一种适合于二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种适合于二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因及其应用，通过生物信息学分析和分子生物学实验验证，在二穗短柄草中寻找到了作为转基因二穗短柄草定性、定量PCR检测及拷贝数分析的内标准基因为BDFIM基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示。该内标准基因可用于定性、定量检测转基因二穗短柄草的外源基因，及用于分析外源基因在转基因二穗短柄草种的拷贝数。
【专利说明】—种适合于二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种适合转基因二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因及其应用。
【背景技术】
[0002]所谓的内标准基因，是某种植物中具有种间特异性、种内非特异性、低拷贝数特征的一类基因。种间特异性指的是选定的基因对于此物种是特异的，而在其他物种中具有很低的同源性；种内非特异性指的是内标准基因在同一物种的不同栽培种中具有很高的同源性和相似性。例如，在植物转基因产品的定量检测中，内标准基因常被用来作为定量检测的内对照，要求内标准基因在不同栽培种中具有种内特异性的特点。在对转基因产品进行定量检测中，由于定量检测的外源基因一般是低拷贝的，因此要求内标准基因具有低拷贝数的特点，一般内标准基因为I~3个拷贝，最理想的情况是I个拷贝。
[0003]在植物转基因及其加工产品的检测中，内标准基因的首要作用是确定检测样品的物种来源。在转基因检测中，如果待检测的样品是植物原料，那产品的植物来源是可以很容易从外观知道。但是对于植物加工产品，如面粉、食品、植物油等产品，是很难从外观上分清植物材料的来源。这时就需要内标准基因来对植物产品的来源进行鉴定。内标准基因是物种特异性的，可以用来将这一物种与其他的物种以至近源种区别开来。因此通过建立内标准基因的PCR检测系统可以准确的判断检测样品中的植物成分来源，为进一步分析奠定基础。
[0004]植物内标准基因可以对核酸提取的效果进行评价。在转基因产品检测过程中，核酸提取的质量对于PCR结果有非常大的影响。由于植物材料之间有很大的差异，加工程度也不尽相同，因此核酸提`取方法也应根据不同的需要进行改进。在对样品提取的核酸进行PCR分析之前，有必要对DNA提取的效果进行充分合理的评价，以保证PCR分析的准确性。对于DNA质量的评定可以通过分光光度计法、琼脂糖凝胶电泳检测和荧光测定法进行。但是这些方法只能对所抽提的核酸进行数量或质量上的粗略估计，并不能判断抽提的DNA溶液中是否含有PCR反应的抑止因子。设立内标准基因作为实验的一个对照是解决这一问题的有效方法。作为对照的内标准基因PCR体系的正常工作与否，可以指示抽提的样品DNA能否用于进行PCR检测分析。因此，内标准基因是排除假阴性结果的有效手段。
[0005]内标准基因在植物转基因产品定量PCR检测中起到内参照的作用。转基因植物及其产品的定量PCR检测可以分为两种方法，即绝对定量法和相对定量法。简单来说，绝对定量法获的结果，是检测样品中的植物基因组或外源目的基因的绝对质量或拷贝数。相对定量法获的结果，是检测样品中外源目的基因在样品基因组DNA中的百分含量，结果用外源目的基因的拷贝数和植物基因组拷贝数的比值表示。在实际转基因检测和各国标签制度实施时，依据的标准是样品中的具体转基因相对含量，其必须通过相对定量法分析获得，而绝对定量在实际检测中则只能作为相对定量方法的一个过程。内标准基因用于植物基因组DNA的质量或者拷贝数的定量分析。而且内标准基因对于转基因的定量检测起着决定性的作用，没有合适的内标准基因是不可能对于转基因植物及其加工产品进行定量分析的，也不能确定转基因植物及其加工产品的准确的转基因含量。
[0006]转基因植物中外源基因拷贝数常影响目的基因的表达水平和遗传稳定性。因此，转基因研究中关键的一步就是检测外源基因的拷贝数，以筛选出拷贝数少或单拷贝的转基因植株供进一步的研究或育种利用。传统的转基因植株拷贝数检测主要是Southern杂交法，但该方法工作量大，需要的DNA材料较多，费时费力，并且经常要用到放射性同位素等具有潜在危险的药品。近年来，利用高通量、快速、灵敏的定量PCR方法检测转基因拷贝数逐渐受到科研人员的青睐。该方法根据Ct (cycle thresholds)值与起始模板数的对数值成反比线性关系的原理，制作标准曲线，获得Ct值与起始模板数的相关性方程，将样品的Ct值代入该方程就可获得目的基因的起始模板数，通过与内标准基因起始模板数的比较，就可知道基因组中该外源基因拷贝数。
[0007]内标准基因在植物转基因产品的定性和定量PCR检测及拷贝数检测中都有非常重要的作用，国际上对于植物内标准基因的研究也发展的非常快。到目前为止，文献报道的用于转基因检测中的内标准基因共有27个。其中大豆的Lectin基因是最早用于转基因抗草苷膦大豆GTS40-3-2检测的内标准基因，Lectin基因是大豆中特有的凝集素基因，通过对Lectin基因的检测，确定检测样品中是否含有大豆来源和判断检测样品DNA的质量，并在转基因大豆定量检测中作为定量内参照。玉米的Zein、zssIIb、hmgA、Invertase和Adhl基因都曾被用作内标准基因进行转基因玉米PCR检测，也有文章对玉米的这几个内标准基因进行了比较，发现上述几个基因都适合于转基因玉米的定性PCR检测，但是目前还未发现关于对二穗短柄草内标准基因的报道。
[0008]二穗短柄草是一种冷季型温带禾本科植物，在一些地方也常常作为一种牧草，该种植物由于具备株型矮小、自花授粉、种子不散落，生命周期短、生长条件简单等特点，近年来被作为一种新型的禾本科模式植物，因此转基因二穗短柄草技术也迅速发展。由于外源基因的拷贝数对外源基因的稳定表达影响较大，因此当拿到一个转基因植株时首先要对它的外源基因拷贝数进行分析，传统的拷贝数分析是利用Southern检测技术，该种方法费时费力，而且成本较高，如果要对大量的材料进行分析，工作量比较大。因此近年出现了利用定量PCR法对转基因植物基因外源基因拷贝数分析，该种技术可以弥补Southern检测技术的不足，尤其适合对大量材料进行高通量检测。除此之外二穗短柄草也可以作为一种牧草，因此转基因二穗短柄草也可能被加工成饲料，在对饲料进行转基因检测的时候也需要该种植物的内标准基因。但是目前国际上尚未有适合二穗短柄草外源基因检测和拷贝数分析的内标准基因的报道。因此，筛选适合二穗短柄草外源基因检测和拷贝数分析的内标准基因对促进二穗短柄草转基因研究意义十分重大。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题在于提供一种适合于二穗短柄草外源基因检测和拷贝数分析的内标准基因及其应用，克服目前尚未有适合二穗短柄草外源基因检测和拷贝数分析的内标准基因的现状。
[0010]本发明所述的适合于二穗短柄草外源基因检测和拷贝数分析的内标准基因，是二穗短柄草内标准基因BDFIM基因，其序列如SEQ ID NOl所示，并根据BDFIM基因序列设计定性、定量PCR检测的引物对BDFM-F/BDFM-R，设计Southern探针进行BDFM基因拷贝数分析，用于转基因二穗短柄草检测，其中，定性PCR检测和定量PCR检测的引物对相同，其序列如SEQ ID N02所示和SEQ ID N03所示，Southern探针序列如SEQ ID N04所示。
[0011]本发明的适合于二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因的应用，用于定性、定量检测转基因二穗短柄草的外源基因。
[0012]本发明的适合于二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因的应用，用于分析外源基因在转基因二穗短柄草中的拷贝数。
[0013]进一步，本发明设计了利用内标准BDFM基因测定二穗短柄草外源基因拷贝数的引物对HPT-F/HPT-R，其序列分别如SEQ ID N05所示和SEQ ID N06所示。
[0014]进一步，本发明所述内标准基因-BDFM基因具备种内一致性，即所有的二穗短柄草品种均含有BDFIM基因；所述BDFIM基因还具备种间特异性，即在其它物种里没有该基因；通过Southern杂交还证明了 BDFM基因在二倍体二穗短柄草基因组中的拷贝数是I。
[0015]本发明利用生物信息学手段对BDFM基因序列进行分析，获取了二穗短柄草的内源基因BDF頂序列，其序列如SEQ ID NOl所示。通过利用定性、定量PCR法分别对14种不同品种的二穗短柄草和16种其它物种进行检测，证明二穗短柄草BDFM基因种间特异性、种内非特异性的特点；通过利用Southern杂交方法对7种不同品种二穗短柄草进行BDFM基因拷贝数分析，结果表明3种不同品种二倍体二穗短柄草中BDFIM基因都是I个拷贝，在4种不同品种多倍体二穗短柄草中BDFIM基因是多拷贝。由于目前用于二穗短柄草转基因研究的受体材料以二倍体为主，所以，BDFIM基因符合内标准基因的低拷贝特点，通过这些实验结果表明=BDFIM基因符合内标准基因的特点。
[0016]本发明的通过对二穗短柄草的外源基因HPT基因进行拷贝数分析，进一步证明了该BDFIM基因可以作为二穗短柄草的内标准基因。
[0017]本发明的有益效果:
[0018]本发明通过生物信息学分析和分子生物学实验验证，在二穗短柄草中寻找到了作为转基因二穗短柄草外源基因检测和拷贝数分析的内标准基因-BDFM基因，该BDFM基因具有种内一致性、种间特异性、低拷贝数的特点，符合内标准基因的标准要求，适合于二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为BDFIM片段的核苷酸序列及定性、定量PCR引物位置。
[0020]图2为BDFM基因种内非特异性鉴定结果，其中，M为marker，I为BD21，2为BD21-3，3 为 BDl-1,4 为 BD29_1，5 为 BD18_1，6 为 BD23_1，7 为 BD26_1，8 为 BD13_1，9 为BD2-3,10 为 BD20-1,11 为 BD10-1，12 为 BD28,13 为 BD25-1，14 为 BD19-2，15 为阴性对照。
[0021]图3为BDF頂基因种间特异性鉴定结果，其中M为Marker，I为二穗短柄草，2为月季，3为棉花，4为黑麦草，5为康乃馨，6为麦冬，7为非洲菊，8为狗牙根，9为烟草，10为玉米，11为水稻，12为大 豆,13为小麦，14为大麦,15为拟南芥。
[0022]图4为BDFM基因种内非特异性定量鉴定结果。
[0023]图5为BDFM基因种间特异性定量鉴定结果。[0024]图6为Southern-Blot分析内标准基因的拷贝数，其中I为Bd21_3，2为Bd21，3
为 Bd29-1，4 为 Bdl9-2，5 为 Bd20_l，6 为 Bd28，7 为 BdlO-1，8 为空白对照。
[0025]图7为BdFM基因实时定量PCR扩增曲线。
[0026]图8为BdF頂基因标准曲线图。
[0027]图9为HPT基因实时定量PCR扩增曲线。
[0028]图10为HPT基因标准曲线图。
【具体实施方式】
[0029]以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本
发明的保护范围。应当说明的是，以下实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管
参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明
的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖
在本发明的权利要求范围中。
[0030]实施例1
[0031]1、实验材料
[0032]1.1植物材料
[0033]二穗短柄草:选用的二穗短柄草材料为二倍体植株和多倍体植株，详见表1。
[0034]表1实验中所选用的二穗短柄草材料
[0035]
【权利要求】
1.一种适合于二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因，其特征在于，所述内标准基因为BDF頂基因，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
2.根据权利要求1所述的适合于二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因，其特征在于，针对所述内标准基因序列设计定性、定量PCR检测的引物，设计Southern探针进行BDFIM基因拷贝数分析，用于转基因二穗短柄草检测，其中，定性、定量PCR检测的引物对相同，其序列如SEQ ID N02所示和SEQ ID N03所示，Southern探针序列如SEQ IDN04所示。
3.如权利要求1所述的适合于二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因的应用，其特征在于，用于定性、定量检测转基因二穗短柄草的外源基因。
4.如权利要求1所述的适合于二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因的应用，其特征在于，用于分析外源基因在转基因二穗短柄草中的拷贝数。
5.如权利要求4所述的适合于二穗短柄草外源基因检测及拷贝数分析的内标准基因的应用，其特征在于，分析外源基因在转基因二穗短柄草种的拷贝数所用的引物对为HPT-F/HPT-R，其序列如 SEQ` ID N05 所示和 SEQ ID N06 所示。
【文档编号】C12Q1/68GK103525922SQ201310454983
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】储昭庆, 朱宏 申请人:上海辰山植物园