人心脑血管病理演变前期KLF4基因mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与早期心脑血管内皮损伤病理演变有密切相关调节血管内皮细胞的遗传因子(KLF4)基因的mRNA的方法，包括以下步骤：(1)在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和(2)检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可在RNA水平上检测基因表达量，比现有的临床生化检测指标(蛋白检测指标)更早期，能实现真正的心脑血管病变前期RNA水平筛查，同时，本发明的检测方法简单方便，成本低，便于县区级医院推广应用。
【专利说明】人心脑血管病理演变前期KLF4基因 mRNA水平原位杂交检 测试剂盒及检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与人心脑血管病理演变中mRNA表 达改变（病理演变过程）的相关检测技术。
【背景技术】
[0002] 根据国内外权威机构提供的资料，我国每年心血管病的新增人数300多万，死亡 人数近250万，患者900多万，全球每年新增心血管病患者1200多万，死亡人数接近1000 多万，患者约有1亿多万，根据世界权威机构预测，到2030年以上人数将翻一番，这是一组 可怕的数字。心血管病诊治成本越来越高，按患者的年治疗费用10万（贫穷地区可能偏 高，发达地区可能远远高出20万），900多万患者，每年的花费是1. 8万亿人民币，扣除成本 35%约6多千亿，每年约有1. 2万亿人民币白白消耗了。而且，患者死亡率非常高，在所有 疾病中，心脑血管病的死亡率仍然是第一位。因此，现有的临床心脑血管病诊治模式一定要 改变，本发明的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做 到基因水平心脑血管病的治未病。
[0003] 本发明人在长期研究中发现，导致心脑血管病死亡率不降的重要原因是不能做到 真正的早期诊治。依照现有的实验室生化（心脑血管损伤相关的酶类得检测）指标来诊断， 大部分都停留在心脑血管病形成后检测及病发后的疗效观察。
[0004] 随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，疾病基因组学等研究的深入展开，为 了寻求更早期的筛查心脑血管病、治疗心脑血管病、以及预防心脑血管病，已取得长足进 步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物（mRNA水平或microRNA)上做更精确的 早期筛查和诊断，在心脑血管病变前期或心脑血管内皮细胞损伤前，就可以做到早期预测 和筛查。本发明采用核酸原位杂交技术，选择多组临床标本，心脑血管病人、高危人群（三 高人群）、正常对照，对KLF4基因 mRNA与各种心脑血管病变的早期预警进行检测分析。 [0005] 发明人在长期的研究中，得出了一种新理念，心脑血管病和其它临床的重大疾病 的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病（发病后诊治），要做到预防性诊治， 做到治未病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因 此，发明人在开发和生产重大疾病的RNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上 都做了创新。特别是筛选临床标本（正常人群、高危人群、心脑血管病患者），突破了正常 组织与病变组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发心脑血管病变前期的RNA水平，与 心脑血管病早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上心 脑血管病发后诊治模式变成的早期预防性诊治，争取了心脑血管病诊治的时间和空间，达 到预防心脑血管病发生。本发明人在研究中KLF4基因是一个防止血管形成阻塞的重要遗 传因子。如果负责调节血管内皮细胞的遗传因子KLF4的短缺，将更易形成有害牙菌斑和脂 肪沉积，KLF4不足使血管更易形成斑块。斑块积累（即动脉粥样硬化）使血管变窄，为血 栓形成导致心脏病和中风发作打下基础。相反，足够水平的KLF4将保护血管内衬免遭可触 发形成斑块和凝块的毒素和其他有害物质的侵害。研究回答了关于血管健康的一个基本问 题，即发现了 KLF4是内皮细胞最主要功能的主调控器。这些遗传因子的水平因人体疾病而 改变，因此以此为祀标或是可行的治疗策略。
[0006] 目前对KLF4基因的研究都采用高通量基因芯片分析技术，而这些方法多用于科 研方面，不适应临床应用，而检测RNA比基因分析更科学（DNA分析大部分在易感性的表象 上，mRNA是功能性体现），比蛋白分析更可靠（本发明人在研究才双标记技术发现mRNA与 蛋白转录有时候不同步，有mRNA转录，但有时没有蛋白表达）。根据现有的文献资料KLF4 基因 mRNA水平的检测技术及试剂盒未见报道。
[0007] 原位杂交技术（in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含 有特异序列、经过标记的核酸单链（即探针），在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细 胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
[0008] 原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（虽不明 确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子），探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探 针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加 以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常 用的同位素标记物有 3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优 点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同 位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是 极其灵敏的。
[0009] 根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA杂交。 但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和 显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针（RNA)和检测的靶RNA是采用碱基互 补（杂交互补）的原理，同时经过长时间研究和观察原位杂交过程中，启动和中止处得残基 对检测的结果没有影响。
[0010] 鉴于目前临床上心脑血管病的诊断（生化指标物都是大部分心脑血管病发生后 的诊断）是晚期诊断，治疗也是晚期治疗，导致死亡率不降的医治模式。本发明的初衷是想 改变目前临床上重大疾病的诊治模式，从治已病变成预防性治未病，达到预防性诊治。采用 核酸原位杂交技术和免疫组化方法相结合检测心脑血管内皮细胞损伤病前期变mRNA表达 变化，做了创新性的技术突破，提供心脑血管损伤病变早期mRNA水平筛查技术。使临床上 有了一项新的心脑血管损伤病变前期mRNA水平真正早期筛查的技术，为临床心脑血管内 皮细胞损伤的诊治争取时间和空间。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交检测探针和 标记物。
[0012] 其次，本发明还要提供上述试剂盒用于与各种心脑血管内皮损伤病变前期筛查及 患者治疗后早期预警相关的原位杂交检测方法。
[0013] 为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：本发明首先提供一种原位杂交检 测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针为序列表SEQ ID NO. 1所示序 列的互补序列，序列号：NM_〇〇4235. 4,序列长度是2949bp，CDS :595…2034bp，位于染色体 9q31"上。（本发明的探针序列是KLF4基因⑶S中的一段从901...1261bp).在探针标记 技术上问题，重复说明一下，探针的序列是KLF4基因 mRNA的杂交互补碱基序列，探针标记 的过程就是一个杂交的互补过程）
[0014] 本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显 色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。
[0015] 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。
[0016] 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。
[0017] 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。
[0018] 本发明的癌变前期KLF4筛查试剂盒应用价值在于，对各种心脑血管内皮损伤病 变前期筛查，尤其是心梗的前期筛查，及心脑血管损伤病发后或治疗后病程评判和预警，进 一步配合临床治疗。
[0019] 本发明还提供一种KLF4原位杂交的检测方法，包括以下步骤： (1) 在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测 RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和 (2) 检测所述杂交复合体。
[0020] 本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为： 核酸杂交的温度为42°C ;核酸杂交的时间为16-24小时。
[0021] 本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液标本。更优选地 是，所述的血液标本来自各种心脑血管内皮细胞损伤前期患者、各种心血管病高危人群、健 康正常人群。
[0022] 本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的心脑血管内皮细胞损伤高危人群、 心血管病好发家族、各种心脑血管病患者（特别是心梗早期病人）。
[0023] 本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以KLF4为检 测对象，合成探针是KLF4序列的互补序列，检测的底物是人体血液中KLF4基因 mRNA的表 达量。原位杂交技术的显示方法能提供KLF4的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后 免疫组化显色判定以上mRNA的表达量，正常人KLF4高表达，即细胞大量显色；KLF4在心脑 血管内皮细胞损伤病人中低表达6-16%;高危人群有一定量表达18-28%，和正常对照人群 比较有显着差异，该基因的表达量比正常人表达量都低。
[0024] 本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂 交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括： 1) .将待测标本放入反应槽中； 2) .仪器自动弃去液体，自动加消化液； 3) .仪器自动弃去液体，自动后固定； 4) .仪器自动弃去液体，自动预杂交（42°C ); 5) .仪器自动弃去液体，自动清洗； 6) .仪器自动弃去液体，自动杂交（42°C ); 7) .仪器自动弃去液体，自动清洗； 8) ·仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养（室温）； 9) .仪器自动弃去液体，自动清洗，显色； 10) .取出封片镜检。
[0025] 本发明的一个优选实施例的方案是：以KLF4合成的核酸探针用地高辛标记（地 高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素 标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点），将该杂交探针与人体血 液中的待测mRNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定 位，根据染色的细胞数，判断目的mRNA的表达量。
[0026] 本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的KLF4 表达量，用来确定各种心脑血管内皮细胞病理演变前期（特别是心梗早期）的mRNA变化 量，预警各种心脑血管病变（心肌梗塞）是否发生及各种心脑血管病患者治疗后的预后预 测。因为KLF4在正常人中高表达，如果KLF4表达量降低，说明心脑血管内皮细胞损伤病理 过程已开始，说明心脑血管损伤已发生，或心脑血管损伤病人经治疗后心脑血管病理机制 的变化及疗效评判，从而获得心脑血管内皮细胞损伤的早期诊断信息。
[0027] -个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。
[0028] 本发明具有如下有益效果：本发明的临床意义是更早期跟踪检测各种心脑血管病 变（特别心梗、中风）发生和病理演变过程中KLF4表达量的变化，预警各种心脑血管病发 生、发展趋势。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测与心血管病标志物检查有显着不同。 本发明可以在mRNA水平检测KLF4异常表达，心血管病生化指标（现有临床指标）未产生 异常之前，亦未发生心梗之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床心脑血管 内皮细胞损伤患者一个真正的早期预警。这样才有可能实施心脑血管病损伤的早期筛查、 早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治各种心血管病的致死性。
[0029] 此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测 方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1是本发明KLF4原位杂交技术流程图（核酸原位杂交技术流程图）
[0031] 图2是本发明实施例中心肌损伤病人KLF4低表达图片。
[0032] 图3是本发明实施例中高危人群KLF4表达图片。
[0033] 图4是本发明实施例中正常人KLF4高表达图片。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明 而非限定本
【发明内容】
，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。
[0035] 实施例1 按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以KLF4设计的杂交探 针、标记物、说明书，其中：本实施例的探针标记物选用地高辛。
[0036] 试剂盒杂交液组成： 消化液 100 μ L/管 1管/盒 无色透明液体 保护液 100 μ L/管 1管/盒 无色透明液体 预杂交液 1300 μ L/管 2管/盒 无色透明液体 正义杂交液10 U L/管 1管/盒 无色透明液体 反义杂交液?ο μ L/管 1管/盒 无色透明液体 封闭液 1000 μ L/管 1管/盒 无色透明液体 碱性磷酸酶 抗体 luL/管 1管/盒 无色透明液体 显色剂A 175PL/管 1管/盒 黄色液体 显色剂B 320 μι/管 1管/盒 无色透明液体 浅黄色或无色透 缓冲液I 90mL/瓶 1瓶/盒 明液体 浅黄色或无色透 缓冲液II 80mL/瓶 1瓶/盒 明液体 浅黄色或无色透 缓冲液III 20mL/瓶 3瓶/盒 明液体 浅黄色或无色透 缓冲液IV 90mL/瓶 1瓶/盒 明液体 固定液 90mL/瓶 1瓶/盒 无色透明液体 阳性对照标 本 6片/盒 配制试剂使用浓度 1) .将10X缓冲液I用三蒸水按1 : 10稀释成IX缓冲液I ; 2) .将20X缓冲液II用三蒸水按1 : 10稀释成2X缓冲液II ; 按1 : 100稀释成0.2X缓冲液II;按1 : 200稀释成0.1 X缓冲液II; 3) .将10X缓冲液III用三蒸水按1 : 10稀释成IX缓冲液III ; 4) . 10 X缓冲液IV用三蒸水按1 : 10稀释成X缓冲液IV (取1#，2#，3#各10mL，力口 水至100mL既可）。
[0037] 实施例2 应用核酸原位杂交检测方法对各组血液标本KLF4表达量的实施过程： 1) .取待测标本两张； 2) .在玻璃缸里加入消化液（消化液100yL加 IX缓冲液199.9ml，即为使用浓 度）50ml，37°C水浴预热10min，放进16张玻片，37°C处理12min，再用1 X缓冲液I洗5min ; 3) .用0.2%的保护液（保护液lml加 IX缓冲液I，99ml即为使用浓度）洗lOmin，三 蒸水洗5min (以上过程都在玻璃缸进行），取出玻片，让其自然干燥； 4) .将玻片放入保湿盒内，加预杂交液25 μ L/片（加在有细胞的地方），盖上盖玻片， 盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中3h以上； 5) .取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70^^90^^95 %的乙醇各洗 2min，取出，自然干燥； 6) .将玻片放入保湿盒内，一张加正义杂交液25 μ L/片，另一张加反义杂交液25 μ L/ 片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中16-24h ; 7) .取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内： 在42°C恒温水浴箱中用2X缓冲液II洗两次，每次15min ; 在42°C恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，每次15min ; 在42°C恒温水浴箱中用0. 1 X缓冲液II洗两次，每次15min ; 8) .用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥； 9) .将玻片放入保湿盒内，加0. 5%封闭液（1ml封闭液加5mllX缓冲液III) 100 μ L/ 片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min。（此步骤不需加盖玻片）； 10) .取出玻片，用IX缓冲液ΠΙ洗30s，自然干燥； 11) .将玻片放入保湿盒内，加 X-AP抗体（取一管碱性磷酸酶抗体，向其中加入 1.811111\缓冲液111)10(^17片，盖紧保湿盒在室温下作用3〇1^11，时间不能过长，否则会 产生假阳性（此步骤不需加盖玻片）； 12) .取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，每次15min; 13) .用1 X缓冲液IV洗2min，加显色剂（显色剂A73. 3 μ L，显色剂B157. 5 μ L加到 30mLl X缓冲液IV中，混匀），室温避光16h到18h以上； 14) .用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的IX缓冲液I混匀）封片镜检。
[0038] 本发明的核酸原位杂交检测方法将目的基因用地高辛标记，成为RNA核酸探针， 将探针与人体白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，因此在光镜下 观察RNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的RNA的表达量。
[0039] 心脑血管病人20例，高危人群（三高人群）20例，正常对照组20名。抽所有待检 人的外周血3-5毫升（分离白细胞）做原位杂交。结果表示，所有心血管病患者KLF4表达 量低，细胞染色浅；高危人群表达稍降低，小数染色；正常对照组KLF4表达量高，细胞大多 数染色，具体结果见图2、图3、图4。
【权利要求】
1. 一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针分 为序列表SEQ ID NO. 1所示序列中CDS中的一段的互补序列，从901. ... 1261bp。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射性物质、化学发光 或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。
4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。
5. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。
6. -种KLF4基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 在权利要求1所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物 中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和 (2) 检测所述杂交复合体。
7. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的可形成稳定杂交复合体的条件 为：核酸杂交的温度为42°C ;核酸杂交的时间为16-24小时。
8. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的底物选用人血液中的mRNA标本。
9. 如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述的血液mRNA成分选自心脑血管疾 病、高危人群（高血压、高血脂、高血糖及心梗前期）、正常人标本。
10. 如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述标本包括临床上的各种心血管的 高危人群前期病理演变过程中，以及各种心脑血管病经治疗后病理演变过程中疗效评判。
【文档编号】C12Q1/68GK104141000SQ201310167923
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年5月9日 优先权日:2013年5月9日
【发明者】裘建英, 张云福, 张玉丽, 裘霖 申请人:嘉兴瑞康生物科技有限公司