一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法
【专利摘要】一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，包括如下步骤：利用分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌发酵制备胞苷磷酸转移酶，并提纯制备胞苷磷酸转移酶液；胞苷磷酸转移酶的固定化；以磷酸胆碱及三磷酸胞苷二钠为原料，由固定化胞苷磷酸转移酶催化生成胞磷胆碱。本发明生产工艺简单，生产周期短，生产成本低，能广泛应用于胞磷胆碱的产业化生产。
【专利说明】一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及制药领域，具体是指一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法。
【背景技术】:
[0002]胞磷胆碱钠又称胞二磷胆碱钠，化学名胆碱胞嘧啶核苷二磷酸酯的单钠盐，一种脑代谢激活剂，为核苷衍生物，是磷酯酰胆碱的前体物质，是卵磷脂合成所必需的辅酶，于1954年发现，1956年合成，1973年国内试制成功。
[0003]胞磷胆碱钠的药理作用主要有:可恢复脑细胞损伤后细胞膜的结构，增强细胞膜的功能，改善神经元的功能；降低脑血管阻力，增加脑血流量，促进脑代谢，改善脑循环，提高脑功能；增加包括乙酰胆碱和多巴胺在内的神经传导介质的分泌，增强与意识有关的脑干网状结构功能，改善头部外伤后或脑手术后意识障碍的意识状态及脑电图，促进脑卒中偏瘫病人的上肢运动功能的恢复，对促进大脑功能恢复、促进苏醒有一定作用；促进卵磷脂生物合成和抗磷脂酶A作用，从而加速脑水肿的重吸收。增进多巴胺能活动，调控锥体外系的生理功能。与蛋白分解酶抑制剂合用，可保护及修复胰腺组织。
[0004]临床上胞磷胆碱钠主要用于急性颅脑外伤和脑手术后意识障碍，治疗帕金森氏综合症(Parkinson’s disease);神经性耳聋；对老年性痴呆症(Alzheimer’s disease )、抑郁症、延缓衰老，提高学习效果和记忆力等有一定的疗效。
[0005]胞磷胆碱钠的生产方法包括化学合成法，微生物发酵法及酶促合成法三种方法。化学合成法，以胞苷酸(CMP)、磷酸胆碱(CP)为底物，用对甲苯磺酰氯为缩合剂，在N-二甲基甲酰胺(DMF)存在下缩合成胞磷胆碱钠，化学合成存在反应转化率低，副产物多，生产成本高，环境污染严 重等问题；微生物发酵法是用酵母菌或产氨短杆菌等微生物利用葡萄糖，并添加CMP、CP等前提物发酵生成胞磷胆碱钠，微生物发酵法存在产物浓度低，产率不稳定等问题；酶促合成法曾有以豚鼠肝细胞匀浆提抽胞苷磷酸转移酶，并催化CTP与磷酸胆碱生成胞磷胆碱钠的初步报道，但因酶的来源问题，酶促合成法无法实现。
【发明内容】
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[0006]本发明的目的是提供一种旨在解决化学合成法，微生物发酵法及酶促合成法生产胞磷胆碱钠的种种缺陷，生产工艺简单，生产周期短，生产成本低，能广泛应用于胞磷胆碱钠的产业化生产的酶催化合成胞磷胆碱钠的方法。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0008]一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，包括如下步骤:
[0009](I)、工程菌发酵:
[0010]把分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液接种到培养基体系中培养26~32小时，所述分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液的加入体积为培养基体系体积的5%~10% ;期间补充适量的葡萄糖、蛋白胨以及酵母提取物，发酵完成后发酵液离心收集菌体。[0011](2)、制备胞苷磷酸转移酶清液:
[0012]取上述菌体悬浮在磷酸缓冲液中用超声波或匀浆仪破碎，获得破碎液，在上述破碎液中加入硫酸铵进行盐析，获得饱和度为25%~45%盐析液，再用孔径为100~500nm的陶瓷膜过滤器将上述盐析液固液分离，得胞苷磷酸转移酶清液，其中，所述菌体与所述磷酸缓冲液的悬浮比例为1:4~1:10。
[0013](3)、胞苷磷酸转移酶清液的固定化:
[0014]上述胞苷磷酸转移酶清液中加入固定化载体，搅拌固化，获得固定化胞苷磷酸转移酶，所述固定化载体的加入量与胞苷磷酸转移酶清液的比例为100~200克/L。
[0015]( 4 )、胞磷胆碱钠的合成:
[0016]将含三磷酸胞苷二钠30~80mmol/L、磷酸胆碱60~400mmol/L以及乙酸镁10~50mmol/L的水溶液混合配制成合成反应液,调节合成反应液的pH值至6.0~9.0,加入固定化胞苷磷酸转移酶，并在10~50°C的水浴温度下搅拌反应4~10小时，过滤后得到的清液即为胞磷胆碱钠液，所述固定化胞苷磷酸转移酶的加入量与合成反应液的比例为10~50g/L。
[0017](5)、提取纯化
[0018]将上述胞磷胆碱钠液经层析分离结晶干燥，得到胞磷胆碱钠的干品。
[0019]其中，所述分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏中心地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所保藏编号为CGMCC NO:4428。
[0020]进一步地，所述培养基体系中含有蛋白胨10~20g/L，酵母提取物10~20g/L，葡萄糖5~8g/L，无机盐8~15g/L，余量为纯化水，工程菌发酵发酵过程中，期间补充的葡萄糖的量为培养基体系中含有的葡萄糖的量的10-15倍，补充的蛋白胨的量为为培养基体系中含有的蛋白胨的量的50-80%，补充的酵母提取物的量为为培养基体系中含有的酵母提取物的量的50-80%。
[0021]进一步地，所述固定化载体选自纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、多聚氨基酸、聚苯乙烯、尼龙或多孔玻璃载体的任一种。
[0022]进一步地，所述固定化载体中含有芳香氨基或羟基或羧基或羧甲基或环氧基或氨基功能基团中的至少一个基团。
[0023]优选地，胞磷胆碱钠的合成的步骤中，固定化胞苷磷酸转移酶10~50g/L，三磷酸胞苷二钠为30~80mmol/L ;磷酸胆碱60~400mmol/L ;乙酸镁10~50mmol/L ;反应温度25 ~40°C ；pH 值为 6.0 ~9.0。
[0024]优选地，胞磷胆碱钠的合成的步骤中，固定化胞苷磷酸转移酶含量为20~30g/L，三磷酸胞苷二钠为40~60mmol/L ;磷酸胆碱120~240mmol/L ；乙酸镁20~30mmol/L ;反应温度30~40°C ；pH值为6.5~8.0。
[0025]本发明的主要技术优越特性如下:
[0026]1.采用分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌高密度发酵制备胞苷磷酸转移酶，酶源稳定，避免目前国内普遍采用的啤酒酵母反应体系所带来的车间环境污染及大量废酵母渣需处理等缺点。
[0027]2.采用固定化胞苷磷酸转移酶催化合成反应，可反复多次使用，反应条件温和容易控制，减少合成工序时间，转化率达到90%以上，有效降低生产成本。
[0028]3.与传统工艺相比，本发明工艺对环境友好，在节能减耗、保护环境方面有明显优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]附图1为固定化酶催化生产胞碱胆碱钠流程图；
[0030]附图2为胞磷胆碱钠标准品的IR图谱；
[0031]附图3为制得的胞磷胆碱钠的IR图谱；
[0032]附图4为胞磷胆碱钠标准品的1HNMR图谱；
[0033]附图5为制得的胞磷胆碱钠的1HNMR图谱；
[0034]附图6为胞磷胆碱钠标准品的13CNMR图谱；
[0035]附图7为制得的胞磷胆碱钠的13CNMR图谱；
[0036]附图8为胞磷胆碱钠标准品的质谱；
[0037]附图9为制得的胞磷胆碱钠的质谱。
【具体实施方式】
[0038]以下通过本发明的实施例对本发明进行详细说明: [0039]参照附图1，一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，包括如下步骤:利用分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌发酵制备胞苷磷酸转移酶，并提纯制备胞苷磷酸转移酶液；胞苷磷酸转移酶的固定化；以磷酸胆碱及三磷酸胞苷二钠为原料，由固定化胞苷磷酸转移酶催化生成胞磷胆碱，其中本发明中用的分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所保藏编号为CGMCC NO:4428,以下实施例中均采用该分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌。
[0040]实施例一
[0041]一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，包括如下步骤:
[0042](I)、工程菌发酵:
[0043]把150ml分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液接种到3L培养基体系中培养26小时，该培养基体系中含有蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖5g/L,无机盐8g/L,纯化水溶解期间补充150g葡萄糖、15g蛋白胨和15g酵母提取物；发酵完成后发酵液离心收集菌体152g。
[0044](2)、制备胞苷磷酸转移酶清液:
[0045]取菌体30g，用180ml磷酸缓冲液混溶悬浮并用超声波破碎30分钟获得破碎液，在破碎液中加入硫酸铵至30%饱和度进行盐析，然后用200nm微膜过滤除去固体物质，获得胞苷磷酸转移酶清液205ml。
[0046](3)、胞苷磷酸转移酶清液的固定化:
[0047]取上述胞苷磷酸转移酶清液205ml，加入41g含环氧基的聚丙烯酰胺凝胶固定化载体，搅拌进行固定化，获得59g固定化胞苷磷酸转移酶，折合每克固定化载体固定胞苷磷酸转移酶蛋白llmg。
[0048]( 4 )、胞磷胆碱钠的合成:
[0049]配制IL合成反应液，合成反应液中三磷酸胞苷二钠为80mmol/L ;磷酸胆碱400mmol/L ;乙酸镁50mmol/L，余量为水，调节反应液的pH值为7.5，加入固定化胞苷磷酸转移酶50g，水浴40°C搅拌反应10小时，过滤后获得胞磷胆碱钠液960ml，此三磷酸胞苷二钠的转化率达到88%。
[0050](5)、提取纯化:
[0051]上述将上述胞磷胆碱钠液经层析分离结晶干燥，得到胞磷胆碱钠的干品27g，产品含量99.8%。
[0052]实施例二
[0053]一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，包括如下步骤:
[0054](I)、工程菌发酵:
[0055]把200ml分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌种子液接种到3L培养基体系(培养基体系中含蛋白胨15g/L，酵母提取物15g/L，葡萄糖8g/L，无机盐13.5g/L，纯化水溶解)中培养28小时，期间补充288g葡萄糖、30g蛋白胨和30g酵母提取物。发酵完成后发酵液离心收集菌体165g。
[0056](2)、制备胞苷磷酸转移酶清液:
[0057]取菌体20g，用200ml磷酸缓冲液混溶悬浮后用超声波破碎30分钟，获得破碎液，在破碎液中加入硫酸 铵至45%饱和度，然后用500nm微膜过滤除去固体物质，获得胞苷磷酸转移酶清液218ml。
[0058](3)、胞苷磷酸转移酶清液的固定化:
[0059]取胞苷磷酸转移酶清液200ml，加入20g含羟基的聚苯乙烯固定化载体，搅拌进行固定化，获得28g固定化胞苷磷酸转移酶，折合每克固定化载体固定胞苷磷酸转移酶蛋白17mg。
[0060]( 4 )、胞磷胆碱钠的合成:
[0061]配制IL合成反应液(合成反应液中含三磷酸胞苷二钠为30mmol/L，磷酸胆碱60mmol/L,乙酸镁10mmol/L,余量为水),调节反应液的pH值至9.0,加入固定化胞苷磷酸转移酶10g，水浴25°C搅拌反应9小时，三磷酸胞苷二钠的转化率达到90%，过滤后获得的清液(胞磷胆碱钠液)973ml。
[0062](5)、提取纯化:
[0063]上述胞磷胆碱钠液经层析分离结晶干燥后，获得胞磷胆碱钠的干品llg，产品含量99.7%。
[0064]实施例三
[0065]胞磷胆碱钠的制备包括如下步骤:
[0066](I)、工程菌发酵:
[0067]把300ml分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌种子液接种到3L培养基体系(培养基体系中含有蛋白胨20g/L，酵母提取物20g/L，葡萄糖8g/L，无机盐15g/L，余量为纯化水溶解冲培养32小时，期间补充360g葡萄糖、48g蛋白胨和48g酵母提取物。发酵完成后发酵液离心收集菌体187g。[0068](2)、制备胞苷磷酸转移酶清液:
[0069]取菌体30g，用120ml磷酸缓冲液混溶悬浮，菌液用超声波破碎30分钟，获得破碎液，在破碎液中加入硫酸铵至25%的饱和度，然后用500nm微膜过滤除去固体物质，获得胞苷磷酸转移酶清液144ml。
[0070](3)、胞苷磷酸转移酶清液的固定化:
[0071]取胞苷磷酸转移酶清液144ml，加入28g含羟基的聚苯乙烯固定化载体，搅拌进行固定化，获得40g固定化胞苷磷酸转移酶，折合每克固定化载体固定胞苷磷酸转移酶蛋白20mgo
[0072]( 4 )、胞磷胆碱钠的合成:
[0073]配制IL合成反应液(合成反应液中含三磷酸胞苷二钠为50mmol/L;磷酸胆碱180mmol/L ;乙酸镁20mmol/L),调节合成反应液的pH至8.0,加入固定化胞苷磷酸转移酶30g，水浴30°C搅拌反应4小时，三磷酸胞苷二钠的转化率达到91%，过滤后获得胞磷胆碱钠液 966ml ο
[0074](5)、提取纯化:
[0075]上述胞磷胆碱钠液经层析分离结晶干燥后，获得胞磷胆碱钠的干品18.5g，产品含量 99.9%ο
[0076]实施例四
[0077]胞苷磷酸转移酶液的制备包括如下步骤: [0078](I)、工程菌发酵:
[0079]把2.5L分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌接种到30L培养基体系(含蛋白胨15g/L，酵母提取物15g/L，葡萄糖8 g/L，无机盐13.5g/L，余量为纯化水)中培养28小时，期间补充2880g葡萄糖、320g蛋白胨和320g酵母提取物。发酵完成后发酵液离心收集菌体1670g。
[0080](2)、制备胞苷磷酸转移酶清液:
[0081 ] 取菌体300g，用2400ml磷酸缓冲液混溶悬浮，菌液用均质机破碎3次，在破碎菌液中加入硫酸铵至35%饱和度，然后通用孔径500nm的陶瓷膜过滤器澄清酶液，获得胞苷磷酸转移酶清液2610ml。
[0082](3)、胞苷磷酸转移酶清液的固定化:
[0083]取胞苷磷酸转移酶清液2610ml，加入400g含氨基的琼脂糖固定化载体，搅拌进行固定化，获得580g固定化胞苷磷酸转移酶，折合每克固定化载体固定胞苷磷酸转移酶蛋白15mg。
[0084]( 4 )、胞磷胆碱钠的合成:
[0085]配制IOL合成反应液(合成反应液中含三磷酸胞苷二钠为60mmol/L ;磷酸胆碱200mmol/L ；乙酸镁25mmol/L，余量为水)，调节合成反应液的pH值至8.0,加入固定化胞苷磷酸转移酶300g，水浴30°C搅拌反应5小时，三磷酸胞苷二钠的转化率达到91%。过滤后获得胞磷胆碱钠液10.4L。
[0086](5)、提取纯化:
[0087]上述胞磷胆碱钠液经层析分离结晶干燥后，获得胞磷胆碱钠的干品203g，产品含量 99.7%。[0088]参照附图2-附图9，对比样品与制得的胞磷胆碱钠的干品红外吸收图谱、核磁共振图谱及质谱见可知均与标准品一致。
[0089]实施例五
[0090]一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，包括如下步骤:
[0091](I)、工程菌发酵:
[0092]把400ml分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌种子液接种到6L培养基体系(培养基体系中含蛋白胨15g/L，酵母提取物15g/L，葡萄糖8g/L，无机盐13.5g/L，纯化水溶解)中培养30小时，期间补充576g葡萄糖、60g蛋白胨和60g酵母提取物。发酵完成后发酵液离心收集菌体330g。
[0093](2)、制备胞苷磷酸转移酶清液:
[0094]取菌体40g，用400ml磷酸缓冲液混溶悬浮后用超声波破碎30分钟，获得破碎液，在破碎液中加入硫酸铵至40%饱和度，然后用IOOnm微膜过滤除去固体物质，获得胞苷磷酸转移酶清液436ml。
[0095](3)、胞苷磷酸转移酶清液的固定化:
[0096]取胞苷磷酸转移酶清液400ml,加入40g含羧基的纤维素固定化载体,搅拌进行固定化，获得56g固定化胞苷磷酸转移酶，折合每克固定化载体固定胞苷磷酸转移酶蛋白17mg。
[0097]( 4 )、胞磷胆碱钠的合成:
[0098]配制IL 合成反应液(合成反应液中含三磷酸胞苷二钠为70mmol/L，磷酸胆碱300mmol/L,乙酸镁40mmol/L,余量为水),调节反应液的pH值至6.0,加入固定化胞苷磷酸转移酶10g，水浴10°C搅拌反应8小时，三磷酸胞苷二钠的转化率达到90%。过滤后获得的清液(胞磷胆碱钠液)973ml。
[0099](5)、提取纯化:
[0100]上述胞磷胆碱钠液经层析分离结晶干燥后，获得胞磷胆碱钠的干品lig，产品含量99.8%。
[0101]以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
【权利要求】
1.一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，包括如下步骤: (1)、工程菌发酵: 把分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液接种到培养基体系中培养26~32小时，所述分子克隆胞苷磷酸转移酶基因的大肠杆菌工程菌的种子液的加入体积为培养基体系体积的5%~10% ;期间补充适量葡萄糖、蛋白胨和酵母提取物，发酵完成后发酵液离心收集菌体； (2)、制备胞苷磷酸转移酶清液: 取上述菌体悬浮在磷酸缓冲液中用超声波或匀浆仪破碎，获得破碎液，在上述破碎液中加入硫酸铵进行盐析，获得饱和度为25%~45%盐析液，再用孔径为100~500nm的陶瓷膜过滤器将上述盐析液固液分离，得胞苷磷酸转移酶清液，其中，所述菌体与所述磷酸缓冲液的悬浮比例为1:4~1:10 ; (3)、胞苷磷酸转移酶清液的固定化: 上述胞苷磷酸转移酶清液中加入固定化载体，搅拌固化，获得固定化胞苷磷酸转移酶，所述固定化载体的加入量与胞苷磷酸转移酶清液的比例为100~200克/L ； (4)、胞磷胆碱钠的合成: 将含三磷酸胞苷二钠30~80mmol/L、磷酸胆碱60~400mmol/L以及乙酸镁10~50mmol/L的水溶液混合配制成合成反应液,调节合成反应液的pH值至6.0~9.0,加入所述固定化胞苷磷酸转移酶，并在10~50°C的水浴温度下搅拌反应4~10小时，过滤后得到的清液即为胞磷胆碱钠液，所述固定化胞苷磷酸转移酶的加入量与合成反应液的比例为10 ~50g/L ；· (5)、提取纯化: 将上述胞磷胆碱钠液经层析分离结晶干燥，得到胞磷胆碱钠的干品。
2.根据权利要求1所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述培养基体系中含有蛋白胨10~20g/L,酵母提取物10~20g/L,葡萄糖5~8g/L,无机盐8~15g/L，余量为纯化水。
3.根据权利要求2所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，工程菌发酵发酵过程中，期间补充的葡萄糖的量为培养基体系中含有的葡萄糖的量的10-15倍，补充的蛋白胨的量为为培养基体系中含有的蛋白胨的量的50-80%，补充的酵母提取物的量为为培养基体系中含有的酵母提取物的量的50-80%。
4.根据权利要求3所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述固定化载体选自纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、多聚氨基酸、聚苯乙烯、尼龙或多孔玻璃载体的任一种。
5.根据权利要求4所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，所述固定化载体中含有芳香氨基或羟基或羧基或羧甲基或环氧基或氨基功能基团中的至少一个基团。
6.根据权利要求5所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，胞磷胆碱钠的合成的步骤中，固定化胞苷磷酸转移酶10~50g/L，三磷酸胞苷二钠为30~HOmmoI /I,;憐酸胆喊60~40OmmoI /I,;乙酸续10~SOmmoI /I,;反应温度25~40°C ;pH值为 6.0 ~9.0。
7.根据权利要求6所述的一种固定化酶催化生产胞磷胆碱钠的方法，其特征在于，胞磷胆碱钠的合成的步骤中，固定化胞苷磷酸转移酶含量为20~30g/L，三磷酸胞苷二钠为40~60mmol/L ;憐酸胆减120~240mmol/L ;乙酸镇20~30mmol/L ;反应温度30~40°C;pH值为6.5~8.0。`
【文档编号】C12R1/19GK103849666SQ201310167034
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2013年5月8日 优先权日:2013年5月8日
【发明者】刘桂祯, 黄炯威, 周华润, 莫世艺, 劳瑞雄 申请人:开平牵牛生化制药有限公司