专利名称：一种优良食味品质转基因水稻及培育方法
技术领域：
本发明是一种植物生物技术领域的降低水稻种子中表观直链淀粉含量的方法，具体涉及一种用RNA干扰技术降低水稻种子中直链淀粉含量从而改良稻米品质的方法。
背景技术：
植物转基因技术通过各种方法将动植物或微生物中分离得到的目的基因转移到植物的基因组中，使之稳定表达。该技术应用于农业，在农作物抗虫、抗逆、抗病及品质改良方面发挥巨大作用。淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，是水稻胚乳中最主要的贮存物质，两类淀粉的组成比例是决定稻米适口性的最重要因素之一。通常来说，食味值好的稻米的直链淀粉含量(AC)为10-20%。一般而言，AC越高的品种其RVA (快速粘度分析)谱崩解值越小，消减值和回复值越大(贾良等，作物学报，2008，34 (5):790-794)。而崩解值在一定程度上与柔软性、粘散性、滋味、馨香味、光泽、冷饭质地等食味指标呈现正相关性(李欣等，中国农业科学，2005, 38 (4): 657-663)。在当今市场上，软米因其口感粘香且硬度适中，价格远高于东北大米等常规稻米。这类稻米中的直链淀粉含量往往较低，介于8-12%之间。水稻胚乳中参与淀粉合成的酶至少有四大类，分别是ADP葡萄糖磷酸合成酶(AGPP)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)及淀粉去分支酶(DBE)。淀粉合成酶主要由颗粒性淀粉合成酶(GBSS)及可溶性淀粉合成酶(SSS)组成， 其功能分别是合成直链淀粉及支链淀粉。可溶性淀粉合成酶按其功能又被分为八种同工型，即SSS1、SSSIIa, SSSIIb,SSSIIc,SSSIIIa,SSSIIIb,SSSIIIc,SSSIVa和SSSIVb等，其中的几个基因已有较深入的功能研究。例如，水稻SSSI基因在胚乳早期到末期都发挥作用。Fujita等通过对水稻SSSI基因突变体的研究发现，该基因突变后稻米糊化温度增加，而淀粉颗粒形状大小及结晶度无变化(Fujita 等，Plant Physiology, 2006,140 (3):1070 - 1084)。SSSIIa 突变体的淀粉易糊化、也易溶于尿素，推测SSSIIa在淀粉合成中的作用是延长支链淀粉上的A和BI链(Nakamura 等 2002，104(1):1-8 ；Qian 等，2011，53(9):756 - 765)。在 SSIIIa 基因缺失后，直链淀粉含量稍有提高，支链淀粉中的长支链增加，淀粉颗粒形态发生变化，直径变小且形状变圆，结晶度降低(Fujita, Plant Physiology, 2007，144 (4):2009_2023)。而 SSSIIb 作为水稻可溶性淀粉合成酶亚家族的一员，其功能尚未见报道。在本发明中，利用转基因手段，采用RNA干扰技术，抑制了水稻中SSSIIb基因的表达。通过多代自交和选育，获得了纯合的转基因新品系。对转基因水稻新品系成熟稻米进行品质检测，显示该稻米直链淀粉含量有明显的降低；利用淀粉粘度速测仪(RVA仪)对米粉检测，发现其粘度下降，预示该类稻米会具有较优良的食味品质。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育转基因水稻的方法，该方法获得的稻米具有较优良的食味品质。
本发明构建了水稻SSSIIb基因的RNA干扰载体，将其导入水稻品种日本晴中，并通过PCR扩增等技术手段进行检测，结果表明RNA干扰载体已经导入至水稻材料中并得到表达。本发明一种培育优良食味品质稻米的方法，是通过干扰水稻中可溶性淀粉合成酶SSSIIb基因表达得以实现。具体是构建SSSIIb基因RNA干扰载体，利用农杆菌介导的方法将干扰载体导入水稻，获得干扰SSSIIb基因的转基因水稻。本发明所述的方法，包括如下步骤:(I)以序列如SEQ ID N0.2和3的引物对，扩增得到序列如SEQ ID N0.1所示和扩增产物；(2)构建RNA干扰载体:利用植物组成型表达启动子，构建含SEQ ID N0.1序列正反向片段的植物表达载体；(3)将步骤(2)的RNA干扰载体导入水稻品种中，获得转基因水稻。上述序列SEQ ID N0.1是水稻可溶性淀粉合成酶IIb基因(SSSIIb)编码区中的一段序列，与SSSIIb基因第2至5外显子间583bp序列同源。本发明还公开了一种转基因水稻，它是通过下述方法获得:(I)以序列如SEQ ID N0.2和3的引物对，扩增得到序列如SEQ ID N0.1的片段；(2)构建RNA干扰载体:利用植物组成型表达启动子，构建含SEQ ID N0.1序列正反向片段的植物表达载体；(3)将步骤(2)的RNA干扰载体导入水稻品种中，获得转基因水稻。
上述步骤(2)具体是:扩增产物经T/A克隆连接入pMD18-T载体，用BamH I和Xba I双酶切回收目的片段I ;将目的片段I通过Bgl II和Xba I双酶切位点插入载体PlOll得到PlOll-1 ;再将目的片段I通过BamH I和Spe I双酶切位点插入载体pl011-1，获得RNA干扰载体。本发明中所述的RNA干扰载体通过根瘤农杆菌介导等转基因方法，将RNA干扰载体导入水稻品种中，获得转基因水稻；相对于未转化水稻品种，该种转基因水稻稻米具有适当降低的表观直链淀粉含量，食味品质明显改良。本发明提供了一种降低水稻直链淀粉的方法，对已干扰SSSIIb基因表达的转基因水稻稻米进行各项品质指标的检测，显示其品质特性发生了一系列变化。该品系与亲本日本晴相比，稻米淀粉粘度值及直链淀粉含量均下降，食味有所改善。
图1是含SSSIIb基因RNA干扰结构的农杆菌双元载体T-DNA区的结构。其中，P35S和T35S分别表示35S基因的启动子和终止子区；N0S表示农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子；Hyg表示潮霉素抗性基因；CTS，β葡萄糖苷酸酶基因；LB和RB示T-DNA区的左右边界序列。Anti和Sense分别表示用于构建RNA干扰载体的SSSIIb基因片断的反向和正向结构。图2是利用PCR技术鉴定转基因水稻。其中1-8为含有RNA干扰结构的8个转基因系，9为未转化亲本日本晴。图3是含有RNA干扰结构的纯合转基因水稻及其未转化对照稻米的直链淀粉含量。SSSIIb1-1 — SSSIIb1-4 为 4 个转基因系。图4是含有RNA干扰结构的纯合转基因水稻及其未转化对照米粉的粘滞性谱特征图。SSSIIb1-1 — SSSIIb1-4 为 4 个转基因系。
具体实施例方式通过以下三个实例进一步对本发明进行了说明与定义而并非限制。通过实例，科研人员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获得不同的研究效果。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。实验过程中涉及到的试剂均为常规试剂，使用均参照产品使用说明书使用。实施例1DNA序列的获得及RNA干扰载体的构建根据水稻全基因组信息，获得SSSIIb的编码序列后，在Grammne网站上比较该基因与其他同工型的同源性。设计特异性引物SSSIIbi(上游引物5’-AGGCTGATCATGTTGAG-3’，SEQ ID N0.2 ;下游引物 5’-G TGTTGATTTTGTGTTT-3’，SEQ ID N0.3)用于 RNA 干扰片断的扩增。扩增出的序列如SEQ ID N0.1。取日本晴的幼嫩水稻叶片用冷酚法提取水稻总RNA，用凝胶琼脂糖电流及分光光度计检测RNA的纯度及浓度后,对Iul总RNA进行反转录，反转录酶购自Fermentas公司(商品序号:00082399)。用Iul反转录产物作模板，以特异性引物SSSIIbi进行常规PCR扩增。PCR扩增产物经T/A克隆连接入pMD18-T载体(购自TaKaRa公司，商品序号:D103A)，筛选阳性克隆送上海生工生物工程公司测序。筛选出测序完全正确的阳性克隆，用双酶切(BamH I和Xba I )后在1%琼脂糖凝胶电泳上分离，采用胶回收试剂盒回收目的片段(命名为I)。同时，采用双酶切(Bgl II和Xba I)消化载体PlOll (由发明人自行构建，详见:Zhu等，High-amylose rice improves indices of animal health in normal and diabeticrats.Plant Biotec hnology Journal.2012, 10 (3): 353-362),电泳分离后回收载体片段。将酶切回收的目的基因片段和PlOll载体片段连接，转化入DH5a感受态细胞中；采用酶切和/或PCR技术筛选鉴定连接正确的阳性克隆称为PlOll-1 ;再用BamH I和Spe I双酶切载体P1011-1，然后再与上述双酶切后回收的目的片段I相连接，经鉴定筛选获得含有SSSIIb基因RNA干扰结构的RNA干扰载体。该重组质粒中即含有正和反向的两个目的片段序列，正反向序列之间还含有一个水稻谷蛋白基因的第2内含子(Intron)(图1)。实施例2含RNA干扰载体转基因水稻的培育与鉴定水稻组织培养和农杆菌介导的转化程序均按发明人所在实验室已建立的方法进行(刘巧泉等，根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立，植物生理学，1998，24 (3): 259 271)。以日本晴成熟胚为外植体，在N6D2培养基上诱导出愈伤组织作为转化受体，通过农杆菌介导将构建的RNA干扰结构导入水稻愈伤组织中；在共培养基N6D2C上共培养3天后，将愈伤组织转入N6D2S1选择培养基筛选14天左右，然后再在N6D2S2选择培养基上进行筛选，根据愈伤实际生长情况调整筛选的次数和天数。获得了较多的抗性愈伤组织，将这些抗性愈伤组织经过预分化后，移入分化培养基中分化再形成小苗，最终得到了大量转基因水稻。为检测目的基因是否整合入转基因水稻植株中，提取转基因水稻单株总DNA。以RNA干扰载体上的Gtl内含子和NOS终止子上的一对引物INT-F(5-CCTCGTAATCAATTGTTAGG-3, SEQ ID N0.4)和 NOS-R (5-GACCGGCAACAGGATTCAAT-3，SEQID N0.5)(引物位置见附图1)进行PCR扩增分析，挑选阳性植株(图2)，让其自交，经过2-3代选育获得纯合转基因系。实施例3转基因水稻稻米的品质表现按照农业部颁布的编号为NY147-88的文件方法测定稻米直链淀粉含量，在万分之一天平上准确称取50mg米粉装入50ml试管中，加入0.5ml无水乙醇使样品分散后，再加入4.5mll.0mol/1的NaOH溶液混匀，于沸水浴中20min后冷却至室温，蒸馏水定容。吸取5ml消化液，加入已盛有半瓶蒸馏水的IOOmL容量瓶中，再加入1.0mll.0mol/1的乙酸溶液使样品酸化；加入1.5ml0.02%的碘液，用蒸馏水定容，摇匀后静置15min ;以4.5mllN的NaOH加入0.5ml的95%乙醇代替样品，配制空白溶液。用空白溶液于分光光度计波长620nm处调节零点并测出有色样品液的吸光度值，最后以标准样品测得的光密度值及其相关的直链淀粉含量制作标准曲线，并根据此计算待测样品的直链淀粉含量。每个样品做3次重复。检测结果如图3所示，转基因系水稻的直链淀粉含量较亲本显著降低。稻米淀粉粘滞性测定按ACC (美国谷物化学协会)操作规程(1995) [93]进行(RVA仪购自·澳大利亚Newport Scientif ic仪器公司)。称取含水量为14%的样品3.0Og,加入蒸馏水25.0OmL。测定过程中罐内的温度变化如下:50°C保持lmin，以12°C /min的速度上升到 950C (3.75min)，95°C保持 2.5min,以 12°C /min 的速度下降到 50°C (3.75min)，50°C保持1.4min。搅拌器在起始IOs内转动速度为960r/min，以后保持在160r/min。粘滞性值用“cp”作单位表示。数据分析用TCW(Thermal Cycle for Windows)配套软件进行。分析结果表明，与未转化对照相比，转基因稻米的崩解值升高，而回升值下降(图4)。预示稻米食味品质已经得到改良。
权利要求
1.一种优良食味品质转基因水稻的培育方法，其特征在于:构建5 /Λ基因RNA干扰载体，利用农杆菌介导的方法将干扰载体导入水稻，获得干扰基因的转基因水稻。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤如下: Cl)以序列如SEQ ID N0.2和3的引物对，扩增得到序列如SEQ ID N0.1的片段； (2)构建RNA干扰载体:利用植物组成型表达启动子，构建含SEQID N0.1序列正反向片段的植物表达载体； (3)将步骤(2)的RNA干扰载体导入水稻品种中，获得转基因水稻。
3.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)是:扩增产物经Τ/Α克隆连接入PMD18-T载体，用BanM I和Xba I双酶切回收目的片段I ;将目的片段I通过偷I II和Xba I双酶切位点插入载体PlOll得到PlOll-1 ;再将目的片段I通过BernM I和Spe I双酶切位点插入载体Ρ1011-Ι，获得RNA干扰载体。
4.一种转基因水稻，其特征在于通过下述方法获得:构建基因RNA干扰载体，利用农杆菌介导的方法将干扰载体导入水稻，获得干扰基因的转基因水稻。
5.如权利要求4所述的转基因水稻，其特征在于通过如下步骤得到: Cl)以序列如SEQ ID N0.2和3的引物对，扩增得到序列如SEQ ID N0.1的片段； (2)构建RNA干扰载体:利用植物组成型表达启动子，构建含SEQID N0.1序列正反向片段的植物表达载体； (3)将步骤(2)的RNA干扰载体导入水稻品种中，获得转基因水稻。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)是:扩增产物经Τ/Α克隆连接入PMD18-T载体，用BanM I 和Xba I双酶切回收目的片段I ;将目的片段I通过偷I II和Xba I双酶切位点插入载体PlOll得到PlOll-1 ;再将目的片段I通过BernM I和Spe I双酶切位点插入载体Ρ1011-Ι，获得RNA干扰载体。
全文摘要
本发明公开了一种生物技术领域的降低稻米表观直链淀粉含量和改善淀粉粘性、从而改良稻米食味品质的方法，此方法通过干扰水稻中可溶性淀粉合成酶SSSIIb基因表达得以实现。构建了SSSIIb基因RNA干扰载体，利用农杆菌介导的方法，获得了干扰SSSIIb基因的转基因水稻。通过PCR实验表明，目的基因已经整合到水稻基因组中。选育得到纯合系转基因水稻，该类转基因水稻胚乳中直链淀粉含量较未转化亲本日本晴有明显的降低。通过快速粘度测试仪分析表明，转基因稻米淀粉粘度降低，且糊化温度降低，稻米的食味特征明显改善。
文档编号C12N15/82GK103146746SQ20131008716
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月18日 优先权日2013年3月18日
发明者刘巧泉, 李娟 , 张昌泉, 蒋美艳, 于恒秀, 顾铭洪 申请人:扬州大学