有毒微囊藻菌株及其毒素纯化方法
【专利摘要】本发明涉及一种高产毒微囊藻菌株及其所产毒素的纯化方法，属微生物【技术领域】。该菌株为铜绿微囊藻（Microcystisaeruginosa）;于2013-4-25送中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏号CCTCCM2013146。其具有以下生物学特征：生长速度较快，容易继代和大量培养；产生的主要毒素为MC-LR，毒素含量高、毒性强；能长期大量培养且形态和遗传形状不变化；长期培养毒性不减弱或丧失；可以用廉价培养基替代MA培养基而其产量和毒性不变化。可用于大量培养提取和制备MC粗品和纯品并商业化。
【专利说明】有毒微囊藻菌株及其毒素纯化方法
[0001]【技术领域】
本发明涉及一种高产毒微囊藻菌株的分离培养及其毒素纯化方法，微生物【技术领域】。【背景技术】
[0002]近年来由于水体富营养化而导致蓝藻水华(cyanobacterial bloom)的频繁发生已成为国内外普遍关注的水环境污染问题。我国目前66%以上的湖泊、水库处于富营养化状态，其中重富营养和超富营养的占22 %; 70 %以上河流受到程度不同的污染，富营养化和蓝藻水华是我国当今最大的水环境问题。我国大型湖泊蓝藻水华频繁发生，尤其是滇池、太湖、巢湖等，如2007年太湖蓝藻水华曾导致无锡市居民饮用水危机，引起新闻媒体和政府的高度关注。蓝藻水华不仅污染水体、破坏饮用水源、造成渔业损失，而且多数蓝藻水华由于产生蓝藻毒素(cyanotoxin)还影响和危害水生动物甚至人的健康。蓝藻水华最常见的蓝藻是铜绿微囊藻aeruginosa),而且大多产生蓝藻毒素(cyanotoxin)从而影响和危害水生动物甚至人的健康。微囊藻毒素(microcystins,MCs)是蓝藻毒素中最常见的一类肝毒素，具广谱生物毒性，长期慢性低剂量暴露(如通过饮用水途径)，MC可引起易感人群患肝炎并促发肝癌。
[0003]MC 一般由7个被修饰过的氨基酸构成的环状小肽，常见有MC-LR、MC-RR和MC-YR3种，其中MC-LR的毒性最高(一般是MC-RR的10倍)，而且是世界卫生组织(WHO)制定饮用水标准的种类。MC化学结构稳定不易降解，抗pH和高温，加热煮沸只能小部分降解(不大于20 %)。常规自来水处理工艺，如加氯、过滤等都不能彻底消除水中MC。因此，在发生微囊藻水华的河流、湖泊、水库甚至居民自来水中，都可能存在MC。WHO 1998年已经推荐了饮用水微囊藻毒素(MC-LR)限量标准为lmg/L，我国卫生部2002年采用了该标准。
[0004]MC主要用于毒理学、生物学和肝病相关实验研究，目前国内只有1-2家公司出售。分离、纯化有毒微囊藻菌株，使其达到高产此类菌株；同时，优化分离和纯化毒素的方法技术，降低成本并减少环境污染，对于微囊藻毒素的研究具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一株能高产微囊藻毒素的有毒微囊藻菌株?’另一目的在于提供其纯化方法，降低成本并减少环境污染。
[0006]为实现本发明目的，在河南省某水库通过采集水样，进行分离培养并获得单种培养物，经鉴定为铜绿微囊藻(#iaeruginosa MNOOl);于2013 - 4 - 15送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏(地址 武汉市武昌路珞珈山，武汉大学)，保藏号CCTCC M2013146。
[0007]该藻株具有以下生物学特征:
1.生长速度较快，容易继代和大量培养；
2.批量培养后进行毒性鉴定，发现为有毒微囊藻，产生的主要毒素为MC-LR；
3.所产毒素含量高(HPLC检测结果);毒性强(所产MC为MC-LR);能长期大量培养且形态和遗传性状不易改变；长期培养毒性不减弱或丧失(急性毒性实验结果)；可以用廉价培养基，如BG-1l替代MA培养基而毒性不变化。
[0008]4.目前国内微囊藻株产生的毒素多为MC-RR，MC-RR毒性低、价格也低；优势是该藻株产生毒素为MC-LR并具有一些较突出的特点和优势。
[0009]有毒微囊藻株的分离培养及其毒素制备和初步纯化的方法如下:I)首先在河南省某水库采集水样，显微镜鉴定种类；
2)采用微吸管法在显微镜下进行目的微囊藻的分离；
3)将分离的单个群体微囊藻转入培养瓶内在光照培养箱内进行光照培养，培养条件和参数:培养基为MA培养基、温度25°C、光照强度2 000 lux、培养液pH 8.6 ;静置培养、不通气。
[0010]4)培养I个月后，待单种微囊藻培养物生长良好后(培养瓶呈现较浓的蓝绿色)，将单种微囊藻培养物进行扩大培养，即用该单种微囊藻培养物作为藻种，用I L培养瓶进行通气培养，培养条件和参数同上。
[0011]5)扩大培养后进行批量/大量培养，即用该单种微囊藻培养物作为藻种，用10 L培养瓶进行通气培养，培养条件和参数同上。
[0012]6)获得大量培养物后，用小白鼠进行急性毒性试验，检测该藻株的毒性；
7)实验室保存该单种微囊藻培养物并送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。
[0013]8)大量培养该单种微囊藻培养物，收集培养物离心后获得藻浆；
9)采用煮沸法提取微囊藻细胞抽提液，即将藻浆煮沸，静置冷却后12000 X ^?离心，取上清液，即获得微囊藻细胞抽提液；
10)用质量百分比70%的甲醇4°C下抽提，12 000 X ^?离心，取上清液；
11)将获得的上清液在60° C下旋转蒸发干燥；
12)PBS 重新溶解后过 C18 ODS 柱子(Sep-Pak0 Plus, waters)；
13)然后用质量百分比20%甲醇洗脱后再用质量百分比100%甲醇洗脱；
14)将收集的洗脱液在60° C下旋转蒸发干燥；
15)PBS溶解干燥的粗毒素后-20 ° C保存；
16)高压液相色谱(HPLC)检测粗毒素中MC的种类和含量。
[0014]该过程可简化为图1。
[0015]本发明优点在于:
1)采用煮沸法提取微囊藻细胞 抽提液代替乙酸、甲醇抽提法，不需要进行冷冻干燥处理，节省了能源，而且减少了环境污染；
2)采用该方法获得的有毒微囊藻菌株，经HPLC检测，其所产毒素主要为MC-LR，而且含量较高。粗毒素中MC总含量为214.26 u g/mL PBS solution，其中MC-LR和MC-YR分布占65.98%和34.02%, MC-RR未检出(见附图2)。可用于大量培养提取和制备MC粗品和纯品并商业化。
[0016]
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本发明纯化工艺路线图；图2为本发明纯化所获得的粗毒素的HPLC谱图。
【具体实施方式】
[0018]实施例1
其纯化方法如下:
1)水库采集水样、显微镜鉴定种类；
2)采用微吸管法在显微镜下进行目的微囊藻的分离；
3)将分离的单个群体微囊藻转入培养瓶内在光照培养箱内进行光照培养，培养条件和参数:培养基为MA培养基、温度25°C、光照强度2 000 lux、培养液pH 8.6 ;静置培养、不通气。
[0019]4)培养I个月后，待单种微囊藻培养物生长良好后(培养瓶呈现较浓的蓝绿色)，将单种微囊藻培养物进行扩大培养，即用该单种微囊藻培养物作为藻种，用I L培养瓶进行通气培养，培养条件和参数同上。
[0020]5)扩大培养后进行批量/大量培养，即用该单种微囊藻培养物作为藻种，用10 L培养瓶进行通气培养，培养条件和参数同上。
[0021]6)获得大量培养物后，用小白鼠进行急性毒性试验，检测该藻株的毒性；
7)实验室保存该单种微囊藻培养物并送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。
[0022]8)大量培养该单种微囊藻培养物，收集培养物离心后获得藻浆；
9)采用煮沸法提取微 囊藻细胞抽提液，即将藻浆煮沸10-15分钟，静置冷却后12000X g离心10分钟，取上清液，即获得微囊藻细胞抽提液；
10)用质量百分比70%的甲醇4°C下抽提12小时，12 000 X貧离心15分钟，取上清液；
11)将获得的上清液在60° C下旋转蒸发干燥；
12)PBS 重新溶解后过 C18 ODS 柱子(Sep-Pak0 Plus, waters)；
13)质量百分比20%甲醇洗脱后再用质量百分比100%甲醇洗脱；
14)洗脱液在60° C下旋转蒸发干燥；
15)PBS溶解干燥的粗毒素后-20 ° C保存；
16)高压液相色谱(HPLC)检测粗毒素中MC的种类和含量。
[0023]经HPLC检测，如附图2，I为MC-LR所在的峰；2为MC-YR所在的峰；3为MC-RR所在的吸收峰。可以看出:该微囊藻株所产毒素主要为MC-LR，而且含量高。粗毒素中MC总含量为 214.26 μ g/mL PBS solution，其中 MC-LR 和MC-YR 分布占 65.98% 和 34.02%,MC-RR未检出。
[0024]应用例I
急性毒性实验结果:
(I)小白鼠急性毒性试验结果表明，微囊藻细胞抽提液对小鼠的LD5tl为35 μ g抽提液干重/公斤体重；
(2 )粗毒素对小鼠的LD5tl为40-60 μ g粗毒素干重/公斤体重；
应用例2
用廉价培养基BG-1l替代MA培养基大量培养后，该藻株的生长、产量及其毒性无显著变化。
【权利要求】
1.一种有毒微囊藻菌株，为铜绿微囊藻aerygiflosa),保藏号为CCTCC M2013146。
2.如权利要求1所述的有毒微囊藻菌株毒素的纯化方法。
3.步骤如下: (1)大量培养该单种微囊藻培养物，收集培养物离心后获得藻浆； (2)采用煮沸法提取微囊藻细胞抽提液，即将藻浆煮沸，静置冷却后12000 X ^?离心，取上清液，即获得微囊藻细胞抽提液； (3)用质量百分比70%的甲醇4°C下抽提，12 000 X ^?离心，取上清液； (4)将获得的上清液在60° C下旋转蒸发干燥； (5)PBS重新溶解后过C18 ODS柱子； (6)质量百分比20%甲醇洗脱后再用质量百分比100%甲醇洗脱； (7)将收集的洗脱液在60° C下旋转蒸发干燥； (S)PBS溶解干燥的粗毒素 -20 ° C保存。
【文档编号】C12P21/04GK103484394SQ201310278386
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年7月4日 优先权日:2013年7月4日
【发明者】李效宇, 周春娥, 段红英, 刘洋, 张榜军, 马军国, 方倩 申请人:河南师范大学