801
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者杨鹏, 李卓玉, 李宗伟, 付荣, 李汉卿 申请人:山西大学