专利名称：一种基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法
技术领域：
本发明属于环境污染控制和治理领域，具体涉及一种基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法。
背景技术：
在环境污染治理工作中，利用微生物降解污染物的环境生物处理技术一直是污染物处理的主流技术。环境生物技术处理的对象一般是各类有机污染物或具有还原性质的无机污染物，微生物对这些污染物的降解能力对处理效果具有决定性影响。当处理对象中含有难生物降解的污染物时(例如针对一些工业废水和废气)，筛选并应用污染物高效降解菌(称为生物强化)往往对工艺快速启动和提高处理效果具有明显效果和重要意义。目前，传统的降解菌筛选方法一般是从可能含有高效降解菌的混合培养体系中分离出大量单一菌株，再利用摇瓶间歇培养的方法对不同菌株的污染物降解能力进行比较和选择。由于分离出的备选单一菌株多、降解实验周期长、污染物分析过程复杂等原因，基于摇瓶间歇培养的高效降解菌筛选方法往往存在工作量大、药剂消耗多和筛选速度慢等缺点。因此，研究开发快速高效的降解菌培养方法对于缩短菌种筛选的工作周期和难度具有重要意义。基于微平板(mi CTowe 11 plate)的生化反应测试和细胞培养技术在生物、医学、环境等领域已经得到了广泛应用，例如酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、MTT细胞培养实验等。微孔的个数可根据需要设计，最常见的是96孔板。在微平板上，每个微孔就是一个小的间歇反应器，可以根据需要加入各种底物、酶、细胞、组织或显色剂等，并很方便地控制培养或反应的条件。在微平板培养过程中，往往通过对某些反应产物的颜色或吸光度的测定来判断反应的进程。由于具有体积小、消耗药剂少、所需培养空间小等优点，使用微平板在同样的实验室配置条件下可以完成大批量、高通量的样品测试任务。
发明内容
为克服上述现有技术的缺点，基于微平板的特点和难降解污染物高效降解菌筛选的需求，本发明提供了一种基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法，该方法可以对从菌种混合体中分离出来的大量单一菌株在同一块微平板上同时培养，并通过MTT (噻唑蓝)显色判断菌株代谢和对污染物的降解能力；使用该方法的药剂(包括菌剂)消耗量少、培养周期短、无需测定污染物浓度、占用空间小、实验人员工作量大幅减少，可同时实现大批量菌株的同时检测，显著缩短菌种筛选的时间，提高了菌种筛选的效率；发明用显色的方法代替了污染物浓度分析，从而实现了快速、高效的污染物降解菌筛选。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法，包括如下步骤:步骤 1，取含有相应污染物高效降解菌的土壤、污泥或生物膜样品，用无菌生理盐水洗涤形成含有混合菌种的菌悬液；步骤2，取上述含有混合菌种的菌悬液，在平板培养基上通过多次划线分离得到多个单一纯菌株，用无菌棉签分别挑取菌落并用无菌生理盐水进行3次洗涤，得到多个含有待测单一菌种的菌液，调节菌液浓度使其在600nm下吸光度(0D600)为0.1-1.5 ；步骤3，根据所需处理的难降解污染物溶解度配制饱和的基质母液，并配制氯化铵和磷酸二氢钾组成的无机盐营养液，调节PH至所需范围，其中无机盐营养液中氯化铵浓度为1.0-3.0g/L，磷酸二氢钾浓度为1.0-2.0g/L ；步骤4，取某一种待测纯菌菌液，将IOmL菌液、IOmL基质母液和180mL无机盐营养液加入96孔微平板上的某个微孔中，将同样的组分加入相邻的另外2个微孔中，针对同种待测纯菌形成3个平行样；步骤5，重复步骤4的操作，取其他待测纯菌菌液，按顺序加入96孔微平板的相应微孔中。在同一块微平板上，同时设置3个不含菌液和3个不含基质母液的对照微孔；步骤6，在所有微孔中加入IOmL浓度为5g/L的噻唑蓝(MTT)显色剂，然后用酶标仪测定各个微孔的0D600作为显色前的初始值；步骤7，将微平板盖好，用封口膜密封后，放入培养箱进行培养，培养温度20-50°C，培养周期8-24h，每隔2-3h，取出平板用酶标仪测定各个微孔的0D600值；步骤8，在培养结束后，按照以下标准判断不同菌株对污染物的降解能力，从而筛选出具有较强污染物降解能力的高效菌:对照微孔内0D600的增加值小于0.05，表明检测结果有效，样品没有受到污染，在培养结束时，加入菌液和基质的微 孔0D600的增加值越大，表明相对应菌株对污染物的降解能力越强。所述微平板为96孔微平板，单个微孔总体积300mL。本发明与现有技术相比，在菌种培养和筛选方面具有以下优点:I)消耗药剂显著减少。传统的摇瓶培养方法培养每株纯菌需要配制几十至几百毫升培养液，而基于微平板培养的方法培养每株纯菌仅需约200微升(等于0.2毫升)培养液。相应需要消耗的基质(难降解污染物)、营养盐等相关药剂大大减少。另一方面，虽然微平板培养需要增加MTT显色剂的消耗，但由于不需要测定培养液中的基质浓度来判断降解程度，节省了大量样品预处理和测定需要的化学药剂。2)所需仪器装置少，占用空间小。使用微平板培养方法后，不需要大量的三角瓶和摇床等菌种培养设备，取而代之的是小巧的微平板和培养箱(微平板仅占有培养箱中很小的空间)。另外，测定MTT或XTT显色使用酶标仪，也比一般测定污染物浓度所需的气相色谱或液相色谱体积小，并且省去了取样和样品预处理的步骤以及相应仪器设备。3)培养和筛选时间缩短。采用微平板进行菌种培养，可以使用排枪大大提高加样的速度。此外，由于培养体系总体积减小，同样菌液加入后初始浓度更高，更利于菌种代谢的观测。4)人员投入和工作量降低。与摇瓶实验相比，微平板实验在药剂配制、加样、代谢过程监测等方面所需的工作量更小。显著减少了实验操作人员的工作量。尤其是当有大量样品和菌株需要进行检测和筛选时，使用微平板可以在不显著增加工作量的同时对几十甚至上百种菌株进行筛选。利用本发明方案后，从几十或上百株备选菌株中进行难降解污染物高效降解菌筛选，药剂消耗减少90%以上，无需复杂的样品预处理和检测设备，培养和筛选时间缩短50%以上，人员工作量显著降低，能够实现真正的“高通量”筛选。
具体实施例方式下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。实施例一采用本发明方法进行氯苯高效降解菌的筛选，氯苯属于难降解挥发性有机物，用摇瓶实验方法进行菌种筛选需要测定培养液中氯苯浓度，实验周期长且工作量大。按照上述微平板培养方法的筛选步骤如下:步骤1，取接触氯苯的污泥，用无菌生理盐水洗涤形成含有混合菌种的菌悬液；步骤2，取上述菌悬液，在平板培养基上通过多次划线分离得到多个单一纯菌株，用无菌棉签分别挑取菌落并用无菌生理盐水进行3次洗涤，得到多个含有待测单一菌种的菌液，调节菌液浓度使其在600nm下吸光度(0D600)为0.5 ;步骤3，配制饱和氯苯母液，配制氯化铵和磷酸二氢钾组成的无机盐营养液，调节PH为7.0，其中无机盐营养液中氯化铵浓度为1.0g/L，磷酸二氢钾浓度为1.0g/L ；步骤4，取某一种待测纯菌菌液，将IOmL菌液、IOmL氯苯基质母液和180mL无机盐营养液加入96孔微平板上的某个微孔中，将同样的组分加入相邻的另外2个微孔中，针对同种待测纯菌形成3个平行样；步骤5，重复步骤4的操作，取其他待测纯菌菌液，按顺序加入96孔微平板的相应微孔中。在同一块微平板上，同时设置3个不含菌液和3个不含氯苯母液的对照微孔；步骤6，在所有微孔中加入IOmL浓度为5g/L的噻唑蓝(MTT)显色剂，然后用酶标仪测定各个微孔的0D600作为显色前的初始值；步骤7，将微平板盖好，用封口膜密封后，放入培养箱进行培养，培养温度30°C，培养24h，根据微孔的0D600值变化判断氯苯降解情况。下面列出培养24h后，对照孔和含有不同待测菌株微孔内的0D600平均值:
权利要求
1.一种基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1，取含有相应污染物高效降解菌的土壤、污泥或生物膜样品，用无菌生理盐水洗涤形成含有混合菌种的菌悬液； 步骤2，取上述含有混合菌种的菌悬液，在平板培养基上通过多次划线分离得到多个单一纯菌株，用无菌棉签分别挑取菌落并用无菌生理盐水进行3次洗涤，得到多个含有待测单一菌种的菌液，调节菌液浓度使其在600nm下吸光度(0D600)为0.1-1.5 ； 步骤3，根据所需处理的难降解污染物溶解度配制饱和的基质母液，并配制氯化铵和磷酸二氢钾组成的无机盐营养液，调节PH至所需范围，其中无机盐营养液中氯化铵浓度为1.0-3.0g/L，磷酸二氢钾浓度为 1.0-2.0g/L ； 步骤4，取某一种待测纯菌菌液，将IOmL菌液、IOmL基质母液和180mL无机盐营养液加入微平板上的某个微孔中，将同样的组分加入相邻的另外2个微孔中，针对同种待测纯菌形成3个平行样； 步骤5，重复步骤4的操作，取其他待测纯菌菌液，按顺序加入96孔微平板的相应微孔中，在同一块微平板上，同时设置3个不含菌液和3个不含基质母液的对照微孔； 步骤6，在所有微孔中加入IOmL浓度为5g/L的噻唑蓝(MTT)显色剂，然后用酶标仪测定各个微孔的0D600作为显色前的初始值； 步骤7，将微平板盖好，用封口膜密封后，放入培养箱进行培养，培养温度20-50°C，培养周期8-24h，每隔2-3h，取出平板用酶标仪测定各个微孔的0D600值； 步骤8，在培养结束后，按照以下标准判断不同菌株对污染物的降解能力，从而筛选出具有较强污染物降 解能力的高效菌: 对照微孔内0D600的增加值小于0.05，表明检测结果有效，样品没有受到污染，在培养结束时，加入菌液和基质的微孔0D600的增加值越大，表明相对应菌株对污染物的降解能力越强。
2.根据权利要求1所述基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法，其特征在于，所述微平板为96孔微平板，单个微孔总体积300mL。
3.根据权利要求1所述基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法，其特征在于，所述污染物为氯苯。
4.根据权利要求1所述基于微平板培养的污染物高效降解菌筛选方法，其特征在于，所述污染物为甲苯。
全文摘要
本发明属于环境治理技术领域，具体涉及一种利用96孔微平板进行难降解污染物高效菌培养，从而实现菌种的高通量和快速筛选；该方法对从菌种混合体中分离出来的大量单一菌株，在微平板上同时进行培养，并通过染料(MTT或XTT)显色判断菌株代谢进程和对污染物的降解能力，从而筛选出具有较强污染物降解能力的菌株；与传统基于摇瓶培养的菌种筛选方法相比，该方法具有药剂(包括菌剂)消耗量少、培养周期短、仪器设备简单、占用实验空间小、实验工作量小等突出优点；应用该方法后，可实现大批量菌株的高通量快速检测，显著缩短菌种筛选的时间，大幅提高菌种筛选的效率。
文档编号C12N1/00GK103224885SQ20131012971
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月15日 优先权日2013年4月15日
发明者席劲瑛, 胡洪营, 王智超, 曹娟 申请人:清华大学