豆蚜特异性ss-coi引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及豆蚜特异性SS-COI引物以及含有该引物的检测试剂盒，根据豆蚜特有的mtDNA序列，设计了一对豆蚜特异性SS-COI引物LFAcF和LFAcR（SEQ?ID?No.1和2），该对引物仅对豆蚜具有特异性扩增能力，扩增产物大小为193bp，质粒浓度检出限为3.99E+4，DNA浓度检出限为0.413ng/μL。本发明采用SS-COI?PCR技术，提高了检测准确性，节约了检测时间，适于基层推广应用。
【专利说明】豆蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及豆蚜特异性ss-coi引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002]豆姆Aphis craccivora Koch,别名花生姆、苜猜姆,属半翅目姆科,是豆科作物的重要害虫，具较强的迁飞和扩散能力。豆蚜危害寄主常群集于嫩茎、幼芽、顶端嫩叶、心叶、花器及荚果处吸取汁液。受害严重时，植株生长不良，叶片卷缩，影响开花结实。豆蚜还能大量排泄“蜜露”，引起植物煤污病，从而影响光合作用，导致植株结荚减少、千粒重下降。豆蚜在田间有多种捕食性天敌(如瓢虫、草蛉、蜘蛛等)，天敌的保护和利用是豆蚜防治的重要措施。如何对田间不同种类天敌的控制作用进行合理评估，进而选择出繁殖力高、捕食能力和寻找寄主能力强、控害作用明显的天敌资源，是进行天敌保护合理保护与利用的基础与核心。
[0003]Species-Specific-COI PCR检测技术是在mtDNA COI技术基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点，为准确评价天敌对猎物的捕食作用开辟了新途径。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供豆蚜特异性SS-COI引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法。
[0005]为了实现本发明目的，本发明根据豆蚜的线粒体DNA序列，设计一对豆蚜特异性SS-COI引物，其包括:
[0006]正向引物LFAcF: 5’ -CAAACAATATTGCTCATAATAAC-3 ’
[0007]反向引物LFAcR: 5，-AAAATTAATAATATAGCTGTAATTAGG-3，。
[0008]本发明还提供含有引物LFAcF和LFAcR的用于检测豆蚜的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0009]本发明还提供所述引物LFAcF和LFAcR，以及含有引物LFAcF和LFAcR的试剂盒在检测豆蚜中的应用。
[0010]本发明还提供一种豆蚜的特异性快速PCR检测方法，包括以下步骤:
[0011]I)提取样品DNA;
[0012]2)以步骤I)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物LFAcF和LFAcR进行PCR扩增反应；
[0013]3)分析PCR产物。[0014]对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现大小为193bp的DNA扩增条带(SEQ ID N0.3)，则判定样品为豆蚜。
[0015]本发明根据GenBank中公布的豆蚜COI (JX559638)的一段基因序列，设计一对特异性引物，该引物特异性强，只对豆蚜具有扩增能力，而对我国华北棉区内棉田中的主要昆虫无扩增产物。采用本发明提供的方法和引物检测豆蚜，准确性高，可扩增出193bp大小的片段。采用SS-COI PCR技术检测豆蚜，是对RAPD技术、RFLP技术和mtDNACOI检测技术的补充和改进，SS-COI PCR检测技术操作简单、快速、高效，一般可在5个小时内完成检测，且具有较高的灵敏度，质粒浓度检出限为3.99E+4，DNA浓度检出限为0.413ng/ μ L。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明实施例1中豆蚜特异性引物LFAcF/LFAcR的PCR检测结果；其中，M:DNA分子量标准2000bp ladder ; 1-114为表1中序号所对应昆虫的扩增结果，-为阴性对照。
[0017]图2为本发明实施例2中豆蚜特异性引物LFAcF/LFAcR的DNA浓度梯度检测结果；其中，M =DNA分子量标准5000bp ladder ;1_8为模板DNA浓度413.6ng/ μ L依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。
[0018]图3为本发明实施例2中豆蚜特异性引物LFAcF/LFAcR的质粒浓度梯度检测结果；其中，M =DNA分子量标准5000bp ladder ;1_11为模板质粒浓度3.99E+11依次10倍稀释浓度梯度；-为阴性对照。
【具体实施方式】
[0019]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件 ，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0020]实施例1弓丨物LFAcF/LFAcR对豆蚜的扩增效果
[0021]I)豆蚜基因组的制备
[0022]将单头姆虫放入1.5ml离心管中将其磨碎,用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(天根生物有限公司，北京)提取单头蚜虫基因组。将DNA溶液储于_20°C备用，进行PCR扩增时吸取I μ L溶液作为DNA模板。
[0023](2)合成检测豆蚜的特异性SS-COI引物
[0024]特异性SS-COI引物序列如下:
[0025]LFAcF:5’-CAAACAATATTGCTCATAATAAC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0026]LFAcR:5’-AAAATTAATAATATAGCTGTAATTAGG-3’ (SEQ ID N0.2)
[0027]2) PCR 扩增
[0028]反应体系为20 μ L，包括:10 X EasyTaq 缓冲液 2.0 μ L、dNTP (2.5mM) 0.4 μ L、EasyTaq DNA 聚合酶(5U/μ L) 0.2 μ L、正、反向引物(10 μ M)各 0.4 μ L、模板 DNAl.0 μ L、ddH2015.6μ L0
[0029]3) PCR扩增程序
[0030]94°C预变性 4min ；94°C 30sec,54°C 30sec,72°C 30sec,45 个循环；最后 72°C延伸Isec。
[0031]4) PCR产物鉴定
[0032]取6 μ L PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后，于凝胶成像系统中，根据扩增产物的大小判定。
[0033]5)结果
[0034]利用引物LFAcF/LFAcR，以豆蚜DNA为模板，以豆蚜同域的59种其他昆虫(见表1)为对照进行Species-Specific-COI PCR扩增，结果如图1所示，1、2泳道对应的豆蚜扩增出了 193bp的目的条带,说明根据豆姆线粒体DNA设计的Species-Specific-COI PCR扩增引物的特异性强。回收上述193bp的目的条带，进行测序，其序列如SEQ ID N0.3所示。
[0035]表1引物特异性检测中所涉及的昆虫种类
【权利要求】
1.豆蚜特异性SS-COI引物，其特征在于，其包括: 正向引物 LFAcF:5’ -CAAACAATATTGCTCATAATAAC-3’ 反向引物 LFAcR:5’ -AAAATTAATAATATAGCTGTAATTAGG-3’。
2.含有权利要求1所述引物的用于检测豆蚜的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.权利要求1所述引物或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测豆蚜中的应用。
6.豆蚜的特异性PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取样品DNA； 2)以步骤I)提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物LFAcF和LFAcR进行PCR扩增反应； 3)分析PCR产物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μ I计为:
模板 DNA1.Ομ?
2,5mM dNTPs0,4μΙ
ΙΟμΜ 引物 LFAcF0.4μΙ
ΙΟμΜ 引物 LFAcR0.4μ1
5υ/μ1 Easy Taq DNA聚合酶0.2μΙ
10 χ Easy 缓冲液2.0μΙddH20补足至 20μΙ。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为:94°C4分钟；94°C30秒，54°C 30秒，72 °C 30秒，共45个循环；72°C I秒。
【文档编号】C12Q1/68GK103468677SQ201310429628
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】王倩, 杨帆, 陆宴辉, 杨益众 申请人:中国农业科学院植物保护研究所