一种可用于大规模生产的mstn酵母菌种的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，该方法步骤为：KanMX4基因片段的扩增和pBlue-KanMX4载体的构建；酵母基因同源臂的插入；pBlue-kan-NTS2-5’3'-MSTN整合载体的构建；将MSTN载体整合入酵母基因组；抗性基因KanMX4的敲除。本发明构建了不含有筛选基因的Myostatin整合型酵母菌株，该菌种可以在富集型培养基中生产，安全可靠成本低，不会造成目的基因丢失，适合于大规模生产重组酵母，采用本发明大规模生产的酵母菌株直接饲喂动物，可在动物体内产生高水平MSTN特异性抗体，解除其抑制作用，促进肌肉生长，这对动物生产具有重要意义。
【专利说明】—种可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，尤其涉及一种可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建。
【背景技术】
[0002]肌生成抑制素(Myostatin，MSTN)是肌肉生长的一种负调控因子，隶属于TGF-β超家族，具有TGF- β超家族所有特点。
[0003]MSTN突变产生的双肌现象给畜牧生产和医药业带来巨大影响。Mcpherron研究发现该基因缺失鼠肌肉增大，骨骼肌肌群分布更广泛，体重约是野生鼠的2倍以上。Kambadur发现双肌牛的该基因发生了突变，在同样喂食条件下，双肌牛比普通牛可以多提供30%的肉产品。
[0004]2011年，zhang等发现小鼠口服表达MSTN的酵母，能产生高水平的MSTN特异性抗体，该抗体可以解除MSTN基因对肌肉生长的抑制，进而提高的胴体重和肌肉生长。
[0005]但采用非整合质粒表达载体的长期扩繁会造成携带目的基因质粒的丢失，且需要筛选培养基选择压的持 续抗性筛选，成本高，操作复杂，不适合大规模的工业化生产。
【发明内容】
[0006]本发明实施例的目的在于提供一种可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，旨在解决目前采用非整合质粒表达载体的长期扩繁会造成携带目的基因质粒的丢失，且需要筛选培养基选择压的持续抗性筛选，成本高，操作复杂，不适合大规模的工业化生产的问题。
[0007]本发明是这样实现的，一种可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，该可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法包括以下步骤:
[0008]步骤一、KanMX4基因片段的扩增和pBlue_KanMX4载体的构建；
[0009]步骤二、酵母基因同源臂的插入；
[0010]步骤三、pBlue-kan-NTS2_5’3’ -MSTN 整合载体的构建；
[0011]步骤四、将MSTN载体整合入酵母基因组；
[0012]步骤五、抗性基因KanMX4的敲除。
[0013]进一步，步骤一 KanMX4基因片段的扩增和pBlue_KanMX4载体的构建具体步骤为:
[0014]设计引物LoxP-Kan F，LoxP-Kan R在提取到的酵母基因组中扩增KanMX4基因片段；
[0015]在引物两段添加LoxP序列和EcoRI，BamHI两个酶切位点，把KanMX4基因片段在酵母基因组中扩增出来，PCR程序:①预变性:94°C 3m 20Cycle，变性94°C Im ;退火45°C 30s ;延伸 72°C 2m ;③延伸 72°C 5m 4°C forever ；
[0016]PCR后进行溶液回收，用EcoRI和BamHI进行双酶切，在I %琼脂糖凝胶电泳上跑胶，胶回收酶切产物获得较纯的片段，用同样的酶双酶切pBluescript II SK+，再将两个片段在16 °C过夜连接；
[0017]将获得的连接产物在大肠杆菌中转化，转化成功后挑选其中的单克隆提取细菌质粒，首先用BamHI和EcoRI双酶切，跑I %的琼脂凝胶电泳确定酶切片段的长度，初步判断是否为阳性质粒，并测序鉴定质粒是否成功转化。
[0018]进一步，步骤二通过酵母基因组同源臂的插入具体步骤为:
[0019]在酵母基因组的non-transcript1nal space2即NST2片段中设计NST2-5’端和NST2-3’端两个同源臂的四个引物；
[0020]在NTS2-5’引物中插入XhoI和KpnI两个限制性内切酶的酶切位点；
[0021]在NTS2-3’引物中插入Notl，和SacII两个限制性内切酶的酶切位点；
[0022]将NTS2-5’ R和NTS2-5’ F两条引物加入PCR缓冲液中，94°C室温下冷却5min，直接得到了同 源臂NTS2-5’，用XhoI和KpnI分别双酶切NTS2-5’同源臂和pBlue-kan，再分别胶回收两部分进行连接，连接产物转化到大肠杆菌中，转化成功后，挑选其中的单克隆提取细菌质粒PCR鉴定，测序进一步确定，用相同的方法将NTS2-3’同源臂插入进来，最终得到 pBlue-kan_NTS5’ 3’ 载体。
[0023]进一步，步骤三pBlue-kan-NTS2_5’ 3’ -MSTN整合载体的构建的具体步骤为:
[0024]从JMB667中扩增出ADHl启动子和Cyc3终止子，从pET32a_MSTN中扩增出MSTN基因;
[0025]将三部分分别胶回收纯化，设计引物用overlap PCR的方法连接ADHl启动子，Cyc3终止子和MSTN基因，组装成2890bp的MSTN基因片段；
[0026]PCR后进行胶回收，再用Xho I和EcoR I进行双酶切，用同样的酶双酶切pBlue-kan-NTS5’ 3’载体，再进行两部分的连接，将连接产物转化到大肠杆菌中，得到MSTN整合载体 pBlue-kan-NTS2-5’ 3’ -MSTN ；
[0027]挑取转化的单克隆提取质粒，用酶切法初步鉴定，并进行测序。
[0028]进一步，步骤三pBlue-kan-NTS2_5’ 3’ -MSTN整合载体的构建中在做Overlap PCR时，首先扩增MSTN和Cyc-3两部分；
[0029]连接ADH1、MSTN、Cyc-3三部分，首先要做个Pool ；
[0030]PCR程序:①预变性:94 °C 3m ;②8Cycle变性94 °C Im ;退火45 V 30s ；延伸72 °C 2m ;③延伸 72°C 5m 4°C forever ；
[0031]PCR程序完成后再加入引物ADHl和Cyc_3各Iul，继续程序:①预变性:94°C 3m ；② 20Cycle，变性 94。。Im ;退火 45°C 30s ;延伸 72°C 3m ;③延伸 72°C 5m ；@ 4°C forever?
[0032]进一步，步骤四将MSTN载体整合入酵母基因组的具体步骤为:
[0033]将pBlue-kan-NTS2_5’ 3’ -MSTN载体用KpnI酶切线性化，转化入酵母JMYl，由于酵母中NTS2-5’3’的同源臂的存在，使载体与酵母菌株发生高效率同源重组，转化后在含有G418的固体培养板上长出了单克隆，挑取其中几个单克隆提取基因组，用MSTN引物PCR扩增整合载体中的序列，鉴定整合是否成功，从而得到阳性克隆，命名为JMYll ；
[0034]进一步，步骤四中将MSTN载体整合入酵母基因组中检验MSTN整合的PCR:①预变性:94°C 3m ；(2) 25Cycle，变性 94°C 30s ;退火 55°C 30s ;延伸 72°C lm30s ;③延伸 72°C 5m ；④ 4。。forever ο[0035]进一步，步骤五抗性基因KanMX4的敲除的具体步骤为:
[0036]将含Cre酶载体的酵母菌株JMB943转入JMYll中，由于Cre-LoxP系统的作用，将KanMX4抗性基因敲除，将转化后菌液涂在缺Ure的培养板上，JMB943含Ure，可在缺Ure的培养板上生长，挑单克隆到含G418抗性的培养基里，在缺Ure培养板上生长，且在G418抗性培养基中不生长证明KanMX4载体已敲除；
[0037]用PCR的方法进行验证，挑取4个单克隆提基因组，PCR扩增KanMX4基因表达盒片段，若未敲除PCR产物为1826bp，若敲除了 PCR产物为346bp，结果显示得到报告基因KanMX4敲除的MSTN整合菌株。命名为JMB12 ;
[0038]提取JMY12酵母总蛋白，用Western Blot检测MSTN在酵母JMY12中的表达。
[0039]本发明提供的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法构建了不含有筛选基因的Myostatin(MSTN)整合型酵母菌株，该菌种可以在富集型培养基中生产，安全可靠成本低，不会造成目的基因丢失，适合于大规模生产重组酵母。本发明首先构建了含有KanMX4抗性筛选的pBlue-kan-NTS2_5’ 3’ -MSTN载体，将MSTN直接整合入酵母基因组中，再采用Cre / LoxP系统删除抗性报告基因，从而得到安全性高的MSTN整合型酵母表达菌株。
[0040]采用本发明大规模生产的酵母菌株直接饲喂动物，可在动物体内产生高水平MSTN特异性抗体，解除其抑制作用，促进肌肉生长，这对动物生产具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】 [0041]图1是本发明提供的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法流程图。
[0042]图2是本发明实施例提供的KanMX4基因表达盒的扩增示意图，图中KanMX4长度为 1438bp。
[0043]图3是本发明实施例提供的质粒pBlue-KanMX4的酶切鉴定结果示意图。
[0044]图4是本发明实施例提供的3NST2-5’与NST2-3’的酶切鉴定结果示意图；图中I为 2000Plus Maker, 2, 3, 4 % pBlue-Kan-NTS2_5’ 3，d 的酶切鉴定结果；图中 2 为 KpnI 与XhoI酶切NTS2-5’端同源臂与pBlue-Kan-NTS2-3’载体骨架的结果；图中3为Notl，SacII双酶切pBlue-Kan-NTS2-5’ 3’后，NTS2-3，端同源臂与pBlue-Kan-NTS2_5’的鉴定结果；图中4为KpnI与SacII双酶切载体，得到pBlue骨架与Kan4_NTS2_5’ 3’的酶切鉴定结果。
[0045]图5是本发明实施例提供的MSTN基因、Cyc3终止子和ADHl启动子的扩增示意图；图中1:MSTN基因；2:Cyc3终止子；ADH1启动子。
[0046]图6是本发明实施例提供的MSTN基因表达盒的overlap PCR扩增结果示意图。
[0047]图7是本发明实施例提供的pBlue-Kan-NTS2_5’ 3’ -MSTN载体构建图谱.[0048]图8是本发明实施例提供的MSTN整合载体pBlue-kan-NTS2_5’ 3’ -MSTN的酶切鉴定图谱.[0049]图9是本发明实施例提供的pBlue-kan-NTS2_5’3’ -MSTN转入酵母得到MSTN阳性菌株JMYl I，图中I，7，8PCR检测MSTN片段证实转化成功。
[0050]图10是本发明实施例提供的PCR鉴定KanMX4基因表达盒的删除示意图，图中#1、#2、#3、#4为鉴定KanMX4敲除的酵母菌株，片段大小为346bp。Control为阳性对照组，是KanMX4未敲除的菌株，片段大小为1826bp。[0051]图11是本发明实施例提供的Westren Blot鉴定JMY12酵母菌株与原核菌株中MSTN的表达，图中:(A)两年前Western Blot检测，⑶为两年后Wetem Blot检测，证实了JMY12酵母菌株是可以长期保存稳定表达的。Ctl (-)为酵母阴性对照，Ctl (+)为MSTN原核表达载体，JMY12为敲除抗性基因的MSTM安全表达载体。
【具体实施方式】
[0052]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0053]如图1所示，本发明提供的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法包括以下步骤:
[0054]SlOl:KanMX4基因片段的扩增和pBlue_KanMX4载体的构建；
[0055]S102:酵母基因同源臂的插入；
[0056]S103:pBlue-kan-NTS2-5’ 3’ -MSTN 整合载体的构建；
[0057]S104:将MSTN载体整合入酵母基因组；
[0058]S105:抗性基因KanMX4的敲除。
[0059]作为本发明实施例的一优化方案，步骤一 KanMX4基因片段的扩增和pBlue-KanMX4载体的 构建具体步骤为:
[0060]设计引物LoxP-Kan F，LoxP-Kan R在提取到的酵母基因组中扩增KanMX4基因片段；
[0061]在引物两段添加LoxP序列和EcoRI，BamHI两个酶切位点，把KanMX4基因片段在酵母基因组中扩增出来，PCR程序:①预变性:94°C 3m 20Cycle，变性94°C Im ;退火45°C 30s ;延伸 72°C 2m ;③延伸 72°C 5m 4°C forever ；
[0062]PCR后进行溶液回收，用EcoRI和BamHI进行双酶切，在I %琼脂糖凝胶电泳上跑胶，胶回收酶切产物获得较纯的片段，用同样的酶双酶切pBluescript II SK+，再将两个片段在16 °C过夜连接；
[0063]将获得的连接产物在大肠杆菌中转化，转化成功后挑选其中的单克隆提取细菌质粒，首先用BamHI和EcoRI双酶切，跑I %的琼脂凝胶电泳确定酶切片段的长度，初步判断是否为阳性质粒，并测序鉴定质粒是否成功转化。
[0064]作为本发明实施例的一优化方案，步骤二通过酵母基因组同源臂的插入具体步骤为:
[0065]在酵母基因组的non-transcript1nal space2即NST2片段中设计NST2-5’端和NST2-3’端两个同源臂的四个引物；
[0066]在NTS2-5’引物中插入XhoI和KpnI两个限制性内切酶的酶切位点；
[0067]在NTS2-3’引物中插入NotI,和SacII两个限制性内切酶的酶切位点；
[0068]将NTS2-5’ R和NTS2-5’ F两条引物加入PCR缓冲液中，94°C室温下冷却5min，直接得到了同源臂NTS2-5’，用XhoI和KpnI分别双酶切NTS2-5’同源臂和pBlue-kan，再分别胶回收两部分进行连接，连接产物转化到大肠杆菌中，转化成功后，挑选其中的单克隆提取细菌质粒PCR鉴定，测序进一步确定，用相同的方法将NTS2-3’同源臂插入进来，最终得到 pBlue-kan_NTS5’ 3’ 载体。
[0069]作为本发明实施例的一优化方案，步骤三pBlue-kan-NTS2_5’ 3’ -MSTN整合载体的构建的具体步骤为:
[0070]从JMB667中扩增出ADHl启动子和Cyc3终止子，从pET32a_MSTN中扩增出MSTN基因;
[0071]将三部分分别胶回收纯化，设计引物用overlap PCR的方法连接ADHl启动子，Cyc3终止子和MSTN基因，组装成2890bp的MSTN基因片段；
[0072]PCR后进行胶回收，再用Xho I和EcoR I进行双酶切，用同样的酶双酶切pBlue-kan-NTS5’ 3 ’载体，再进行两部分的连接，将连接产物转化到大肠杆菌中，得到MSTN整合载体 pBlue-kan-NTS2-5’ 3’ -MSTN ；
[0073]挑取转化的单克隆提取质粒，用酶切法初步鉴定，并进行测序。
[0074]作为本发明实施例的一优化方案，步骤三pBlue-kan-NTS2_5’ 3’ -MSTN整合载体的构建中在做Overlap PCR时，首先扩增MSTN和Cyc_3两部分；
[0075]连接ADH1、MSTN、Cyc_3三部分，首先要做个Pool ；
[0076]PCR程序:①预变性:94 °C 3m ;②8Cycle变性94 °C Im ;退火45 V 30s ；延伸72 °C 2m ;③延伸 72°C 5m 4°C forever ；
[0077]PCR程序完成后再加入引物ADHl和Cyc_3各Iul，继续程序:①预变性:94°C 3m ；
②20Cycle，变性 94。。Im ;退火 45°C 30s ;延伸 72°C 3m ;③延伸 72°C 5m ；@ 4°C forever?
[0078]作为本发明实施例的一优化方案，步骤四将MSTN载体整合入酵母基因组的具体步骤为:
[0079]将pBlue-kan-NTS2_5’ 3’ -MSTN载体用KpnI酶切线性化，转化入酵母JMYl，由于酵母中NTS2-5’3’的同源臂的存在，使载体与酵母菌株发生高效率同源重组，转化后在含有G418的固体培养板上长出了单克隆，挑取其中几个单克隆提取基因组，用MSTN引物PCR扩增整合载体中的序列，鉴定整合是否成功，从而得到阳性克隆，命名为JMYll ；
[0080]作为本发明实施例的一优化方案，步骤四中将MSTN载体整合入酵母基因组中检验MSTN整合的PCR:①预变性:94°C 3m ;②25Cycle，变性94°C 30s ;退火55°C 30s ;延伸72°C lm30s ;③延伸 72°C 5m 4°C forever?
[0081]作为本发明实施例的一优化方案，步骤五抗性基因KanMX4的敲除的具体步骤为:
[0082]将含Cre酶载体的酵母菌株JMB943转入JMYll中，由于Cre-LoxP系统的作用，将KanMX4抗性基因敲除，将转化后菌液涂在缺Ure的培养板上，JMB943含Ure，可在缺Ure的培养板上生长，挑单克隆到含G418抗性的培养基里，在缺Ure培养板上生长，且在G418抗性培养基中不生长证明KanMX4载体已敲除；
[0083]进一步用PCR的方法进行验证，挑取4个单克隆提基因组，PCR扩增KanMX4基因表达盒片段，若未敲除PCR产物为1826bp，若敲除了 PCR产物为346bp，结果显示得到报告基因KanMX4敲除的MSTN整合菌株。命名为JMB12 ;
[0084]提取JMY12酵母总蛋白，用Western Blot检测MSTN在酵母JMY12中的表达。
[0085]为使本发明的技术方案便于理解，以下结合【具体实施方式】对本发明作进一步的说明。
[0086]本发明旨在将MSTN整合在酵母基因组中，构建可大规模生产的具有一定安全性的MSTN的酵母菌株。首先进行了 MSTN整合载体pBlue-kan-NTS2-5’ 3’ -MSTN的构建，将LoxP序列插入MSTN整合载体的报告基因KanMX4，再利用NTS2-5’ 3’同源臂的同源重组作用将整合载体整合到酵母菌株中，最后应用了 Cre / LoxP系统删除抗性基因KanMX4，获得可以应用于大规模生产的MSTN整合型酵母菌株。
[0087]1.KanMX4基因片段的扩增和pBlue_KanMX4载体的构建
[0088]首先，设计引物LoxP-Kan F，LoxP-Kan R在提取到的酵母基因组中扩增KanMX4基因片段。LoxP-Kan F，LoxP-Kan R引物设计如表1.1:
[0089]表1.lLoxP-KanMX4 引物序列
[0090]
【权利要求】
1.一种可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，其特征在于，该可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法包括以下步骤: 步骤一、KanMX4基因片段的扩增和pBlue_KanMX4载体的构建； 步骤二、酵母基因同源臂的插入； 步骤三、pBlue-kan-NTS2-5’ 3’ -MSTN整合载体的构建； 步骤四、将MSTN载体整合入酵母基因组； 步骤五、抗性基因KanMX4的敲除。
2.如权利要求1所述的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，其特征在于，步骤一 KanMX4基因片段的扩增和pBlue_KanMX4载体的构建具体步骤为: 设计引物LoxP-Kan F，LoxP-Kan R在提取到的酵母基因组中扩增KanMX4基因片段； 在引物两段添加LoxP序列和EcoRI，BamHI两个酶切位点，把KanMX4基因片段在酵母基因组中扩增出来，PCR程序:①预变性:94°C 3m通20Cycle，变性94°C Im ;退火45°C 30s ；延伸 72°C 2m ;③延伸 72°C 5m 4°C forever ； PCR后进行溶液回收，用EcoRI和BamHI进行双酶切，在I %琼脂糖凝胶电泳上跑胶，胶回收酶切产物获得较纯的片段，用同样的酶双酶切pBluescript II SK+，再将两个片段在16 °C过夜连接； 将获得的连接产物在大肠杆菌中转化，转化成功后挑选其中的单克隆提取细菌质粒，首先用BamHI和EcoRI双酶切，跑I %的琼脂凝胶电泳确定酶切片段的长度，初步判断是否为阳性质粒，并测序鉴定质粒是否成功转化。
3.如权利要求1所述的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，其特征在于，步骤二通过酵母基因组同源臂的插入具体步骤为: 在酵母基因组的non-transcript1nal space2即NST2片段中设计NST2-5’端和NST2-3’端两个同源臂的四个引物； 在NTS2-5’引物中插入XhoI和KpnI两个限制性内切酶的酶切位点； 在NTS2-3’引物中插入Notl，和SacII两个限制性内切酶的酶切位点； 将NTS2-5’ R和NTS2-5，F两条引物加入PCR缓冲液中，94°C室温下冷却5min，直接得到了同源臂NTS2-5’，用XhoI和KpnI分别双酶切NTS2-5’同源臂和pBlue-kan，再分别胶回收两部分进行连接，连接产物转化到大肠杆菌中，转化成功后，挑选其中的单克隆提取细菌质粒PCR鉴定，测序进一步确定，用相同的方法将NTS2-3’同源臂插入进来，最终得到pBlue-kan_NTS5，3，载体。
4.如权利要求1所述的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，其特征在于，步骤三pBlue-kan-NTS2-5’ 3’-MSTN整合载体的构建的具体步骤为: 从JMB667中扩增出ADHl启动子和Cyc3终止子，从pET32a_MSTN中扩增出MSTN基因；将三部分分别胶回收纯化，设计引物用overlap PCR的方法连接ADHl启动子，Cyc3终止子和MSTN基因，组装成2890bp的MSTN基因片段； PCR后进行胶回收，再用Xho I和EcoR I进行双酶切，用同样的酶双酶切pBlue-kan-NTS5’ 3’载体，再进行两部分的连接，将连接产物转化到大肠杆菌中，得到MSTN整合载体 pBlue-kan-NTS2-5’ 3’ -MSTN ； 挑取转化的单克隆提取质粒，用酶切法初步鉴定，并进行测序。
5.如权利要求4所述的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，其特征在于，步骤三pBlue-kan-NTS2-5’3’ -MSTN整合载体的构建中在做Overlap PCR时，首先扩增MSTN和Cyc-3两部分； 连接ADH1、MSTN、Cyc-3三部分，首先要做个Pool ； PCR 程序:①预变性:94°C 3m 8Cycle 变性 94°C Im ;退火 45°C 30s ;延伸 72°C 2m ；?延伸 72°C 5m 4°C forever ； PCR程序完成后再加入引物ADHl和Cyc-3各Iul，继续程序:①预变性:94 °C 3m ；② 20Cycle，变性 94°C Im ;退火 45°C 30s ;延伸 72°C 3m ;③延伸 72°C 5m 4°C forever?
6.如权利要求1所述的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，其特征在于，步骤四将MSTN载体整合入酵母基因组的具体步骤为: 将pBlue-kan-NTS2-5’3’ -MSTN载体用KpnI酶切线性化，转化入酵母JMYl，由于酵母中NTS2-5’ 3’的同源臂的存在，使载体与酵母菌株发生高效率同源重组，转化后在含有G418的固体培养板上长出了单克隆，挑取其中几个单克隆提取基因组，用MSTN引物PCR扩增整合载体中的序列，鉴定整合是否成功，从而得到阳性克隆，命名为JMY11。
7.如权利要求6所述的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，其特征在于，步骤四中将MSTN载体整合入酵母基因组中检验MSTN整合的PCR:①预变性:94 0C 3m 25Cycle，变性 94 °C 30s ;退火 55 °C 30s ;延伸 72 °C lm30s ;③延伸 72 °C 5m ；④ 4。。forever o
8.如权利要求1所述的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，其特征在于，步骤五抗性基因KanMX4的敲除的具体步骤为: 将含Cre酶载体的酵母菌株JMB943转入JMYlI中，由于Cre-LoxP系统的作用，将KanMX4抗性基因敲除，将转化后菌液涂在缺Ure的培养板上，JMB943含Ure，可在缺Ure的培养板上生长，挑单克隆到含G418抗性的培养基里，在缺Ure培养板上生长，且在G418抗性培养基中不生长证明KanMX4载体已敲除: 进一步用PCR的方法进行验证，挑取4个单克隆提基因组，PCR扩增KanMX4基因表达盒片段，若未敲除PCR产物为1826bp，若敲除了 PCR产物为346bp，结果显示得到报告基因KanMX4敲除的MSTN整合菌株。命名为JMB12 ; 提取JMY12酵母总蛋白，用Western Blot检测MSTN在酵母JMY12中的表达。
【文档编号】C12N1/19GK104031853SQ201310429660
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】张智英, 张志强, 辛颖, 安宁, 张涛, 白义春, 邵斯旻, 张建峰, 任充华, 李铎, 张龙, 闫强, 林娟, 徐华荣, 李欣憶, 刘中天, 梁明福 申请人:西北农林科技大学, 陕西省畜牧技术推广总站