急性白血病病理演变前期Evi-1mRNA原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与急性白血病早期病理演变有密切相关Evi-1的方法，包括以下步骤：(1)在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和(2)检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可在RNA水平上检测Evi-1表达量，比现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的白血病前期RNA水平筛查，同时，本发明的检测方法简单方便，成本低，便于县区级医院推广应用。
【专利说明】急性白血病病理演变前期Evi-lmRNA原位杂交检测试剂盒 及检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及急性白血病病理演变RNA表达改 变（病理演变过程）的相关检测技术。
【背景技术】
[0002] 研究人员发现了导致急性白血病复发的一个基因，如果能找到抑制该基因发挥作 用的方法，就有可能防止急性白血病的复发。急性白血病患者中有70 %到80 %的人都会复 发。其原因是数量极少的白血病干细胞反复分裂，使白血病细胞大量增殖。抗癌药物虽然 能够杀灭白血病细胞，但难以杀灭其中的白血病干细胞，造成急性白血病屡治屡发。研究证 实急性白血病复发患者体内的基因"Evi-Ι"在造血干细胞中非常活跃，这一基因作用于白 血病干细胞，使其不断分裂，导致白血病细胞大量增殖。研究人员从患白血病的实验鼠体内 取出白血病细胞，去除了"Evi-Ι"基因后再移植到10只健康实验鼠体内。研究小组还给另 外10只健康实验鼠完整移植了白血病细胞（含"Evi-Γ'）。结果发现，前一组实验鼠比后 一组实验鼠平均晚发病一个月；而在杀灭两组实验鼠体内的白血病细胞后，前一组实验鼠 没有复发急性白血病，后一组却再次发病。研究人员认为，对照实验已经说明，"Evi-Γ'对 急性白血病的发作和复发有推动作用，而这与它作用于白血病干细胞有直接关系。本发明 人在实验研究中对急性白血病患者的外周血白细胞进行检测，发现Evi-Ι基因过度表达， 表明Evi-Ι基因是急性白血病干细胞的转移源头，检测Evi-Ι基因能预测急性白血病患者 复发的可能，检测Evi-Ι基因就可能预测急性白血病复发几率。
[0003] 随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为 了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能 在基因的一级转录功能产物（mRNA水平或microRNA)上做更精确的早期筛查和诊断，在急 性白血医治后的早期就可以预测复发的风险。
[0004] 本发明采用核酸原位杂交技术和免疫组化方法对Evi-Ι急性白血病复发的早期 预警进行检测分析。
[0005] 本发明人在研究中发现Evi-Ι作为急性白血病复发的预警有非常重要的临床诊 断意义。Evi-Ι在急性白血病复发前期有高表达。他作于急性白血病复发前期的筛查有非 常重要的临床意义。
[0006] 发明人在长期的研究中，得出了一种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床 诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病（发病后诊治），要做到预防性诊治，做到治 已病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，发 明人在开发和生产重大疾病的RNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了 创新。特别是筛选临床标本（正常人群、癌症高危人群、肿瘤患者），突破了正常组织与肿瘤 组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发癌前变的RNA水平，与癌症早期基因病理生理 学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上肿瘤形成后诊治模式变成肿瘤的 预防性诊治，其中包括急性白血病及急性白血病复发的早期预测，争取了肿瘤诊治的时间 和空间，达到预防占位性癌症和急性白血病。
[0007] 目前，Evi-Ι表达谱检测方法用Northern杂交、表达芯片、实时荧光定量PCR和 Solexa测序等分析技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，而检测RNA比基因 分析更科学（DNA分析大部分在易感性的表象上，RNA是功能性体现），比蛋白分析更可靠 (RNA与蛋白转录有时候不同步）。根据现有的文献资料采用原位杂交技术和组化免疫方法 检测Evi-lmRNA水平表达量的检测技术及试剂盒未见报道。
[0008] 本发明人在针对创新性发明的要求，用原位杂交技术进行检测，结果表明急性白 血病患者经治疗后Evi-Ι高表达，病患存在高度复发风险，应为患者的白血病干细胞在造 血系统中大量存在，表明Evi-Ι可用为急性白血病复发前期筛查的重要标志物。
[0009] 原位杂交技术（in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合 起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使 含有特异序列、经过标记的核酸单链（即探针），在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单 链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在 细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
[0010] 原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（虽不明 确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子），探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探 针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加 以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常 用的同位素标记物有 3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优 点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同 位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是 极其灵敏的。
[0011] 根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA杂交。 但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和 显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针（RNA)和检测的靶RNA是采用碱基互 补（杂交互补）的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处得残基对检测的结果没 有影响。
[0012] 综上所述，本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交 检测探针和标记物。其次，本发明还要提供上述试剂盒用于急性白血病复发前期筛查。
【发明内容】
[0013] 为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下： 本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的 杂交探针分别具有序列表SEQ ID NO. 1所示序列号：X54989,核苷酸序列长度是3570bp， ⑶S是268. . . 3423bp，位于染色体5q32 "上，本发明的探针是⑶S中的一段序列，从 901. · · 1201bp，全长 360bp。
[0014] 本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显 色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。
[0015] 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。
[0016] 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。
[0017] 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。
[0018] 本发明的癌变前期Evi-Ι筛查试剂盒应用价值在于，急性白血病前期复发的筛 查。
[0019] 本发明还提供一种Evi-Ι原位杂交的检测方法，包括以下步骤： (1) 在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测 RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和 (2) 检测所述杂交复合体。
[0020] 本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为： 核酸杂交的温度为42°C ;核酸杂交的时间为16-24小时。
[0021] 本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本。
[0022] 本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以Evi-Ι为检 测对象，合成探针是Evi-Ι序列，检测的底物是人体血液标本白细胞RNA的表达量。原位杂 交技术的显示方法能提供Evi-Ι的半定量或定量表达程度判定。
[0023] 本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂 交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括： 1) .将待测标本放入反应槽中； 2) .仪器自动弃去液体，自动加消化液； 3) .仪器自动弃去液体，自动后固定； 4) .仪器自动弃去液体，自动预杂交（42°C ); 5) .仪器自动弃去液体，自动清洗； 6) .仪器自动弃去液体，自动杂交（42°C ); 7) .仪器自动弃去液体，自动清洗； 8) ·仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养（室温）； 9) .仪器自动弃去液体，自动清洗，显色； 10) .取出封片镜检。
[0024] 本发明的一个优选实施例的方案是：以Evi-Ι合成的核酸探针用地高辛标记（地 高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素 标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点），将该杂交探针与人体血 液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察RNA的存在和 定位，根据染色的细胞数，判断目的RNA的表达量。本发明方法是目前常用的核酸原位杂交 技术，该方法通过检测底物细胞中的Evi-Ι表达量，用来确定急性白血病病理演变前期的 RNA变化量，预警急性白血病患者治疗后是否复发。
[0025] -个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。
[0026] 本发明具有如下有益效果： 本发明的临床意义是更早期跟踪检测急性白血病患者治疗后复发的几率。。
[0027] 此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测 方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。 附图的简单说明
[0028] 图1是本发明Evi-Ι原位杂交实施例图（核酸原位杂交技术流程图）。
[0029] 图2是本发明实施例中急性白血病患者Evi-Ι表达图片。
[0030] 图3是本发明实施例中正常人Evi-Ι表达图片。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明 而非限定本
【发明内容】
，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。
[0032] 实施例1 按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以Evi-Ι设计的杂交探 针、标记物、说明书，其中： 本实施例的探针标记物选用地高辛。 试剂盒杂交液组成： 消化液 100 μ L/管 1管/盒 无色透明液体 保护液 100μ?7管 1管/盒 无色透明液体 预杂交液 1300 μ?7管2管/盒 无色透明液体 正义杂交液 1〇μ?7管 1管/盒 无色透明液体 反义杂交液 1〇μ?7管 1管/盒 无色透明液体 封闭液 1000 μ!7管1管/盒 无色透明液体 碱性磷酸酶抗 体 1μ?7管 1管/盒 无色透明液体 显色剂Α 175μ?7管 1管/盒 黄色液体 显色剂Β 320 μ L/管 1管/盒 无色透明液体 浅黄色或无色透明液 缓冲液I 90mL/瓶 1瓶/盒 体 浅黄色或无色透明液 缓冲液II 80mL/瓶 1瓶/盒 体 浅黄色或无色透明液 缓冲液III 20mL/瓶 3瓶/盒 体 浅黄色或无色透明液 缓冲液IV 90mL/瓶 1瓶/盒 体 固定液 90mL/瓶 1瓶/盒 无色透明液体 阳性对照标本6片/盒 配制试剂使用浓度 1) .将10X缓冲液I用三蒸水按1 : 10稀释成IX缓冲液I ; 2) .将20X缓冲液II用三蒸水按1 : 10稀释成2X缓冲液II ; 按1 : 100稀释成0.2X缓冲液II;按1 : 200稀释成0.1 X缓冲液II; 3) .将10X缓冲液III用三蒸水按1 : 10稀释成IX缓冲液III ; 4) . 10 X缓冲液IV用三蒸水按1 : 10稀释成X缓冲液IV (取1#，2#，3#各10mL，力口 水至100mL既可）。
[0033] 实施例2 应用核酸原位杂交检测方法对急性白血病患者血液标本和正常人Evi-Ι表达量的实 施过程： 1) .取待测标本两张； 2) .在玻璃缸里加入消化液（消化液100yL加 IX缓冲液199.9ml，即为使用浓 度）50ml，37°C水浴预热10min，放进16张玻片，37°C处理12min，再用1 X缓冲液I洗5min ; 3) .用0.2%的保护液（保护液lml加 IX缓冲液I，99ml即为使用浓度）洗lOmin，三 蒸水洗5min (以上过程都在玻璃缸进行），取出玻片，让其自然干燥； 4) .将玻片放入保湿盒内，加预杂交液25 μ L/片（加在有细胞的地方），盖上盖玻片， 盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中3h以上； 5) .取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70^^90^^95 %的乙醇各洗 2min，取出，自然干燥； 6) .将玻片放入保湿盒内，一张加正义杂交液25 μ L/片，另一张加反义杂交液25 μ L/ 片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中16-24h ; 7) .取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内： 在42°C恒温水浴箱中用2X缓冲液II洗两次，每次15min ; 在42°C恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，每次15min ; 在42°C恒温水浴箱中用0. 1 X缓冲液II洗两次，每次15min ; 8) .用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥； 9) .将玻片放入保湿盒内，加0. 5%封闭液（1ml封闭液加5mllX缓冲液III) 100 μ L/ 片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min。（此步骤不需加盖玻片）； 10) .取出玻片，用IX缓冲液ΠΙ洗30s，自然干燥； 11) .将玻片放入保湿盒内，加 X-AP抗体（取一管碱性磷酸酶抗体，向其中加入 1.811111\缓冲液111)10(^17片，盖紧保湿盒在室温下作用3〇1^11，时间不能过长，否则会 产生假阳性（此步骤不需加盖玻片）； 12) .取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，每次15min; 13) .用1 X缓冲液IV洗2min，加显色剂（显色剂A73. 3 μ L，显色剂B157. 5 μ L加到 30mLl X缓冲液IV中，混匀），室温避光16h到18h以上； 14) .用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的IX缓冲液I混匀）封片镜检。
[0034] 本发明的核酸原位杂交检测方法将目的基因用地高辛标记，成为RNA核酸探针， 将探针与人体白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，因此在光镜下 观察RNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的RNA的表达量。
【权利要求】
1. 一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针分 别具有序列表SEQ ID NO :X54989所示的序列CDS中一段序列，从901. . . 1261bp。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射性物质、化学发光 或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。
4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。
5. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。
6. -种Evi-Ι基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 在权利要求1所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物 中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和 (2) 检测所述杂交复合体。
7. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的可形成稳定杂交复合体的条件 为：核酸杂交的温度为42C ;核酸杂交的时间为16-24小时。
8. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的底物选用人的血液白细胞标本。
9. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的血液标本（白血病患者、正常人 标本）。
10. 如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述包括临床上的急性白血病患者病 理演变过程，以及白血病经治疗后的复发病理演变过程。
【文档编号】C12Q1/68GK104141001SQ201310167925
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年5月9日 优先权日:2013年5月9日
【发明者】张云福, 裘建英, 裘霖, 张玉丽 申请人:嘉兴瑞康生物科技有限公司