专利名称：一种花生种胚特异性启动子及其克隆和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子遗传学领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及了一个新的花生基因的特异性启动子的克隆。
背景技术：
种子在农业生产和国民经济中占有举足轻重的地位。统计数据表明，人类粮食的80%直接取自植物的种子，稻、麦等种子中富含淀粉，是人类赖以生存的主粮；大豆、花生、油菜、芝麻等种子的含油量高，是食用油的主要来源。种子中储存物质的多少，直接影响作物的产量。因此，提高粮食作物和油料作物产量的根本在于提高其种子中储藏物质的积累量。尽管常规育种技术所培育的优良作物品种，为解决世界粮食安全问题做出了重大贡献。然而，近20年来许多作物产量呈现徘徊局面，新育成品种在产量潜力上没有大的突破，常规育种技术在继续提高作物产量方面的潜力有限。因此，挖掘新的功能基因，利用转基因技术提高花生等作物产量及种子的含油量具有巨大的应用价值。被子植物胚胎发育主要经历了 3个相互交错的阶段:第一阶段为组织分化期，单细胞的受精卵经过多次分裂，并分化形成胚性组织和器官(即幼胚，从球形胚到心形胚期);第二阶段为细胞伸长期(胚发育到鱼雷胚期)，此时细胞分裂基本停止，以细胞膨大伸长和储藏物质积累为主要特征；第三阶段是成熟脱水期，种子开始脱水标志着胚胎发育成熟，种子经过脱水后代谢活动下降直至静止。对拟南芥种子发育表达谱研究的结果发现，大约289个种子特异性表达基因参与了胚胎发育，其中发现48个在不同发育阶段表达和定位在种子不同区域的转录因子基因对种子发育和储藏物质积累起重要的调控作用。对这些基因进行功能解析和表达调控研究具有重要意义。花生作为重要的油料作物，不仅在国内农业经济中具有重要地位，而且在世界贸易中也具有举足轻重的作用。研究表明，不同植物种子储藏油脂的含量存在很大差异如主要油料作物油菜为2 8%-48%、大豆15%-22%、花生44%_54%、芝麻45%_57%，并且其主要脂肪酸组成也不同，油菜油中含有大量的芥酸(31-55%)，其他含量较高的不饱和脂肪酸为油酸14-19%、亚油酸12-24%和亚麻酸1-10%;大豆油中含量最高的为亚油酸52-65%和油酸25-36%，并且棕榈酸(6-8%)、硬脂酸(3-5%)和亚麻酸(2_3%)也占有较大比例；花生种子脂肪酸组成主要是:棕榈酸，油酸和亚油酸，分别占总脂肪酸含量的10%、36-67%和15-43%，是除橄榄油外单不饱和脂肪酸油酸含量最高的。研究调控花生种子发育和储藏物质积累相关基因的表达对于通过基因工程改良其他作物具有一定指导意义。目前在植物基因工程研究中，大多采用的是组成型启动子，如CaMV35S启动子、玉米Ubiquitin启动子等，这些启动子能够驱动外源基因在植物的所有组织和器官中高效表达，造成能量浪费，有些外源基因的表达还影响了植物的正常发育。为在确保植物正常生长的情况下，对目标性状进行转基因遗传改良，调控基因在一定发育时期和特定组织中表达非常重要。因此，寻找时空特异性表达启动子十分重要，也具有重要应用价值。
发明内容
基于上述的原因，本发明克隆获得了一个新的花生LECl基因的启动子，该启动子于种子特定发育阶段驱动基因在种胚或胚乳中特异表达。本发明构建了该启动子及6个其5'端系列缺失的启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥。实验表明，包括5'端非翻译区和其上游2228bp启动子驱动的GUS基因特异地在发育早期的种胚中表达；而缺失5'端975bp-2009bp的1254bp、935bp、721bp、617bp启动子驱动的⑶S基因在根、茎、叶、花和发育早期的种子中均有表达，表明_2228bp至-1255bp区段不仅含有种子特异性表达的正调控元件，还包括抑制在其他组织中表达的负调控元件。缺失5,端1875bp的354bp启动子驱动的⑶S基因在叶和发育早期的种胚中表达，在根中有少量表达，而在茎和花中没有表达。进一步缺失5'端2124bp的105bp启动子驱动的GUS基因仅在叶缘处表达，其余组织和器官都未检测到表达。因此，这一启动子的克隆和缺失分析对于研究植物种子发育和储藏物质积累，提高种子中储藏物质如淀粉、脂肪及蛋白的含量具有重要的理论意义和实际应用价值。该启动子能驱动GUS基因在种子发育早期的种胚中特异表达。营养生长期的根、茎、叶中和进入生殖生长期的花中不表达。其基因序列如Seq ID No:4所示。该启动子是在已得到的花生AhLEClA基因的基因组序列(该基因其序列为:如SeqID No:2所示)的基础上，通过染色体步移技术得到的2739bp AhLEClA基因5'端上游序列，如Seq ID No:1所示。经转录起始位点分析发现，AhLEClA基因转录起始位点位于翻译起始密码ATG上游-82nt处，故2739bp5 '端上游序列中包含该基因2625bp的启动子区，该区域的序列如Seq ID No: 3所示。通过PlanCARE和PLACE软件对该启动子进行顺式调控元件分析，有2个胚乳特异性调控元件SKn-1 motif (GTCAT),分别处于-83 _87bp和-479 -483bp处；在-448 _454bp和-1603 _1609bp处分别有一个胚或胚乳特异性作用元件 CANBANAPA(CNAACAC);在-1244 -1253bp、_2078 一2087bp 和-2271 _2280bp处分别有一个种子特异性表 达转录因子基因AGL15结合位点CARGCW8GAT (CffffffffffffffffG);此夕卜，还有四个胚特异性的ABA作用相关的DPBFC0RED⑶C3元件(ACACNNG)分布在-116 -12Obp,-450 -456bp、-1326 _1332bp 和-1329 _1335bp 处。获得的 2625bp 启动子序列中还包括大量在叶肉细胞、根和花中特异表达的元件CACTFTPPCA1 (YACT)、R00TM0TIFTAP0X1(ATATT)和P0LLEN1LELAT52 (AGAAA),同时包含13个转录的负调控元件WB0XATNPR1(TTGA0.WRKY710S (TGAC)。这些负调控元件中5个位于启动子-1255 -2228bp区段(分别位于-1613 -1616bp、-1649 _1652bp、_1953 _1956bp、_2144 _2147bp、_2156 -2159bp)，-2228 -2625bp还集中分布了 4个WRKY710S元件(-2275 _2278bp、_2281 -2284bp、-2445 -2448bp、-2472 _2475bp )，-1 -1254bp 区段仅含有 4 个 WRKY7IOS 元件(位于-82 -85bp、-97 -1OObp、-478 -48Ibp和-870 _873bp)。因此，该启动子驱动的⑶S基因在种胚中特异表达受种子特异性表达调控元件和抑制在其他组织中表达的负调控元件的共同调控。存在的种子特异性表达调控元件和转录负调控元件的位置如说明书附图2所
/Jn o为了完成该启动子的初步功能分析，本发明以PCAMBIA3301为出发载体构建了含有AhLEClA基因不同长度启动子片段的GUS基因植物表达载体，即用AhLEClA基因不同长度启动子片段取代PCAMBIA3301中驱动⑶S基因表达的35S启动子，获得的植物表达载体转化农杆菌后，用花序浸染法转化拟南芥，即待拟南芥繁殖开花时，配制浸染液，用农杆菌浸染将要开放的花序。本发明分别取营养生长期的转基因拟南芥幼苗的根、茎和叶以及繁殖期的转基因拟南芥的花、授粉后10天和20天的种子，通过现有的方法检测GUS基因的表达情况。本发明发现，本发明所提供的启动子区域中，2228bp的启动子，其基因其序列如Seq ID No:4所示，即可驱动的⑶S基因仅在授粉后10天的种胚中表达，在营养生长期的根、茎、叶和生殖期的花中均不表达，在授粉20天的种子中也没检测到GUS基因的表达。由此可见，本发明克隆的花生AhLEClA基因的启动子具有早期发育种胚表达特异性，即表达的时空特异性。通过上述实验，发明人证实了，在本发明提供的2625bp的启动子区内缺失了 5'端396bp片段的2228bp具有早期发育种胚表达特异性，通过克隆出的2228bp特异性启动子，其基因其序列如Seq ID No:4所示，即可在早期发育的胚中特异表达，同时利用这种特异性表达在早期发育胚中特异表达，可以应用在提高种子储藏物质含量中；构建该启动子和相关基因的表达载 体，调控淀粉、油脂或蛋白合成相关基因的表达，可能会影响花生及其它作物的产量；该启动子是一个时空特异性表达的启动子，因此，该启动子的克隆对植物转基因技术领域启动子的研究也具有重要意义。
图1:扩增的花生AhLEClA基因2739bp5,端上游序列扩增的电泳图，图中M为Trans5K DNA Marker, LD、LE、LP和LS为不同基因组文库扩增结果，LP泳道箭头所指为扩增的目的启动子片段；由图中结合实施例可知，扩增得到的序列为2739bp，包括2625bp的启动子序列、82bp 非编码区序列和32bp包括扩增引物序列在内的ORF区序列；图2:花生AhLEClA基因启动子区域可能的顺式作用元件；图3:花生AhLEClA基因启动子序列与⑶S基因的融合表达载体的构建流程图；图4:PCR检测具不同长度启动子驱动的GUS基因表达结构部分转基因拟南芥；图中编号36为启动子大小105bp，37为354bp，38为617bp，39为721bp，40为935bp，41为1254bp，42为2228bp ;M均为DL2000DNA Marker，其条带分子量大小自上而下分别为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ；图5:本发明所提供的2228bp启动子驱动的GUS基因表达结构转基因拟南芥种子⑶S活性组织化学检测图；由图可见授粉后10天的种子(上面8个)在胚胎发育的位置染为蓝色(箭头所示)，而授粉后20天的种子(下面8个)在任何部位均未检测到GUS染色； 图6为图5的彩色示意图；图7:本发明所提供的2228bp启动子驱动的GUS基因表达结构转基因拟南芥根、茎、叶和花⑶S活性组织化学检测图；图中42-9为转入2228bp启动子的基因株系号，CK-P为转基因阳性对照，CK-N为未转基因阴性对照；由图可见，无论根、茎、叶还是花仅有CK-P检测到⑶S染色，42-9株系和CK-N不同材料的所有样品均未检测到蓝色染色信号；
图8为图7的彩色示意图。
具体实施例方式本发明的实施步骤是根据花生AhLEClA基因的基因组DNA序列用染色体步移的方法克隆得到该基因的启动子序列一启动子顺式作用元件分析及功能预测一涉及带有酶切位点Hind III和Nco I的引物从启动子DNA上扩增得到不同长度的目的启动子序列一用同样的酶Hind III和Nco I酶切载体pCAMBIA3301 —目的片段连接到酶切的pCAMBIA3301载体上一含植物表达载体的农杆菌转化拟南芥一转基因拟南芥鉴定和筛选纯合体转基因株系一GUS组织化学染色检测GUS表达部位及强度，分析启动子功能。本实施例中的其他技术均采用已有技术。实施例1花生AhLEClA基因启动子的克隆1.1花生基因组DNA的提取用植物DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司产品)提供的方法提取花生幼叶的DNA，溶解于适量TE (pH8.0)缓冲液中。1.2花生AhLEClA基因启动子的克隆分别取2.g花生基因组DNA经Dral、EcoRV、PvuI1、StuI内切酶酶切、苯酚抽提纯化后，溶解于20iU TE(pH7.5)缓冲液中。分别取4 ill酶切完全的DNA，按照BDGenome Walker Universal Kit 的要求连接上 Adaptor (序列:5' GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT 3'，如 Seq ID No: 5 所示)，构建 4 个花生基因组 DNA 文库(LD、LE、LP、LS)。根据已获得的花生AhLEClA基因的基因组序列，设计该基因的2个嵌套的 3'端特异性引物 LEC1AGSP1-3 (5' `TGGGGATGGATAGAGAAACCAACGAGA 3'，如 Seq IDNo:6 所示)和 LEC1AGSP2-2 (5' TGATAACCGTGAAAGCCTCCTCCAGT 3'，如 Seq ID No:7 所示)。以 APl (5'端接头引物:5' GTAATACGACTCACTATAGGGC3 '，如 Seq ID No:8 所示)和LEC1AGSP1-3为引物进行第一轮扩增，扩增体系为25iU，模板量为1^1，扩增条件为:940C 25sec，72°C 3min，7 个循环；94°C 25sec，67°C 3min，32 个循环；最后 67°C继续延伸7min。第二轮巢式PCR模板为I ill第一轮PCR产物10倍稀释液，引物为5'端巢式接头引物 AP2 (5' ACTATAGGGCACGCGTGGT 3'如 Seq ID No:9 所示)和 LEC1AGSP2-2，扩增体系与第一轮 PCR 相同，扩增条件 94°C 25sec，72°C 3min，5 个循环；94°C 25sec，67°C 3min，20 个循环；最后67 °C继续延伸7min。1%琼脂糖电泳检测PCR结果。挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到PEASY-T3载体中，白色重组克隆经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。1.3RNA提取和转录起始位点确定用CTAB法提取不同发育时期种子的总RNA，经琼脂糖电泳检测RNA质量和分光光度计定量后，等量混合储存于_80°C冰箱备用。为防止RNA酶污染，研钵、研锤、药匙均以180°C烘烤6h，所用塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡，于室温下过夜后，高温灭菌处理。用Invitrogen公司GeneRacer Kit提供的方法和试剂，取5 ii g混合好的LH14种子总RNA，按照说明书要求用碱性磷酸酶(CIP)将截断的mRNA或其他非mRNA5'端去磷酸化，然后将抽提纯化并沉淀的全长mRNA脱去帽子结构，并连接上RNA接头(GeneRacerRNA Oligo:5, CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA 3,，如 Seq ID No:10所示)；以此RNA为模板，用试剂盒提供的随机引物和SurperScript III RT酶反转录合成cDNA ;最终将合成的cDNA克隆至载体pCR4_T0P0中，获得LH14不同发育时期种子全长cDNA文库，用于随后转录起始位点扩增。根据已获得的花生AhLEClA基因的cDNA序列，设计2个该基因的3'端特异性引物，引物序列为:TSS GSP1-15' TCTTTTGCGTCGTCGGAGATTTTAGC3'，如Seq ID No: 11所示，TSS GSP2与LEC1AGSP2-2相同。以构建的cDNA文库为模板，分别以 TSS GSPl-1 引物与 GeneRacer 5' Primer (5' CGACTGGAGCACGAGGACACTGA 3'，如Seq ID No: 12所示)进行第一轮PCR扩增，PCR体系参照BD Advantage 〗PCR Kit要求，扩增条件为:94°C预变性 2min ;94°C 30 sec, 72°C 30sec，5 个循环；94°C 30 sec, 70°C 30sec,5个循环；94°C 30 sec, 63°C 30sec,68°C 30sec，20-25个循环；最后 68°C继续延伸 lOmin。第一轮PCR产物经电泳检测后，用缓冲液稀释50倍，用于第二轮巢式PCR。取I Ul第一轮PCR产物，以 TSS GSP2 和 GeneRacerisV Nested PrimerC 5' GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA3'，如Seq ID No: 13所示)进行第二轮PCR，扩增条件为:94°C预变性2min ;94°C 30 sec,65°C 30 sec, 68°C 10 sec，35个循环；最后68°C继续延伸lOmin。1.5%琼脂糖电泳检测PCR结果。挖取并回收第二轮PCR特异性扩增产物，克隆到PEASY-T3载体中，白色重组克隆经EcoRI酶切检测，片段大小符合要求的克隆用ABI3730测序仪进行双向测序。1.4启动子序列分析应用在线植物转录元件分析工具PLACEChttp: //www.dna.affrc.g0.1o/PLACE/)、PlantCARE (http://bioinformatics, psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对花生AhLEClB启动子序列进行分析。1.5不同长度花生AhLEClA基因启动子片段的扩增设计克隆不同长度AhLEClA基因启动子所需的引物，引物Pl为3'端下游引物位于5' UTR区，序列如Seq ID No: 14所示；引物P2-P8为Y端上游引物，序列如Seq IDNo: 15-21所示。引物Pl中下划线部分CCATGG为Nco I酶切位点，其余部分为5' UTR序列；引物P2-P8中下划线部分AAGCTT为Hind III酶切位点，其余部分为启动子序列。利用引物Pl分别和P2-P8，以已克隆的含有AhLEClA基因2265bp启动子的重组质粒为模板，扩增不同长度的启动子片段，扩增片段长度分别为2228bp、1254bp、935bp、721bp、617bp、354bp和 105bp。PCR 扩增体系为 20 ii 1:包括 10XPCR buffer 2u l，dNTP mixure(各 2.5mM)l y 1，上、下游引物各Iu 1，模板DNAliil，Taq酶0.25iU，加ddH20补足20iU。反应程序为:预变性 94°C 2min;变性 94°C 30 sec，退火 55°C 30 sec，延伸 72°C 30 sec_2min (根据扩增片段长度调整)，30个循环；最后72°C继续延伸lOmin。扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小正确，回收目的片段，并测序验证序列正确。表1.AhLEClA基因启动子缺失分析引物
权利要求
1.一种花生LECl基因特异性启动子，其特征在于:其基因序列如Seq ID No:4所示。
2.根据权利要求1所述的特异性启动子，其特征在于:该启动子能驱动GUS基因在植物发育早期的种胚中特异表达。
3.根据权利要求1所述的特异性启动子，其特征在于:该启动子还包括含有如SeqIDNo:4所不基因序列的其他序列。
4.如权利要求所述花生LECl基因特异性启动子，在研究植物种子发育和储藏物质积累上的应用。
5.如权利要求所述花生LECl基因特异性启动子，在提高种子中储藏物质和作物产量上的应 用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，克隆获得了一个新的花生LEC1基因的启动子，其基因序列如SeqIDNo:4所示，该启动子于种子特定发育阶段驱动基因在种胚或胚乳中特异表达。本发明构建了该启动子及6个其5′端系列缺失的启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体，并转化拟南芥。最终证实包括5′端非翻译区和其上游启动子驱动的GUS基因特异地在发育早期的种胚中表达，这一启动子的克隆和缺失分析对于研究植物种子发育和储藏物质积累，提高种子中储藏物质如淀粉、脂肪及蛋白的含量具有重要的理论意义和实际应用价值。
文档编号C12N15/82GK103205427SQ20131008808
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者单雷, 唐桂英, 徐平丽, 柳展基, 陈营 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心, 单雷