靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法及其应用，本发明通过构建的TALEN质粒、小鼠同源重组模板质粒和大鼠同源重组模板质粒，并将该相应的质粒分别转入小鼠或大鼠细胞中，能获得的稳定细胞株，用于表达各种外源基因。获得的稳定细胞株可以稳定传代，遗传背景清晰，准确的表现外源基因的生物学功能。
【专利说明】靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种整合外源DNA序列的方法和应用，特别是涉及一种靶向整合外源DNA序列到大鼠或小鼠Rosa26位点的方法及其应用 。
【背景技术】
[0002]TALEN (Transcription Activator-like Effector Nuclease)技术是一种薪新的分子生物学工具。利用TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，再通过添加内切酶结构域，TALEN蛋白可以革巴向切割基因组DNA【Cermak T, Doyle EL, Christian M, etal., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-basedconstructs forDNA targeting.Nucleic Acids Res.2011.39(12):e82.】。在同源模板存在的情况下(Donor质粒)，细胞会发生同源重组，从而高效精确地对基因组进行编辑【Zu Y, Tong X，Wang Z, et al.TALEN-mediated precise genome modification byhomologous recombination in zebrafish.Nat Methods.2013.10(4):329-31.】。TALEN技术可以广泛的应用于基因组编辑的各个方面:细胞水平的基因敲除，定点点突变，结构域缺失，定点整合等等，在疾病治疗领域具有广泛的应用前景【Sun N, Zhao H.Transcriptionactivator-like effector nucleases(TALENs):a highly efficient and versatile toolfor genome editing.Biotechnol Bioeng.2013.110(7):1811-21.】。
[0003]目前TALEN技术主要的缺陷是效率相对较低，一般在5%_20%，无法直接获取100%编辑的细胞，只能通过挑选阳性的单克隆细胞，扩增成为稳定株。
[0004]另外，当前在大鼠和小鼠细胞中构建定点整合稳定株还是基本采用如下的传统稳定株筛选方式:
[0005]I)线性化质粒筛选单克隆稳定株
[0006]2)慢病毒感染细胞筛选混合稳定株
[0007]这两种常用的方法都有严重的缺陷:质粒筛选稳定株的周期长，效率低，整合位点不确定，需要一直使用抗生素维持，容易导致非正常的细胞表型；慢病毒筛选稳定株周期较短，但是整合位点不确定且集中与一些高表达的热点区域，需要一直使用抗生素维持，同时慢病毒载体携带的病毒基因对细胞正常生理功能影响巨大。这些缺点使这两种方式筛选到的稳定细胞株不能有效的代表外源整合基因的生物学功能，造成一些实验上的假象，使实验结论没有说服力。
【发明内容】
[0008]本发明要解决的技术问题是提供一种靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法及其应用。本发明利用TALEN技术解决了上述传统方法的缺陷。同时本发明还实现了使用同一对TALEN质粒同时对小鼠和大鼠细胞Rosa26位点实现切割，配合各自的同源重组模板，实现对小鼠和大鼠细胞Rosa26位点基因定点整合任意外源DNA序列。
[0009]为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供一种用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN识别Rosa26位点，该TALEN识别Rosa26位点的上游识别序列如SEQID N0.1所示，下游识别序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]其中，SEQ ID N0.1-2是一对同时存在于大鼠和小鼠Rosa26保守位点的序列。
[0011]本发明的第二方面，提供一种一对用于识别上述位点的TALEN质粒，该一对TALEN质粒是上游TALEN质粒和下游TALEN质粒，其中，上游TALEN质粒含有SEQ ID N0.3所示的碱基序列，下游TALEN质粒含有SEQ ID N0.4所示的碱基序列。
[0012]所述上游TALEN质粒优选为含有SEQ ID N0.3所示的碱基序列的HY-TALEN-Rosa26-U质粒(表达载体)，下游TALEN质粒优选为含有SEQ ID N0.4所示的碱基序列的HY-TALEN-Rosa26_D质粒(表达载体)。
[0013]本发明的第三方面，提供一种用于靶向整合外源DNA序列到小鼠的TALEN识别Rosa26位点的小鼠同源重组模板质粒,该质粒含有SEQ ID N0.5所示的碱基序列。
[0014]所述小鼠同源重组模板质粒，优选为含有SEQ ID N0.5所示的碱基序列的HY-HR-mRosa26质粒(HY-HR同源重组载体)。
[0015]本发明的第四方面，提供一种用于靶向整合外源DNA序列到大鼠的TALEN识别Rosa26位点的大鼠同源重组模板质粒,该质粒含有SEQ ID N0.6所示的碱基序列。
[0016]所述大鼠同源重组模板质粒，优选为含有SEQ ID N0.6所示的碱基序列的HY-HR-rRosa26质粒(HY-HR同源重组载体)。
[0017]本发明的第五方面，提供一种定点整合稳定细胞株构建方法，该细胞株构建方法使用一对上述的TALEN质粒和小鼠同源重组模板质粒，或使用一对上述的TALEN质粒和大鼠同源重组模板质粒。
[0018]本发明的第六方面，提供一种用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN识别Rosa26位点的试剂盒，包括:上述的TALEN质粒、小鼠同源重组模板质粒和大鼠同源重组模板质粒。
[0019]本发明的第七方面，提供一种用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN识别Rosa26位点的试剂盒在药物筛选和动物模型制备中的应用，如利用上述的TALEN质粒、小鼠同源重组模板质粒和大鼠同源重组模板质粒等进行药物筛选和动物模型的制备。
[0020]通过本发明构建的质粒(TALEN质粒、小鼠同源重组模板质粒和大鼠同源重组模板质粒)，并将该相应的质粒分别转入小鼠或大鼠细胞中，能获得的稳定细胞株，而且该细胞株具有以下有益效果:
[0021]I)遗传背景清晰，定点整合到Rosa26位点；
[0022]2)外源表达稳定，不受到细胞其它基因的干扰；
[0023]3)对细胞本身基因的表达无影响；
[0024]4)无需抗生素筛选培养；
[0025]5)稳定细胞株筛选成功率高；
[0026]6)筛选周期缩短。
[0027]利用本发明可以高效快速精确地构建大鼠和小鼠的稳定细胞株，用于表达各种外源基因。获得的稳定细胞株可以稳定传代，遗传背景清晰，准确的表现外源基因的生物学功倉泛。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明:
[0029]图1是大鼠和小鼠Rosa26位点的序列图；
[0030]图2是HY-TALEN表达载体的示意图；
[0031]图3是HY-HR同源重组模板载体的示意图；
[0032]图4是小鼠B16F0细胞Rosa26定点整合稳定株的荧光图；其中，a为小鼠B16F0细胞荧光显微镜明场照片，b为小鼠B16F0细胞荧光显微镜照片；
[0033]图5是小鼠NIH-3T3细胞Rosa26定点整合稳定株的荧光图；其中，a为小鼠NIH-3T3细胞荧光显微镜明场照片，b为小鼠NIH-3T3细胞荧光显微镜照片；
[0034]图6是大鼠C6细胞Rosa26定点整合稳定株的荧光图；其中，a为小鼠C6细胞荧光显微镜明场照片，b为小鼠C6细胞荧光显微镜照片；
[0035]图7是大鼠208F细胞Rosa26定点整合稳定株的荧光图；其中，a为小鼠208F细胞荧光显微镜明场照片，b为小鼠208F细胞荧光显微镜照片；
[0036]图8是小鼠B16F0细胞Rosa26定点整合稳定株PCR鉴定电泳图；
[0037]图9是大鼠C6细胞Rosa26定点整合稳定株PCR鉴定电泳图。
【具体实施方式】
[0038]以下涉及的化学试剂和生物制品，如未特别说明都为商业化产品。另外，其他未注明的实验操作按照常规分子生物学操作方法进行。
[0039]实施例1
[0040]一、大鼠和小鼠的TALEN识别Rosa26位点
[0041 ] 经研究发现，一个能用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN识别Rosa26位点，该TALEN识别Rosa26位点的上游、下游识别序列分别如下所示:
[0042]上游识别序列:5’-agccaataatcaaatt-3’(如 SEQ ID N0.1 所不)
[0043]下游识别序列:5’-agttccttggtaacatt-3’ (如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0044]其中，详细信息可如图1所示。
[0045]二、识别上述位点的一对TALEN质粒的构建
[0046]1、TALEN识别Rosa26位点的上游和下游TALEN序列合成及酶切
[0047]化学合成以下的上游和下游TALEN序列(⑶S编码区)，这两个序列的两端带BsmBI位点。对于合成后的序列，使用BsmB I酶进行酶切，胶回收2.9kb片段，分别得到片段一和片段二。
[0048]上游TALEN 序列(如 SEQ ID N0.3 所示):
[0049]5， -ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTATGGTGGACTTGAGGACACTCGGTTATTCGCAACAGCAACAGGAGAAAATCAAGCCTAAGGTCAGGAGCACCGTCGCGCAACACCACGAGGCGCTTGTGGGGCATGGCTTCACTCATGCGCATATTGTCGCGCTTTCACAGCACCCTGCGGCGCTTGGGACGGTGGCTGTCAAATACCAAGATATGATTGCGGCCCTGCCCGAAGCCACGCACGAGGCAATTGTAGGGGTCGGTAAACAGTGGTCGGGAGCGCGAGC
【权利要求】
1.一种用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN识别Rosa26位点，其特征在于:所述TALEN识别Rosa26位点的上游识别序列如SEQ ID N0.1所示，下游识别序列如SEQ ID N0.2 所示。
2.一对用于识别如权利要求1所述的位点的TALEN质粒，其特征在于:所述一对TALEN质粒是上游TALEN质粒和下游TALEN质粒，其中，上游TALEN质粒含有SEQ ID N0.3所示的碱基序列，下游TALEN质粒含有SEQ ID N0.4所示的碱基序列。
3.如权利要求2所述的TALEN质粒，其特征在于:所述上游TALEN质粒为含有SEQIDN0.3所示的碱基序列的HY-TALEN-Rosa26-U质粒，下游TALEN质粒为含有SEQ ID N0.4所不的喊基序列的HY-TALEN-Rosa26-D质粒。
4.一种用于靶向整合外源DNA序列到小鼠的TALEN识别Rosa26位点的小鼠同源重组模板质粒，其特征在于:所述质粒含有SEQ ID N0.5所示的碱基序列。
5.如权利要求4所述的质粒，其特征在于:所述质粒为含有SEQID N0.5所示的碱基序列的HY_HR-mRosa26质粒。
6.一种用于靶向整合外源DNA序列到大鼠的TALEN识别Rosa26位点的大鼠同源重组模板质粒，其特征在于 :所述质粒含有SEQ ID N0.6所示的碱基序列。
7.如权利要求6所述的质粒，其特征在于:所述质粒为含有SEQID N0.6所示的碱基序列的HY_HR-rRosa26质粒。
8.一种定点整合细胞株构建方法，其特征在于:所述细胞株构建方法使用含有一对如权利要求2所述的TALEN质粒和如权利要求4所述的小鼠同源重组模板质粒；或使用含有一对如权利要求2所述的TALEN质粒和如权利要求6所述的大鼠同源重组模板质粒。
9.一种用于靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠的TALEN识别Rosa26位点的试剂盒，其特征在于，包括:如权利要求2所述的TALEN质粒、如权利要求4所述的小鼠同源重组模板质粒和如权利要求6所述的大鼠同源重组模板质粒。
10.一种如权利要求9所述的试剂盒的应用，其特征在于:所述试剂盒在药物筛选和动物模型制备中的应用。
【文档编号】C12N5/10GK103540587SQ201310455151
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】杨兴林, 陈国泽, 彭娟, 潘讴东, 王富杰, 夏清梅, 殷珊 申请人:和元生物技术(上海)有限公司