日本血吸虫重组抗原SjPDI及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种日本血吸虫重组抗原，该重组抗原包含：日本血吸虫PDI蛋白的SEQ?IDNO.1所示氨基酸序列。本发明还公开了一种重组载体，包含日本血吸虫PDI基因，该基因序列为编码SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。本发明还公开了上述日本血吸虫重组抗原的制备方法及其在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用。本发明的日本血吸虫重组抗原，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组抗原的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体并能达到一个较高的水平，动物保护实验诱导了35.32％的减虫率和33.17％的减卵率，表明该重组抗原适于作为抗血吸虫病候选疫苗，具有很好的应用前景。
【专利说明】日本血吸虫重组抗原SjPDI及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程【技术领域】，尤其涉及一种日本血吸虫重组抗原及其制备方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 血吸虫病是由血吸虫引起的一种重要人畜共患病，在热带和亚热带地区约有2亿 人感染，在我国主要流行的是日本血吸虫病。截止到2011年，全国共有血吸虫病流行县 (市、区）454个，血吸虫病人28. 68万，全国实有钉螺面积372664. 10hm2,较2010年增加了 932. 08hm2。我国血吸虫病防治工作仍面临挑战，形势不容乐观，因此，加强抗血吸虫疫苗候 选分子和新药物靶标的筛选显得尤其重要。
[0003] 在宿主体内，寄生虫组织结构和行为方式会发生变化，虫体移行于宿主体液和组 织之间，由肠上皮和（或）表皮以及其他特异排泄分泌器官在整个生命周期释放或分泌的 排泄分泌产物能引起宿主免疫调节反应。这些成分直接暴露于宿主免疫系统，诱导宿主的 免疫应答，干扰宿主的免疫反应过程,使血吸虫可以逃脱宿主的免疫攻击，同时还是宿主体 内存在活虫体的重要指征。血吸虫排泄分泌蛋白的重要功能及研究意义有：①排泄分泌蛋 白含有一些重要的酶、信号传导蛋白、解毒分子，在血吸虫生长发育中发挥了重要的作用； ②血吸虫排泄分泌蛋白的不断变化对血吸虫逃避宿主免疫攻击，在宿主体内存活、发育、繁 殖中扮演着重要角色，在免疫逃避机制中起到了重要作用；③一些已呈现较好免疫保护效 果的血吸虫疫苗候选分子，已证明在血吸虫排泄分泌产物中呈现；④由于排泄分泌蛋白暴 露于宿主的免疫系统并引起宿主的免疫应答，一些排泄分泌蛋白已被证明是良好的血吸虫 病诊断抗原。因此，对排泄分泌蛋白总成分的鉴定有利于理解血吸虫如何调节寄主免疫应 答以建立慢性感染，以及与寄主相互作用机制。同时，这些信息有利于发现控制血吸虫病的 疫苗候选分子、新的诊断试剂及新药物靶点。
[0004] 蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide ?8〇η?θΓΒ8θ，Η)Ι)被鉴定为一种排泄分 泌蛋白，在二硫键形成过程中起关键作用。PDI属于硫氧还蛋白家族，基因含有两个独立的 活性位点，每个活性位点包含两个半胱氨酸（WCGHCK)，PDI催化底物二硫键的形成及重排 以形成有活性的天然结构。在肝片吸虫中，PDI保护虫体免受氧化压力的影响；在新孢子虫 和弓形虫中，pdi在寄生虫-宿主相互作用中扮演重要角色。有关roi的研究在日本血吸 虫中还未被报道，因此，深入研究Sjroi的生物学功能及在血吸虫生长发育中的作用具有 重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决目前缺乏抗血吸虫高效疫苗的技术问题，提供一种日本血吸虫重组 抗原，该重组抗原包含日本血吸虫蛋白质二硫键异构酶（SjPDI)的SEQ ID NO. 1所示氨基 酸序列，具有良好的免疫原性，适于作为抗血吸虫病候选疫苗。
[0006] 此外，还需要提供一种上述日本血吸虫重组抗原的制备方法和应用。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0008] 在本发明的一个方面，提供了一种重组载体，包含日本血吸虫PDI基因，该基因序 列为编码SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
[0009] 优选的，所述重组载体的空载体为原核表达载体pET28a(+)，所述日本血吸虫Η)Ι 基因插入在空载体pET28a(+)的EcoR I和Sal I两个酶切位点之间。
[0010] 更优选的，所述日本血吸虫PDI基因序列为SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列。
[0011] 在本发明的另一方面，还提供了一种日本血吸虫重组抗原，该重组抗原由上述重 组载体经诱导表达制得。
[0012] 本发明的日本血吸虫重组抗原，包含日本血吸虫的蛋白质二硫键异构酶氨基酸序 列，还包含由部分载体序列表达的具有几个组氨酸的标签序列，该标签序列仅是便于后续 的重组抗原蛋白纯化。
[0013] 在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。
[0014] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组抗原的制备方法，包括 以下步骤：
[0015] 构建含日本血吸虫PDI基因的重组表达载体，所述基因是编码SEQ ID NO. 1 所示氨基酸序列的日本血吸虫PDI基因，所述重组表达载体的空载体为原核表达载体 pET28a(+)，所述日本血吸虫PDI基因插入在空载体pET28a(+)的EcoR I和Sal I两个酶 切位点之间；
[0016] 将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；
[0017] 培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达 载体表达日本血吸虫PDI蛋白；
[0018] 纯化重组表达的日本血吸虫PDI蛋白。
[0019] 在本发明的一个具体实施例中，构建含日本血吸虫PDI基因的重组表达载体，具 体包括以下步骤：利用生物信息学进行在线分析，找出编码日本血吸虫蛋白质二硫键异构 酶（SjPDI)的核苷酸片段；根据该核酸序列设计PCR上下游引物，分别在上下游引物5'末 端加上EcoR I、Sal I限制性内切酶酶切位点，PCR扩增核酸片断，再利用特异限制性内切 酶EcoR I、Sal I酶切PCR扩增片段，将酶切下来的编码SjPDI抗原的核酸片段定向克隆至 原核表达载体pET28a (+)的多克隆位点区，构建成重组原核表达质粒pET28a (+) -S jH)I。
[0020] 在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述日本血吸虫重组抗原的抗血吸虫疫 苗。
[0021] 在本发明的另一方面，还提供了一种能与上述日本血吸虫重组抗原特异性结合的 抗体。
[0022] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组载体在制备预防或治疗血吸虫病的 疫苗或药物中的应用。
[0023] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组载体在制备诊断血吸虫病的产品中 的应用。
[0024] 本发明重组载体表达的日本血吸虫蛋白质二硫键异构酶可以作为诊断抗原对血 吸虫病畜进行诊断。
[0025] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组载体在制备蛋白质二硫键异构酶产 品中的应用。
[0026] 本发明日本血吸虫重组抗原Sjroi，在小鼠保护实验中分别诱导35.32 %、 33. 17%的减虫率和减卵率，同时可诱导小鼠体内产生抗重组抗原的特异性IgG、IgGl和 IgG2a抗体，并且能达到一个较高的水平，表明该重组抗原具有发展为抗血吸虫病候选疫苗 分子及新药靶的潜力，具有很好的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0028] 图1是本发明实施例1的重组质粒pET28a(+)_Sjroi的双酶切鉴定图；
[0029] 图2是本发明实施例1重组蛋白SjPDI的表达和纯化结果图；
[0030] 图3是本发明实施例2的实时定量PCR分析SjPDI在不同发育阶段血吸虫内的转 录水平图；
[0031] 图4是本发明实施例3重组蛋白SjPDI抗原性分析结果图；
[0032] 图5是本发明实施例4的SjPDI蛋白在血吸虫体内的定位表达图；
[0033] 图6是本发明实施例6抗SjPDI特异性IgG抗体水平的检测结果图；
[0034] 图7是本发明实施例7的酶活性试验结果图。
【具体实施方式】
[0035] 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物 学实验指南》（F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京： 科学出版社，2004)中所述的方法进行。
[0036] 本发明运用基因工程重组技术构建了重组原核表达质粒pET28a(+)_Sjroi，将该 重组质粒pET28a (+)-S jPDI转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达，得S jPDI重组蛋白，该重 组蛋白在小鼠保护实验中分别诱导35. 32%、33. 17%的减虫率和减卵率，同时可诱导小鼠 体内产生抗重组抗原的特异性IgG、IgGl和IgG2a抗体，并且能达到一个较高的水平。这些 实验结果表明，本发明重组抗原具有发展为抗血吸虫病候选疫苗及新药靶的潜力，应用价 值广阔。
[0037] 实施例lSjPDI日本血吸虫重组蛋白的克隆、表达和纯化
[0038] 1.方法
[0039] 1. 1重组表达质粒的构建
[0040] 根据NCBI登录号gi226468213的SjPDI的基因序列，设计引物，上游引物：5'-CG￡ MTTCAGTGAGGTTCTCGAACTC-3? (SEQ ID N0. 3,下划线处为 EcoR I 酶切位点）；下游引物：5'C GGTCGACCTATAGATCACTCTTCTTC-3' (SEQ ID N0. 4,下划线处为 Sal I 酶切位点）。以日本血 吸虫42d虫体的cDNA为模板（2ul)，Master Mixl2. 5ul，上下游引物各lul，ddH208. 5ul，混 匀，扩增SjPDI基因序列中ORF片段（其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示），PCR扩增程序： 95°C 5min，95°C变性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 2min，共 31 个循环；最后 72°C 10min。
[0041] 凝胶电泳鉴定PCR产物，将鉴定正确的产物纯化回收，之后连接pMD19-T载体，转 化至DH5细胞，挑取单个克隆，进行菌液PCR鉴定，阳性克隆送上海华津公司测序。将上述测 序正确的菌液大量扩增，提取质粒后进行纯化回收，酶切，将带有粘性末端的DNA片段定向 克隆到原核表达载体pET28a (+)的多克隆位点中，构建成重组表达质粒pET28a (+)-S jroi， 将其转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，挑取单个克隆，PCR菌液鉴定后送上海华津公司 测序。
[0042] 1. 2重组蛋白pET28a(+)_SjPDI的表达与纯化
[0043] 将测序正确的pET28a(+)-Sjroi/BL21菌液转接到500ml LB(K+)液体培养基中， 37°C，250rpm/min振荡培养至细菌生长对数期0D6(KI = 0. 6,加入IPTG，使其终浓度为1禮， 20°C，250rpm/min，振荡诱导7h。然后将菌液4°C，12000 X g离心15min，弃上清，用15ml PBS 悬浮沉淀，反复冻融3次，待完全融化后，超声lOmin (超5s，停45s)，随后4°C，12000 X g离 心15min，收集上清，再用10ml8mol/L尿素溶解沉淀，4?，12000Xg离心15min，收集上清。 分别取PBS和尿素溶解的上清50ul，与50yLlXSDS PAGE Loading Buffer充分混匀。沸 水煮样5_6min，直接进行SDS-PAGE分析。重组蛋白在大肠杆菌BL21中可溶性表达，超声上 清按照说明书利用Ni 2+-NTAHis-Bind Resin纯化得到重组蛋白。
[0044] 2.结果
[0045] 2. 1重组质粒pET28a (+) -S jPDI的构建及鉴定
[0046] 以日本血吸虫42d虫体为cDNA模板，PCR扩增目的基因后和特异性限制内切酶 EcoR I、Sal I将SjPDI核苷酸片段克隆至表达载体pET28a(+)中，双酶切鉴定重组质粒， 结果与预期DNA片段大小一致（图1)，图1中，M :Marker ;1 :EcoR I、sal I双酶切重组质 粒。酶切鉴定正确的质粒送上海华津生物公司测序，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，与预 测相符。
[0047] 2. 2pET28a(+)_SjPDI在大肠杆菌中的表达与重组蛋白的纯化
[0048] 重组表达质粒pET28a(+)_SjPDI在大肠杆菌BL21感受态细胞中为可溶性表达， 经纯化得到了较纯的重组蛋白，重组蛋白分子量为55kD(图2)。图2中，M:Marker ;1、2 : pET28a(+)未诱导、诱导的细菌裂解产物；3、4 :PET28a(+)-SjPDI未诱导、诱导的细菌裂解 产物；5、6 :PET28a(+)-SjPDI诱导7h后的超声上清、包涵体沉淀；7 :纯化后的SjH)I。
[0049] 实施例2荧光实时定量PCR分析SjPDI在虫体不同发育阶段的转录水平
[0050] 1.方法
[0051] 取冻存于液氮的7、14、21、28、35、42天以及42天雌、雄虫体，利用Trizol提取 各期别虫体的总 RNA，米用 Prime Script RT reagent Kit With gDNAEraser(TaKaRa) 试剂盒反转录成 cDNA 后利用 7500Real_Time PCR system (Applied Biosystems) and SYBR1.· Premix Ex Taq?II (Perfect Real Time) (Takara)检测 SjPDI 在日本血吸 虫不同发育阶段的转录水平。SjPDI基因上游引物：5' -GCTCCTTGGTGTGGTCATTG-3'（SEQ IDN0·5);下游引物：5'-TTGGTAAAGCATGGGTGAAGAC-3'（SEQIDN0·6)，作为内参对照的 NADH 脱氢酶基因的上游引物：5'-CGAGGACCTAACAGCAGAGG-3'（SEQ ID NO. 7);下游引物： 5' -TCCGAACGAACTTTGAATCC-3'（SEQ ID Ν0· 8)。50ul 反应体系包括 25μ 1 SYBR* Premix Ex Taq? ΙΙ(2Χ)，4μ1 上下游引物（10μΜ)，1ιι1 R0X Reference Dye ΙΙ(50Χ)，4μ1 cDNA 模板，16ul ddH20。反应程序为 95°C 30s，95°C 5s、60°C 34s(40cycles)，60°C 34s 时收集荧 光信号。利用ABI7500System Software进行数据分析，采用双标准曲线法计算SjPDI在不 同发育时期虫体中的表达量。
[0052] 2.结果
[0053] 以NADH脱氢酶为内参基因，检测SjPDI在7(1、14(1、21(1、28(1、35(1、42(1血吸虫虫体 及42d雌、雄虫体中的转录水平。结果显示，SjPDI在每个时期均有表达，其中在42d及42d 雄虫转录水平较高，28d虫体中转录水平最低（图3)。
[0054] 实施例3SjPDI日本血吸虫重组蛋白的抗原性检测
[0055] 1. Western Blotting分析重组蛋白抗原性
[0056] Ni2+柱纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，之后4°C，280mA，1. 5h转移到硝酸 纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2h，PBST洗三次后，用pET28a(+)-SjPDI重组蛋白免疫小 鼠的三免血清和健康小鼠的阴性血清分别作为一抗，室温孵育2h，之后用辣根过氧化物酶 (HRP)标记的山羊抗小鼠 IgG作为二抗，孵育lh，DAB作为底物观察显色情况，并分析重组 蛋白的抗原性。
[0057] 2. Western Blotting分析重组蛋白抗原性的结果
[0058] 结果如图4所示，55kD处有一明显的识别条带，以阴性血清作为一抗时，55kD处没 有明显条带,表明重组蛋白有很好的免疫原性和抗原性。图4中，M :Marker ;1 :以重组蛋白 免疫小鼠的血清作为一抗；2 :以健康小鼠的阴性血清作为一抗。
[0059] 实施例4SjPDI的组织定位分析
[0060] 42d虫体冰冻切片用冰冻丙酮固定30min后，10%山羊血清室温封闭2h，PBST洗 3次，每次lOmin，之后分别用小鼠抗SjH)I的三免血清和阴性血清作为一抗，孵育2h，PBST 洗3次后用CY3标记的山羊抗小鼠 IgG作为二抗室温孵育2h，之后用DAPI复染5min，在荧 光显微镜下观察蛋白的组织分布。
[0061] 结果：荧光组织定位结果显示，PDI主要分布于表膜和实质器官内，阴性对照组无 明显着色（图5)。图5中，a :以重组蛋白免疫小鼠的血清作为一抗；b :以健康小鼠的阴性 血清作为一抗。
[0062] 实施例5动物免疫保护实验
[0063] 将30只BALB/c小鼠随机分为3组，每组15只，分别注射重组蛋白 pET28a(+)-SjPDI+206 佐剂、206 佐剂 +PBS、PBS，注射剂量为 20ug/100ul/ 只。每两个星 期免疫一次，共免疫三次，末次免疫2周后，每只小鼠经腹部人工感染尾蚴40±2条。感染 42d后，解剖小鼠，采用肝静脉灌注法收集虫体并计数，按以下公式计算减虫率：减虫率= (1-免疫组平均虫数/对照组平均虫数）X 100%。收集肝脏并称重，加入15ml PBS充分匀 浆研磨，之后各管取出lml匀浆加入等体积10%的NaOH溶液，56°C水浴消化lh，上下颠倒 混匀后，取出50ul，在显微镜下计数肝组织虫卵数，每个样品重复三次，按以下公式计算减 卵率：减卵率=(1-免疫组EPG/对照组EPG) X 100% (EPG为平均每克肝组织中所有虫卵 数）。
[0064] 结果：重组蛋白pET28a(+)_SjPDI诱导的免疫保护效果见表1。与PBS空白对照 组相比，免疫组在BALB/c小鼠中分别诱导了 35. 32%、33. 17%的减虫率和减卵率。
[0065] 表1重组蛋白SjPDI诱导的动物免疫保护效果
[0066]
【权利要求】
1. 一种重组载体，其特征在于，包含日本血吸虫PDI基因，该基因序列为编码SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的空载体为原核表达 载体pET28a (+)，所述日本血吸虫PDI基因插入在空载体pET28a (+)的EcoR I和Sal I两 个酶切位点之间。
3. -种日本血吸虫重组抗原，其特征在于，该重组抗原由权利要求1或2所述的重组载 体经诱导表达制得。
4. 一种包含权利要求1或2所述重组载体的宿主细胞。
5. -种日本血吸虫重组抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 构建含日本血吸虫PDI基因的重组表达载体，所述基因是编码SEQ ID NO. 1所示氨基 酸序列的日本血吸虫PDI基因，所述重组表达载体的空载体为原核表达载体pET28a (+)，所 述日本血吸虫PDI基因插入在空载体pET28a(+)的EcoR I和Sal I两个酶切位点之间； 将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞； 培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体 表达日本血吸虫PDI蛋白； 纯化重组表达的日本血吸虫PDI蛋白。
6. -种抗血吸虫疫苗，其特征在于，包含权利要求3所述日本血吸虫重组抗原。
7. -种能与权利要求3所述日本血吸虫重组抗原特异性结合的抗体。
8. 权利要求1或2所述重组载体在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用。
9. 权利要求1或2所述重组载体在制备诊断血吸虫病的产品中的应用。
10. 权利要求1或2所述重组载体在制备蛋白质二硫键异构酶产品中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK104152477SQ201310173813
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月13日 优先权日:2013年5月13日
【发明者】林矫矫, 曹晓丹, 傅志强, 洪炀, 张旻, 韩艳辉, 王馨茁, 李长健, 伍妙梨, 郭小勇, 陆珂, 朱传刚 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所