一种水稻每穗粒数增效基因Gn1a的分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供的一种水稻每穗粒数增效基因Gn1a的分子标记，其上游引物序列如SEQ?ID?NO:1所述，下游引物序列如SEQ?ID?NO:2所示。该引物可准确、快速的选择每穗粒数性状较好的个体，通过与常规育种相结合，能够在减少成本的情况下大大提高育种效率，同时，对于育种辅助选择的准确性高。
【专利说明】一种水稻每穗粒数增效基因Gnla的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于水稻分子育种【技术领域】，具体涉及水稻每穗粒数增效基因Gnla的分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002]联合国粮食及农业组织(简称联合国粮农组织；FA0)预测:随着人口的快速增长与耕地的流失，未来20年到50年，粮食短缺将成为一个严峻的全球性问题。水稻作为世界范围内最重要的作物之一，为全球超过半数的人口提供食物来源，因此进一步增加水稻单产对解决粮食短缺这一全球性问题具有关键作用。
[0003]每穗粒数是水稻最重要的农艺性状之一，是水稻产量的构成因子，直接决定水稻单产，故增加每穗粒数是水稻增产的重要途径。然而，每穗粒数是典型的数量性状，受多基因的数量性状基因座(Quantitative Trait Loci，QTL)控制。直到最近才发现位于第I染色体的Gnla基因是控制水稻每穗粒数的主效基因，可以解释籼粳品种Habatak1、Koshihikari间44%的表型变异,来自籼稻品种Habataki的等位基因可以增加水稻的每穗粒数，从而可以增加水稻的单株产量。
[0004]传统育种方法主要对水稻的穗形进行目测再予以选择和固定，具有很大的盲目性，选择效率底下，而分 子标记辅助选择(Marker-Assisted Selection,MAS)技术给水稻育种提供了新的途径，由于MAS方法是对品种的基因型进行的选择，不受环境的影响，因此选择的可靠性强。但是到目前为止可直接用于对水稻每穗粒数选择的分子标记尚未发现，如果能将控制每穗粒数的主效基因Gnla的遗传变异转化为操作性好的分子标记，利用MAS育种将其应用于对水稻穗形的改良育种中，必将有效的提升水稻产量。
【发明内容】
[0005]发明目的:本发明的第一目的是提供一种水稻每穗粒数增效基因Gnla的分子标记的引物，本发明的第二目的是提供上述引物的应用。
[0006]技术方案:本发明提供的一种水稻每穗粒数增效基因Gnla的分子标记的引物，其上游引物序列如SEQ ID NO:1所述，下游引物序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0007]本发明还提供了上述的水稻每穗粒数增效基因Gnla的分子标记的引物在水稻辅助育种中的应用。
[0008]具体而言，所述应用包括以下步骤:利用上述的引物扩增待测水稻全基因组DNA，产物经琼脂糖凝胶电泳检，若产物为113bp的DNA片段，则待测水稻的基因型为增效型；若产物为129bp的DNA片段，则待测水稻的基因型为非增效型。
[0009]更具体的，包括以下步骤:
[0010](I)DNA的提取:水稻全基因组DNA的提取采用常规的CTAB法；
[0011](2)标准PCR扩增体系的建立:以待测水稻全基因组DNA为模板，PCR反应体系设定为25 μ 1，其中包括:25ng待测水稻全基因组DNA，2.5μ 110XPCR缓冲液(Tris-HCllOmmol/L, PH8.3，KC150mmol/L,明胶 0.001%) ,2.5 μ 11.5mmol/L 的 MgCl2 溶液，
2.5 μ 12.5mmol/L的dNTPs,2y I引物工作液(上游引物、下游引物各含0.033ng)，IU Taq酶，加ddH20至25 μ I ;标准PCR反应程序为:95°C变性5min ;94°C变性0.5min，53°C退火0.5min, 72°C延伸lmin, 33个循环；最后在72°C延伸5min ；
[0012](3)扩增DNA片段检测分析:PCR产物经3%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，如果产物是113bp的DNA片段，则待测水稻的基因型为I型，即Habataki类型(增效型)，如果DNA片段是129bp，则为II型(非增效型)。
[0013]有益效果:本发明提供的水稻每穗粒数增效基因Gnla的分子标记的引物可准确、快速的选择每穗粒数性状较好的个体，通过与常规育种相结合，能够在减少成本的情况下大大提高育种效率，同时，对于育种辅助选择的准确性高。
[0014]具体而言，本发明相对于现有技术具有以下突出的优势:
[0015]1、本发明的分子标记的引物是直接对水稻每穗粒数性状进行选择的分子标记引物，可直接应用于水稻生产。
[0016]2、本发明设计的分子标记的引物Gnla-STS为基因内分子标记，是对Gnla进行选择的专用标记，对Gnla基因的选择准确度为100%。
[0017]3、本发明设计的分子标记的引物Gnla-STS为共显性标记，可以准确区分杂合型与纯合型，在回交后代中可以选择供体亲本Gnla基因型的F1杂合单株，保证了在回交过程中不会丢失杂合的目标单株。
[0018]4、本发明标记操作简单，无需酶切，用普通的琼脂糖电泳即可清楚的区分，在一般的实验室便可应用。在不影响植株正常发育的情况下，早在水稻5-6叶的秧苗期内即可采集水稻样本，进行DNA提取并予以检测，3-5天内可得到结果，而不需要等待植株成熟便可知水稻的基因型，选择每穗粒数较多的单株，拔除不含增效基因型的单株，减少土地水肥等资源的浪费，节约成本，提高效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为Gnla的分子标记的引物Gnla-STS的验证部分知名品种Gnla基因型的琼脂糖电泳图。其中M为DL2000标准分子量Marker, I为Habataki, II为Nipponbare0
[0020]图2为Gnla的分子标记的引物Gnla-STS的验证部分知名品种Gnla基因型的聚类分析结果。
【具体实施方式】
[0021]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0022]实施例1
[0023]水稻每穗粒数增效基因Gnla的分子标记引物设计:
[0024]在公共数据库NCBI下载籼稻Habataki的Gnla基因序列，与粳稻日本晴的序列比较发现=Habataki在Gnla基因5’非翻译区存在16个碱基的缺失，根据这一序列差异，利用Primer5.0软件设计STS (Sequence-Tagged Site)标记，获得专用分子标记Gnla-STS引物对，如下:[0025]上游引物序列(5，-3，)，SEQID NO:1:CTCTTGCTTCATTATCAATC ；
[0026]下游引物序列(5，-3’)，SEQID NO: 2:AAACTACACAAGAATCTGCT。
[0027]实施例2
[0028]利用上述水稻每穗粒数增效基因Gnla的分子标记引物检测待测水稻的基因型:
[0029](I)DNA的提取:水稻全基因组DNA的提取采用常规的CTAB法；
[0030](2)标准PCR扩增体系的建立:以待测水稻全基因组DNA为模板，PCR反应体系设定为25 μ 1，其中包括:25ng待测水稻全基因组DNA，2.5μ 110XPCR缓冲液(Tris-HCl 10mmol/L, PH8.3，KC150mmol/L,明胶 0.001%) ,2.5 μ 11.5mmol/L 的 MgCl2 溶液，2.5 μ 12.5mmol/L的dNTPs,2y I引物工作液(上游引物、下游引物各含0.033ng)，IU Taq酶，加ddH20至25 μ I ;标准PCR反应程序为:95°C变性5min ;94°C变性0.5min，53°C退火0.5min, 72°C延伸lmin, 33个循环；最后在72°C延伸5min ；
[0031](3)扩增DNA片段检测分析:PCR产物经3%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，如果产物是113bp的DNA片段，则待测水稻的基因型为I型，即Habataki类型(增效型)，如果DNA片段是129bp，则为II型(非增效型)。
[0032]利用上述方法对部分知名品种Gnla的基因型进行验证，结果见表1。
[0033]表1部分知名品种Gnla的基因型检测结果
【权利要求】
1.一种水稻每穗粒数增效基因Gnla的分子标记的引物，其特征在于:其上游引物序列如SEQ ID NO:1所述，下游引物序列如SEQ ID N0:2所示。
2.权利要求1所述的水稻每穗粒数增效基因Gnla的分子标记的引物在水稻辅助育种中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于:包括以下步骤:利用权利要求1所述的引物扩增待测水稻全基因组DNA，产物经琼脂糖凝胶电泳检，若产物为113bp的DNA片段，则待测水稻的基因型为增效型；若产物为129bp的DNA片段，则待测水稻的基因型为非增效型。
【文档编号】C12Q1/68GK103468674SQ201310354970
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月14日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】曾生元, 龚红兵, 林添资, 盛生兰, 景德道, 余波, 钱华飞, 周义文, 李闯, 刁立平 申请人:江苏丘陵地区镇江农业科学研究所